A differenza di ubiquitin-ligasi, sono stati identificati alcuni ligasi E3 SUMO. Questo modificate in vitro sumoilazione protocollo è in grado di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi mediante saggio di ricostituzione in vitro .
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Articolo metodologico
In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO
In questo articolo
Sommario
Abstract
Modifica piccolo ubiquitina-come modificatore (SUMO) è un'importante modificazione post-traduzionale (PTM) che media la trasduzione del segnale principalmente attraverso interazioni proteina-proteina di modulazione. Simile alla modifica di ubiquitina, sumolazione è diretto da una cascata enzimatica sequenziale tra cui enzima E1-attivazione (SAE1/SAE2), enzima di coniugazione E2 (Ubc9) ed E3-ligasi (cioè, pia famiglia, RanBP2 e Pc2). Tuttavia, a differenza di ubiquitinazione, una ligasi E3 non è essenziale per la reazione, ma non fornire la precisione e l'efficacia per la coniugazione di SUMO. Proteine modificate da SUMOylation possono essere identificati dall'analisi in vivo tramite immunoprecipitazione con anticorpi specifici per substrato e immunoblotting con anticorpi specifici per SUMO. Tuttavia, la dimostrazione dell'attività della proteina SUMO E3 ligasi richiede la ricostituzione in vitro di SUMOilazione saggi utilizzando enzimi purificati, substrato e proteine SUMO. Poiché nelle reazioni in vitro , solitamente SAE1/SAE2 e Ubc9, da soli sono sufficienti per la coniugazione di SUMO, valorizzazione di sumoilazione di una putativa ligasi E3 non è sempre facile da rilevare. Qui, descriviamo una modificate in vitro sumoilazione protocollo che identifica costantemente modificati di SUMO utilizzano un sistema in vitro ricostituito. Un protocollo di passo-passo per purificare cataliticamente attiva K-bZIP, una virale SUMO-2/3 E3 ligasi, inoltre è presentato. Le attività di SUMOilazione della K-bZIP purificato sono esposte su p53, una destinazione ben nota di SUMO. Questo protocollo può essere impiegato non solo per il delucidamento romanzo SUMO E3 ligasi, ma anche per rivelare la loro specificità di paralog SUMO.
Introduzione
Modifica di SUMO è stato inizialmente identificato come una modificazione post-traduzionale reversibile (PTM) che regola la stabilità della proteina1. Oltre a coniugazione diretta, SUMO può anche essere collegato ad una proteina attraverso l'interazione non-covalente di SUMO interazione motivi (SIMs)2. Simile all'associazione di tyrosyl-fosforilazione di molecole che harboring Src homology 2 (SH2) o phosphotyrosine binding (PTB) domini3,4, modifica di SUMO fornisce una piattaforma di interazione aggiuntiva per selettiva assunzione di5....
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Protocollo
1. preparazione di costrutti di espressione di Baculovirus
-
Purificare il SUMO E3 ligasi K-bZIP di clonazione del cDNA di K-bZIP19 in un vettore di baculovirus duplice espressione (Vedi tabella materiali) con un epitopo-tag N-terminale. Abbiamo avuto successo usando un tag di octapeptide (indicato in tutto il protocollo come vettore-tag-K-bZIP).
Nota: Il modello di DNA per K-bZIP della polimerasi reazione a catena (PCR) clonazione è cