Articolo metodologico

Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

DOI:

10.3791/56628

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2 marzo 2018

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1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Neurodevelopmental processi come proliferazione, migrazione e neuriti sono spesso perturbati in malattie neuropsichiatriche. Così, vi presentiamo protocolli per in modo rapido e riproducibile valutare questi processi neurodevelopmental in umano iPSC-derivati NPC. Questi protocolli permettono anche di valutare gli effetti di fattori di crescita e di terapeutica sullo sviluppo di NPC.

Abstract

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Lo sviluppo del cervello umano procede attraverso una serie di precisamente orchestrati processi, con fasi precedenti illustri di proliferazione, migrazione e neuriti; e fasi successive, caratterizzate dalla formazione di escrescenza e sinapsi dell'assone/dendrite. In disturbi dello sviluppo neurologico, spesso uno o più di questi processi sono interrotti, che conduce alle anomalie nella formazione del cervello e funzione. Con l'avvento della tecnologia (hiPSC) sulle cellule staminali umane pluripotenti indotte, i ricercatori hanno ora un'abbondante fornitura di cellule umane che possono essere differenziati in praticamente qualsiasi tipo di cellula, compresi i neuroni. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare lo sviluppo normale del cervello e la patogenesi della malattia. Un numero di protocolli di utilizzo hiPSCs per modello malattia neuropsichiatrica uso terminalmente differenziate neuroni o sistemi di coltura 3D uso definito organoids. Mentre questi metodi hanno dimostrato preziosi per lo studio della patogenesi della malattia umana, ci sono alcuni svantaggi. Differenziazione di hiPSCs in neuroni e generazione dei organoids sono processi lunghi e costosi che possono influenzare il numero di esperimenti e le variabili che possono essere valutate. Inoltre, mentre organoids e neuroni post-mitotici consentono lo studio dei processi di relazione con la malattia, tra cui dendrite escrescenza e sinaptogenesi, precludono lo studio dei processi precedenti come proliferazione e la migrazione. In disturbi dello sviluppo neurologico, come l'autismo, la prova genetica e post-mortem abbondante indica difetti nei processi di sviluppo precoce. Le cellule precursori neurali (NPC), una popolazione altamente proliferative delle cellule, possono essere un modello adatto in cui porre domande su processi ontogenetici e l'inizio di malattia. Estendiamo ora metodologie imparati dallo studio sviluppo nel topo e ratto culture corticali di NPC umani. L'uso dei PNG permette di indagare fenotipi correlati alla malattia e definire come le diverse variabili (ad es., fattori di crescita, farmaci) impatto inerente allo sviluppo processi tra cui la proliferazione, migrazione e differenziazione in pochi giorni. In definitiva, questo set di strumenti utilizzabile in modo riproducibile e ad alta produttività per identificare i meccanismi specifici di malattia e fenotipi in disturbi dello sviluppo neurologico.

Introduzione

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L'uso di organismi più semplici e modelli murini ha chiarito i meccanismi di sviluppo di base del cervello così come la patogenesi della malattia. Nonostante questi progressi, l'eziologia di molti disturbi neuropsichiatrici resta sfuggente, perché non tutti i risultati negli organismi più semplici sono direttamente rilevanti per aspetti complessi della malattia umana. Inoltre, la maggiore complessità del cervello umano spesso rende difficile lo sviluppo umano di modello e disturbi negli animali. Con l'evoluzione e il progresso della tecnologia (hiPSCs) le cellule staminali pluripotenti indotte umane, cellule somatiche può essere riprogrammate in cellule staminali e quindi differenziate in cellule di un neurone per studiare la malattia umana. Gli avanzamenti nelle tecnologie hiPSCs e "omiche" (genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica) promettono di rivoluzionare la comprensione dello sviluppo del cervello umano. Queste tecnologie rendono ora possibile un approccio di "precisione medicina" per la caratterizzazione della malattia neuropsichiatrica caso per caso.

La graffetta corrente nel campo di malattia-modellazione hiPSC è di differenziare le cellule in sottotipi neuronali specifici in un monostrato o a utilizzare un sistema di cultura 3D chiamato un organoid per ricapitolare gli aspetti del cervello sviluppo1,2, 3. Questi sistemi sono stati incredibilmente preziosi nello studio e scoprire aspetti unici di sviluppo umano e malattia4,5,6,7. Tuttavia, sia colture neuronali e organoids spesso richiedono ovunque da settimane a mesi nella cultura prima che siano pronti a studiare. La natura che richiede tempo di questi protocolli e la quantità di risorse necessarie per mantenere che questi sistemi di cultura spesso limitano il numero di esperimenti che possono essere effettuati e il numero di variabili (come fattori di crescita o farmaci) che possono essere testati. Inoltre, molti studi che utilizzano organoids e neuroni post-mitotici sono concentrati sui processi come la formazione di dendrite escrescenza o sinapsi, che si verificano più avanti nello sviluppo. Mentre questi processi sono stati implicati nella patologia di disturbi dello sviluppo come l'autismo e la schizofrenia, all'inizio dello sviluppo eventi che si verificano prima definitiva differenziazione neuronale sono anche importanti per la patogenesi della malattia8 ,9,10,11,12,13. Infatti, recenti studi genomici mostrano che il periodo di metà-fetale, che è composto di proliferazione, conseguenza del processo e la migrazione, è particolarmente importante nell'autismo patogenesi11,14. Pertanto, è importante studiare le staminali neurali e popolazioni di cellule progenitrici per comprendere meglio questi processi precedenti. Organoid sistemi, che sono lo sviluppo del cervello umano di riepilogo considerato al meglio a causa della loro natura 3D e la struttura organizzata, contengono un pool di cellule progenitrici che è stato utilizzato per studiare alcuni di questi eventi precedenti. Tuttavia, la popolazione di cellule progenitrici in organoids è spesso scarsa e più come cellule gliali radiali di neurali staminali o progenitrici cellule5,15. Così, sarebbe utile avere un metodo di throughput elevato per studiare le prime fasi del neurosviluppo in una popolazione delle cellule attivamente proliferative.

In laboratorio, abbiamo creato un protocollo che utilizza le cellule precursori neurali hiPSC-derivato (NPC), una popolazione mista di progenitrici cellule staminali neurali e che è altamente proliferative, di studiare i processi neurodevelopmental quali la proliferazione, migrazione cellulare, e estensione del processo iniziale (neurite). Queste analisi sono state sviluppate da tecniche utilizzate nel nostro laboratorio per decenni per studiare con successo neurosviluppo nei ratti e topi culture corticali16,17,18,19,20, 21,22,23. D'importanza, inoltre è stato indicato che fenotipi e segnali di regolazione definiti nei sistemi di coltura di ratti e topi sono altamente predittivi di meccanismi che sono attivi in vivo, che indica il valore di queste tecniche16, 17,18,19,24. Dopo la differenziazione iniziale di hiPSCs di NPC, questi metodi ci permettono di studiare processi vitali dello sviluppo in pochi giorni. Questi metodi hanno molti vantaggi: (1) richiedono poco sofisticate apparecchiature e sono facili da implementare, (2) numerose repliche sperimentali possono essere condotti in un breve periodo di tempo, permettendo per conferma veloce della riproducibilità dei risultati e (3) variabili di cultura come matrici di rivestimento, gli effetti dei fattori di crescita e l'attività dei farmaci possono essere testate in modo rapido ed economico. Inoltre, approfittiamo del ruolo ormai consolidato di fattori di crescita extracellulari come regolatori critici di diversi processi di sviluppo. I PNG sono stati esposti per selezionare i segnali dello sviluppo che direttamente stimolano eventi come proliferazione, neuriti e migrazione cellulare e hanno trovato che migliorano la capacità di identificare i difetti che non sono evidenti in condizioni di controllo19 , 25 , 26 , 27 , 28. allo stesso modo, la facilità di valutazione farmaci fornisce un potente viale per adottare tecniche di medicina di precisione per verificare l'efficacia dei vari interventi terapeutici. Così, questo protocollo facilita un throughput elevato, riproducibile e semplice metodologia per studiare lo sviluppo iniziale del cervello, patogenesi della malattia e gli effetti benefici potenziali di fattori di crescita e di droghe sui fenotipi neurodevelopmental.

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Protocollo

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1. armadio di sicurezza biologica manutenzione e procedure di sicurezza

  1. Procedure di sicurezza livello di biosicurezza 2 (BSL-2)
    1. Seguire le linee guida dell'istituzione lavorando con materiali BSL-2. Smaltire materiali BSL-2 secondo le pratiche dell'istituzione. Indicare le camere e le attrezzature che vengono utilizzati per BSL-2 materiali. Indossare tutti i dispositivi di protezione individuale (PPE), camice e guanti.
  2. Armadio di sicurezza biologica manutenzione
    1. Utilizzare un armadio di sicurezza biologica certificato per l'utilizzo di materiali di livello BSL-2.
    2. Accendere la luce UV nella biosicurezza armadietto per almeno 15 min e poi spruzzare le superfici con soluzione di candeggina al 10%. Consentire la soluzione di candeggina riposare per 15 minuti, strofinare il cabinet e accendere il flusso d'aria prima dell'uso.
  3. Trizio radioattivo [3H]-timidina (trizio) procedure di sicurezza
    Nota: Il trizio è una sorgente radioattiva di categoria 5, 'il più improbabile essere pericoloso' categoria. Seguire le linee guida dell'istituzione per lavorare con la radioattività. Alcune istituzioni possono richiedere certificazioni o permette di gestire il trizio.
    1. Ricevono l'addestramento da parte dell'istituzione su come gestire correttamente e smaltire il trizio. Smaltire i rifiuti radioattivi in recipienti corretta, in base ai criteri dell'istituzione. Lavorando con trizio, indossare PPE.

2. neurale induzione da iPSCs

Nota: Per rendere i PNG, una versione leggermente modificata di un protocollo che accompagna un kit disponibile in commercio induzione neurale è stata seguita. Il kit è composto da media Neurobasal (NB) e un 50 x supplemento di induzione neurale (NIS), che è usato per fare un 1 x medio di induzione neurale (NIM). NIS è utilizzato anche per rendere 100% medio di espansione (Vedi sezione 3.1). Un link al protocollo si trova nei materiali e attrezzature e riferimenti sezione43.

  1. Passaggio iPSCs quando diventano 70-80% confluenti.
  2. Piastra 300.000 iPSCs in 1 bene di un qualificato hESC extracellulare matrix-mimico gel (gel di ECM-mimico) rivestito 6 pozzetti contenenti 2 mL di medium privo di alimentatore iPSC con 5 μM di inibitore di roccia. Per istruzioni sui pozzi di rivestimento con ECM-mimico gel, vedere la sezione 3.2.
  3. Il giorno dopo, rimuovere l'iPSC medium + ROCK iPSCs inibitore e lavata una volta con 1x PBS. Aggiungere 2 mL di NIM i iPSCs.
    Nota: 50 mL di NIM è effettuata aggiungendo 1 mL di 50 x NIS e 250 µ l (50 unità/mL, 5 µ l/mL) di penicillina/streptomicina (P/S) a 49 mL di NB Media.
  4. Variazione media dell'induzione neurale ogni 2 giorni aspirando speso medio e sostituzione con 2 mL di NIM fino a cellule diventano confluenti (circa 4-5 giorni). Modifica supporto quotidiano, una volta che le cellule sono confluenti.
  5. Cellule di passaggio dopo 7 giorni in NIM e piastra in un gel di ECM-mimico rivestito 6 pozzetti contenenti 2 mL di 100% Media espansione e dell'inibitore di roccia di 5 μM. Le cellule sono considerate passaggio 0 (P0) NPC a questo punto. Vedere sezione 3.1 qui di seguito per istruzioni su come realizzare un supporto di espansione 100%.
  6. Cellule di passaggio utilizzando i metodi descritti nella sezione 3.4. Attendere che le cellule hanno raggiunto P2 e sono confluenti prima dissociare per macchiare per marcatori di NPC e placcatura per esperimenti (Figura 1).

3. terreni di coltura, verniciatura e manutenzione dei PNG

  1. Preparazione di terreni per la manutenzione di NPCs (100% espansione Media):
    1. Preparare 50 mL di Media espansione 100% combinando 24,5 mL di DMEM/F12 con 24,5 mL di NB
    2. Aggiungere 1 mL di 50 x NIS al DMEM/F12 + soluzione NB. Aggiungere 250 μL di soluzione di P/S ai media.
      N.B.: Può essere refrigerato (4 ° C) e utilizzato per fino a 2 settimane. Volumi più piccoli dei media possono essere effettuate regolando i volumi di DMEM / F12 + NB + NIS utilizzando gli stessi rapporti per quanto riguarda il volume di 50 mL.
  2. Preparazione del Gel di ECM-mimico di cultura piastre rivestite per manutenzione NPC
    1. Aliquotare ECM-mimico gel al volume necessario per rendere 6 mL di soluzione di lavoro. Calcolare il volume aliquota guardando il certificato di analisi foglio dal ECM-mimico fattore di diluizione del gel varia da lotto a lotto e lotto.
    2. Scongelare un'aliquota di gel ECM-mimico sul ghiaccio e si dissolvono in 6 mL di freddo DMEM/F12 media.
    3. Aggiungere 1 mL di soluzione di ECM-mimico gel/DMEM/F12 in ciascun pozzetto di una piastra ben 6. Incubare la piastra a 6 pozzetti con ECM-mimico-soluzione di gel per 30 min a 37 ° C.
    4. Aspirare la soluzione di ECM-mimico gel dopo 30 min di incubazione e sostituire con 100% espansione Media o refrigerare piastre (4 ° C, fino a 1 settimana) senza aspirare la soluzione di gel ECM-mimico.
  3. Manutenzione dei PNG
    1. Piastra NPC ad una densità di 1,5 milioni di cellule in un ECM-mimo ben contenente 2 mL di Media espansione 100% gel-rivestita.
    2. Incubare i PNG a 37 ° C in un ambiente umido con 5% CO2.
    3. Aggiungere 5 μM di inibitore di roccia ai media per NPC a P3 o inferiore, o per NPC scongelati, per prevenire la morte cellulare eccessiva. Modifica supporto dopo 24 h per rimuovere inibitore di roccia.
    4. Cellule di passaggio ogni 4-9 giorni, dipendendo dalla quando diventano confluenti. Le cellule sono considerate confluenti quando diventano un monostrato densamente coprendo l'intero fondo della superficie del piatto.
    5. Piastra NPC ad una densità di 1 a 1,5 milioni di cellule per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (vedere sezione 3.4). Rimuovere i supporti esauriti ogni 48 h e sostituire con 2 mL di Media espansione 100%.
  4. Sollevare, dissociare e a Pellet NPC per manutenzione e/o placcatura per condizioni sperimentali
    1. Aspirare le cellule medie, lavare una volta con 1x PBS. Aspirare la PBS e aggiungere 500 μL di soluzione di distacco di 1 x cella in 1 bene di confluenti NPC. Incubare per 10 min a 37 ° C.
    2. Aggiungere 500 μL di temperatura ambiente (TA) PBS e lavare bene usando una pipetta di P-1000 per garantire la rimozione delle cellule. Raccogliere le cellule + soluzione PBS in una provetta conica da 15 mL. Lavare la piastra nuovo con 1 mL di PBS e aggiungere liquido nella provetta.
    3. Selezione delle cellule verso il basso a 300 x g per 5 min a pellet.
    4. Rimuovere il supernatante dal pellet e risospendere le cellule in 1-5 mL di pre-riscaldato DMEM/F12 media. Diluire le cellule ad una densità di 1 a 4 milioni di cellule/mL di media. Quantificare le celle utilizzando un emocitometro.
    5. Piatto il numero di cellule, specifiche per manutenzione NPC (sezione 3.3) o il dosaggio individuale in corso (vedere le sezioni successive per maggiori dettagli).
    6. Regolare volume di sospensione cellulare con i media in modo che tra 15 e 100 μL di cellule sono utilizzati per ogni pozzetto. Questo volume di piccola placcatura assicura che non esiste una distribuzione anche delle cellule e fattori di crescita, droghe o substrati nel mezzo non sono diluiti.
    7. Incubare le cellule a 37 ° C. Cambiare supporto ogni 48 h per manutenzione NPC o vedere i dettagli specifici per singoli saggi.
  5. Preparazione di terreni per condizioni sperimentali (30% espansione Media)
    1. Diluire il Media di espansione 100% 70% (denominate 30% espansione) con l'aggiunta di 1:1 DMEM/F12 + NB soluzione per realizzare un supporto per condizioni sperimentali.
    2. Fare 20 mL di 30% espansione Media aggiungendo 6 mL di Media espansione 100% e diluire con 7 mL di NB e 7 mL di DMEM/F12 media. Aggiungere 5 µ l/mL di soluzione di P/S.
      Nota: Se il supporto di 100% contiene già P/S, quindi aggiungere 5 µ l/mL per combinato-DMEM / F12 + NB = (14 mL) x (5 µ l/mL) = 70 μL di P/S invece di 100 µ l.
    3. Aggiungere il rivestimento di substrati e fattori di crescita alle concentrazioni desiderate per il supporto di espansione del 30%.

4. valutazione di sintesi del DNA, entrata in fase S e numeri di cellulare dei PNG

  1. Preparazione per la sintesi del DNA, entrata in fase S e analisi di numero delle cellule
    1. Fare un 1 mg/mL di soluzione madre di poli-D-lisina (PDL) in dH2O e filtro sterilizzare. Diluire 01:10 in dH2O fare un 0,1 mg/mL soluzione PDL e aggiungere 300 μL in ogni pozzetto di una piastra ben 24 o 1 mL per un piatto di 35 mm. Incubare per 20 minuti a TA.
    2. Lavare i pozzetti PDL per 5 min con dH2dH aspirato O.2O per 3 volte e aggiungere 300 μL/pozzetto o 1 mL/piatto di laminina (5 μg/mL) diluito in 1X PBS. Coprire le piastre con parafilm e mantenere in una sterile, biosicurezza armadietto pernottamento presso RT (12-24 h).
    3. Preparare il supporto di espansione 30% (Vedi sezione 3.5) dopo 12-24 h. Aggiungi veicoli, fattori di crescita o farmaci di interesse alla concentrazione desiderata in volumi che sono meno del 10% della soluzione totale per evitare la diluizione NIS nel 30% medio di espansione.
    4. Lavare ogni bene della piastra 24-ben due volte con PBS 1X (5 minuti ciascuno). Aspirare 1X PBS e aggiungere 450 μL dei media (senza o con farmaci/fattori di crescita). Incubare la piastra a 37 ° C per almeno 15 min prima di cellule di placcatura.
    5. Per ogni esperimento, impostare 2-3 pozzi o piatti a condizione.
    6. Piastra NPC (Vedi sezione 3.4):
    7. Saggio di sintesi del DNA NPC: 100.000 cellule/pozzetto in un piatto ben 24
    8. Fase S Entry: piatto 500.000 cellule/35 mm
    9. Analisi di numero delle cellule: 50.000 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti
  2. Analisi di sintesi di precursori neurali delle cellule del DNA
    1. Piastra di 100.000 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e valutare in triplice copia/condizione.
    2. Aggiungere radioattivo, contenente tritio [3H]-timidina al terreno di coltura (1,5 μCi/mL) in ciascun pozzetto dopo 46 h nella cultura. Incubare le cellule a 37 ° C per 2 h.
      Nota: Quando si utilizza materiali radioattivi, ricevere formazione da vostra istituzione, seguire i protocolli di sicurezza radioattività e smaltire materiali radioattivi in contenitori di rifiuti in modo appropriato designati.
    3. Rimuovere e correttamente smaltire radioattivo media dopo 2 h. aggiungere 300 μL di pre-riscaldati 0,25% tripsina-EDTA (0,5 mM) ad ogni pozzetto e incubare per 20 min a 37 ° C.
    4. Accendere la mietitrice di cella (Vedi materiali e attrezzature sezione) e la pompa e assicurarsi che la pressione della pompa sia inferiore a 200 PSI. Posizionare la carta da filtro attraverso lo spazio nella mietitrice di cella e strappare l'angolo giusto per contrassegnare l'orientamento della carta.
    5. Inserire tubi di raccolta della mietitrice di cella in un cassetto vuoto "in bianco" e premere prelavaggio per inumidire la carta da filtro. Inserire tubi di raccolta in pozzetti ed eseguire (start).
    6. Al termine della mietitrice di cella di raccolta dei campioni, sollevare il morsetto e avanzamento carta da filtro di ripetere per tutti i set di esempio. Prelavaggio sempre in un piatto vuoto, "vuoto".
    7. Asciugare la carta da filtro sotto una sorgente di luce e impostare il corrispondente fiale in un vassoio. Punch out chads carta nei flaconi e aggiungere 2 mL di cocktail di scintillazione liquida per ogni flaconcino. Fiale di tappo ed etichetta.
    8. Incubare le fiale a scintillazione liquida cocktail per almeno 1 h prima di leggere i conteggi al minuto (CPM) su una macchina di scintillazione.
  3. Analisi voce NPC S-fase
    1. Vedere sezione 3.4 per la procedura a sollevare, dissociare, pellet e risospendere le cellule.
    2. Piastra di 500.000 cellule per ogni piatto in 35mm piatti preparati nella sezione 4.1, solo 1 piatto/condizione per questo passaggio.
    3. Agitare piatti avanti e indietro in tutte le direzioni per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule a 37 ° C per 46 h.
    4. Preparare tre piastre di 35 mm rivestite con PDL/laminina a condizione dopo 24 h. Ad esempio, se c'è un piatto di 35 mm di Media espansione 30% e un piatto di 35 mm di Media espansione 30% + FGF (10 ng/mL) poi cappotto 6 PDL/Laminin piastre per uso il giorno successivo.
    5. Aggiungere 2 µ l/mL di 5mm EdU a culture dopo 46 h. Incubare per 2 h.
    6. Dissociare e appallottolare le celle (Vedi sezione 3.4). Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di 30% espansione Media o 3 mL di 30% espansione Media + fattori di crescita/droghe desiderate.
    7. Piastra 1 mL per ogni piatto il prepatinato PDL/Laminin piatti. Agitare piatti avanti e indietro in tutte le direzioni per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare a 37 ° C per 2 h permettere alle cellule di aderire al piatto. Vedere la Figura 2 per un diario semplificato.
  4. Analisi voce di fase S
    1. Difficoltà piatti con gelido 4% paraformaldeide (PFA in PBS 1X) per 20 min. Quindi, lavare i piatti 3 volte per 5 min con PBS 1X.
    2. Aggiungere 1 mL di PBS 1x con 0,05% Sodio Azide per prevenire la crescita batterica e fungina. Cellule possono essere conservate a 4 ° C per fino a 6 mesi se piatti (sigillati con parafilm) vengono conservati nel PBS + Sodio Azide soluzione, però non tutti immunologici antigeni sono ben conservati dopo lunghi ritardi nell'analisi.
    3. Analisi di cellule mediante una reazione di EdU commerciale kit (Vedi il protocollo del produttore). Macchia le celle utilizzando DAPI o un altro marcatore nucleare e l'immagine usando la microscopia di fluorescenza.
    4. Valutare la percentuale di cellule positive EdU nel totale di cellule vive (numero totale delle cellule) ciechi in 10 campi sistematicamente casuali (10x). Non includono le cellule morte in analisi.
    5. Utilizzare sia immagini di contrasto di fase e immagini fluorescenti per determinare la macchiatura positiva di EdU e per accertare le celle che sono morte o vivo (Figura 3).
    6. Conteggio di tutte le celle che hanno entrambi liscio e anche della membrana cellulare in impostazioni di contrasto di fase e un grande nucleo non frammentato da fluorescente DAPI nucleare macchia, come queste cellule sono vivo (Figura 3A-B).
    7. Escludere tutte le celle che sono fase brillante, hanno una membrana di cellule irregolare rotta e hanno un nucleo piccolo, condensato come visualizzati da fluorescente DAPI imaging, come queste cellule sono morte (Figura 3A-B). Valutare cellule vive per l'espressione di EdU identificando le celle con luminose fluorescenti EdU macchia che copre l'intero nucleo o maculato colorazione fluorescente nel nucleo (Figura 3).
  5. Analisi di numero delle cellule di NPC
    1. Dopo 2 giorni nella cultura, etichettare e preparare provette per microcentrifuga da 1,5 mL e 0,5 mL microcentrifuga. In ogni provetta 0,5 mL, aggiungere 5 μL di Trypan Blue.
    2. A ciascun pozzetto di una piastra ben 24, rimuovere il mezzo e aggiungere 200 μL di 1 x cella distacco soluzione e posto in incubatrice per 10-15 min.
    3. Dopo il tempo assegnato, una volta che le cellule hanno sollevato, aggiungere la quantità desiderata di 1X PBS in ciascun pozzetto.
      Nota: In genere, il giorno 2, aggiungere 300 μL di PBS 1X per le celle contenente oltre 200 μL della soluzione di distacco, per un volume totale di 500 μL. Con il tempo di incubazione di impostazioni cultura aggiuntive, come le cellule diventano più confluenti, aumentare il volume di diluizione come necessario. Ad esempio, il giorno 4, aggiungere 500 μL di 1X PBS, e il giorno 6, 800 μL di PBS 1X. Totali volumi saranno 700 μL e 1 mL, rispettivamente.
    4. Utilizzando una pipetta P-1000, pipettare su e giù in ogni ben 4 a 5 volte per rimuovere le cellule. Esaminare la piastra sotto un microscopio per garantire che tutte le cellule hanno staccato. Trasferire le cellule per provette da 1,5 mL.
    5. Invertire i tubi da 1,5 mL con cellule diluite 2 o 3 volte. Poi prendere un 50 μL aliquota delle cellule dalla metà del tubo e aggiungere 0,5 mL provette con Trypan Blue (Vedi 4.5.1).
    6. Pipetta cella soluzione su e giù per 2 o 3 volte. Aggiungere celle all'emocitometro e analizzare immediatamente. In attesa per più di 10 min può aumentare la morte delle cellule o la presenza di cellule che hanno preso di Trypan Blue.
    7. Aggiungere con cautela 10 µ l di cell + miscela di tripan blu ad ogni lato dell'emocitometro per eseguire conteggi replicati. Contare le celle utilizzando il microscopio a contrasto di fase. Non contano le cellule morte o le cellule blu scure che hanno preso di Trypan Blue.
    8. Per ottenere l'uso di numero totale delle cellule la media cella numero contato dai 4 angoli dell'emocitometro e applicare la seguente equazione:
      Numero di cellulare x media del volume (mL) x 10,000 medio = numero totale delle cellule/pozzetto
    9. Aspirare e ripetere la procedura su pozzetti rimanenti. Cambiare il supporto sulle cellule che non sono essere contati, ogni saggio di ripetizione h. 48 giorni 4 & 6.

5. NPC del Neurite Assay

  1. Preparazione di piatti e Media per l'analisi del Neurite
    1. Fare un 1 mg/mL di soluzione madre di poli-d-lisina (PDL) in dH2O e filtro sterilizzare. Diluire 01:10 in dH2O per fare una soluzione PDL di 0,1 mg/mL e aggiungere 1 mL per ogni piatto di 35 mm. Incubare per 20 minuti a TA.
    2. Nel frattempo, preparare il supporto di espansione del 30% (Vedi sezione 3.5) e aggiungere 5 μg/mL (5 µ l/mL) di soluzione di fibronectina (1 mg/mL di brodo) ai media.
    3. Una volta preparato il supporto, è possibile aggiungere veicoli, fattori di crescita o droghe di interesse alle concentrazioni desiderate.
      Nota: Si consiglia di aggiungere veicolo, fattori di crescita o droghe, a volumi < 10% della soluzione totale per evitare di diluire la fibronectina e altri componenti nel mezzo di espansione del 30%.
    4. Dopo 20 minuti, lavare i piatti PDL 3 volte per 5 min con dH2O rimuovere PDL in eccesso. Garantire piatti siano asciutti prima di aggiunta di file multimediali.
    5. Posizionare 1 mL di soluzione di fibronectina + supporto (con o senza farmaci/fattori di crescita) in ogni piatto rivestito di PDL.
    6. Incubare piatti a 37 ° C per almeno 30 min prima di cellule per garantire un collegamento corretto della fibronectina al PDL di placcatura.
    7. Per ogni esperimento, è possibile impostare 2-3 piatti a condizione (per esempio, 3 veicolo contenente piatti, 3 piatti contenenti droga).
  2. NPC di placcatura per dosaggio del Neurite
    1. Vedere sezione 3.4 per la procedura a sollevare, dissociare, pellet e risospendere le cellule.
    2. Piastra di 50.000 cellule per ogni piatto in piatti preparati nella sezione 5.1. Agitare piatti avanti e indietro in tutte le direzioni per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule.
    3. Incubare le cellule a 37 ° C per 48 h.
  3. Analisi dei Neurites
    1. Dopo incubazione le cellule per 48 h, aspirare medio e difficoltà piatti con ghiaccio freddo 4% PFA per 20 min.
    2. Dopo 20 minuti, lavare i piatti 3 volte per 5 min con PBS 1X. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 1 mL di PBS 1x con 0,05% Sodio Azide.
    3. Analizzare i piatti alla cieca su un microscopio di contrasto di fase a 32x. Conteggio totale cellule e cellule con neuriti in 3, righe di 1cm, scelte a caso ma riproducibile posizioni. Contare un minimo di 150 celle per ogni piatto per garantire un prelievo corretto.
      Nota: Una neurite è definita come un'estensione (processo) dal corpo cellulare che è > 2 corpo cellulare diametri di lunghezza. Per le celle con più processi, il processo più lungo è considerato per il criterio. Cellule con processi che sono < corpo cellulare 2 diametri di lunghezza non sono in dotazione (Figura 4).
    4. Sommare il numero totale delle cellule e il numero totale di cellule con neuriti in ogni piatto. Calcolare la % di cellule con neurites. Media la percentuale di cellule con neurites attraverso piatti replicare. Fiducia nella riproducibilità sperimentale viene stabilita quando tutte le righe all'interno di ogni piatto sono simili, e medie tra i piatti sono molto simili, con l'errore standard della media (SEM) < 10%.
    5. In alternativa, analizzare i neurites conducendo immunocytochemistry per gli indicatori quali beta-III-tubulina (TUJ1) o MAP2. Dopo la colorazione per il marcatore di interesse, prendere 10 immagini sistematicamente casuale su un microscopio a fluorescenza a 10x. Immagine almeno 200 celle. In questo caso, acquisire le immagini non troppo vicino al bordo del piatto. Analizzare la percentuale di cellule con TUJ1 o MAP2 + neurites (per un esempio, vedere Figura 10 ).

6. NPC Neurosphere migrazione Assay

  1. Neurosphere formazione
    1. Aggiungere 1 mL di Media espansione 100% in un piatto di 35 mm con nessun substrato di rivestimento. Incubare, piatti per almeno 15 min a 37 ° C prima di placcatura NPC. preparare 2-3 piatti per assicurarsi che non vi sarà abbastanza neurosfere per l'analisi di migrazione delle cellule.
      Nota: L'assenza di un substrato di rivestimento assicura che i PNG rimangono sospesi nei media, che è essenziali per la formazione di neurosphere. Piatti di rivestimento impedirà la formazione di neurosphere.
    2. Vedere sezione 3.4 su passaggi di sollevare, dissociare ed il pellet di cellule. Risospendere il pellet cellulare in 2-5 mL di pre-riscaldato 100% Media espansione. Piastra 1 milione gli NPC in ogni piatto di 35mm preparato nella sezione 6.1.1.
    3. Incubare i PNG a 37 ° C per 48 a 96 h permettere gli NPC di neurosfere aggregato e forma. Valutare la dimensione di sfera utilizzando un righello dal vivo su un microscopio a contrasto di fase. Attendere che la maggior parte delle sfere raggiungere un diametro approssimativo di 100 µm (± 20 μm) (Figura 5). Sfere più piccole saranno completamente disperdere e rompono durante il test di migrazione.
  2. Preparazione delle piastre per l'analisi di migrazione Neurosphere
    1. Sciogliere le aliquote di gel ECM-mimico (Vedi sezione 3.2) in 6 mL di 30% espansione Media. Una volta preparato ECM-mimico gel/30% soluzione di espansione Media, aggiungere veicoli, fattori di crescita o droghe di interesse alle concentrazioni desiderate.
      Nota: Veicolo, droga e concentrazioni del fattore di crescita necessario essere aumentato per tenere conto l'aggiunta di 200 µ l di neurosfere in sezione 6.3.
    2. Piastra 1 mL di ECM-mimico gel 30% soluzione di espansione Media (± veicoli, fattori di crescita o farmaci) in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Fare 2-3 pozzi a condizione sperimentale. In alternativa, possono essere utilizzati piatti 35 mm. Incubare le piastre per almeno 30 min a 37 ° C.
      Nota: Non aspirare l'ECM-mimico gel/30% soluzione di espansione Media per questo test. Sfere in un gel di ECM-mimico aspirato di placcatura porterà alla migrazione rapida e in eccesso.
  3. Placcatura neurosfere
    1. Raccogliere neurosfere formata nella sezione 6.1 e inserirli in una provetta conica. Lavare i piatti con 1 mL di 1X PBS per garantire tutti i neurospheres sono raccolti in 35 mm. Rotazione verso il basso la neurospheres raccolti a 100 x g per 5 min.
    2. Risospendere il neurosfere in 1-3 mL di pre-riscaldato 30% Media espansione. Se 1 piatto di neurosfere raccolti, 1 mL di media viene utilizzato per risospendere le sfere. Se vengono raccolti 2 piatti, 2 mL di media vengono aggiunti per risospendere le sfere, ecc. Pipettare delicatamente e utilizzare solo una P-1000 per garantire sfere non sono rotti.
    3. Piastra 200 μL del sedimento neurosfere nell'ECM-mimico gel/30% soluzione di espansione fatta nella sezione 6.2. Lastre di roccia in tutte le direzioni per distribuire uniformemente neurosfere. Incubare le piastre per 48 h a 37° C.
    4. Rimuovere la soluzione di espansione Media gel/30% ECM-mimico e difficoltà cellule in 4% PFA, lavare e mantenere le cellule in 1X PBS + 0.05% di Sodio Azide.
  4. Analisi di neurosfere
    1. Acquisire immagini di neurosfere intero utilizzando le impostazioni di contrasto di fase a 10x. Garantire sfere non si toccano. Misura media migrazione utilizzando il software ImageJ.
    2. Tracciamento del contorno esterno del neurosphere utilizzando lo strumento linea a mano libera. La linea a mano libera può essere letta cliccando col tasto destro sull'icona di "retta". Manualmente traccia utilizzando un mouse.
    3. Utilizzare la funzione di misura per calcolare l'area della traccia. Assicurarsi che la "zona" è selezionato come una lettura nella finestra "Impostare misure" trovata sotto la scheda analizza. Vedere la Figura 6 per traccia di contorno esterno in blu.
    4. Traccia la massa cellulare interna della sfera e misura dell'area. Vedere la Figura 6 per traccia di contorno interno in rosso. Quantificare media migrazione sottraendo la massa interna delle cellule dall'area totale neurosphere.
    5. Misura neurosfere che presentano una massa cellulare interna densamente imballato con le cellule di migrare fuori come un tappeto contiguo (Figura 6).
    6. Non includono le cellule di fuori del tappeto o staccata dal neurosphere per la misurazione. Vedere la Figura 6 per esempi di celle (cerchiate in bianco) che sono esclusi dalla misurazione del tappeto esterno. Analizzare un minimo di 20 neurosfere per ogni condizione.

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Risultati

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Uno degli obiettivi di questi studi consiste nel definire l'attività proliferativa degli NPC, vale a dire un aumento nei numeri delle cellule. Questo risultato è ottenuto mediante la valutazione di sintesi del DNA della popolazione cellulare totale, un approccio di alto-rendimento che misura l'incorporazione di timidina contenente tritio tracciante radioattivo in estratti cellulari e riflette tutte le celle impegnate nella fase S, siano essi sintetizzando per 5 minuti o le ore due intere....

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Discussione

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I protocolli presentati qui illustrano i metodi di semplici e veloci per lo studio dei processi fondamentali dello sviluppo neurologico e verificare i fattori di crescita e farmaci che utilizzano cellule precursori neurali hiPSC-derivati. la tecnologia hiPSC ha rivoluzionato lo studio della patogenesi delle malattie neurodevelopmental fornendoci un accesso senza precedenti a vivere umane cellule neuronali da individui affetti. Infatti, ci sono stati numerosi studi hiPSC di disturbi dello sviluppo neurologico, tra cui la ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio del governatore New Jersey per la ricerca medica e trattamento di autismo (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie segna la Fondazione di famiglia, Mindworks Charitable Trust di piombo e la Fondazione di comunità ebraica di maggiore MetroWest NJ.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PSC Mezzo di induzione neurale:
Collegamento protocollo: https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801Si tratta di un kit composto da un terreno neurobasale (NB) e da un integratore di induzione neurale (NIS) 50x. Il NIS viene utilizzato per realizzare un mezzo di induzione neurale 1X e un mezzo di espansione al 100%
DMEM/F12 avanzatoThermoFischer Scientific12634-010Componente del mezzo di espansione al 100%
Mezzo neurobasaleThermoFischer Scientific21103049Componente sia del NIM che del mezzo di espansione al 100% 
Matrigel Corning qualificato hESC354277gel mimico della matrice extracellulare qualificato hESC (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mgStem Cell Technologies72302Inibitore ROCK Piastre
6 pozzettiCorningCOR-3506Piastre in polistirene utilizzate per il mantenimento di NPC e per il saggio di migrazione della neurosfera.
Piastre a 24 pozzettiThermoFischer Scientific2021-05Piastre in polistirene: Utilizzate per il saggio di sintesi del DNA NPC
Piastre da 35 mmThermoFischer Scientific2021-01Piastre in polistirene: Utilizzate per l'ingresso in fase S NPC e il test di neurite
Laminin di topo naturaleInvitrogen23017-015Substrato per piastre di rivestimento: Utilizzato per la sintesi di DNA NPC, l'ingresso in fase S e i saggi
del numero di celluleSubstrato di fibronectinaSigmaF1141per piastre di rivestimento: utilizzato per il test di neurite 
Substrato Poly-D-LysineSigmaP0899per piastre di rivestimento
Penicillina/StreptomicinaThermoFischer Scientific15140122Antibiotic, componente di NIM, 100% di espansione e 30% di mezzi di espansione 
StemPro AccutaseGibcoA11105-01Soluzione per il distacco di cellule 1X 
2,5% Tripsina (10X)Gibco15090-04610X soluzione enzimatica
0,5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261utilizzato in soluzione di tripsina per il sollevamento di cellule per il saggio di sintesi del DNA
triziato [3H]-timidinaPerkinElmerNET027E001Trizio radioattivo, timidina
Fisherbrand 7 mL HDPE Fiale di scintillazioneFisherbrand Fisherbrand03-337-1Fiale per conteggio a scintillazione liquida
EcoLite(+)MP Biomedicals0188247501 Cocktail di scintillazione liquida
LS 6500 contatore a scintillazione liquida multiusoBeckman Coulter8043-30-1194Contatore a scintillazione liquida
Skatron Raccoglitore di celle semi-automtico Tipo 11019Dispositivi molecolari e Strumenti Skatron, Inc.Raccoglitore di cellule semiautomatico
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Kit di imagingThermoFisher ScientificC10337EdU e kit di colorazione per il test di ingresso in fase S
Soluzione di tripano blu, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061Valutazione della vitalità delle cellule
Carta da filtro di grado GF/CGE Healthcare Life Sciences, Whatman1822-849Carta da filtro in fibra di vetro
Fattore di crescitaumano di base FGF-2Peprotech100-18B
Polipeptide attivante l'adenilato ciclasi ipofisaria (PACAP-38)BACHEMH-8430neuropeptide
a

Riferimenti

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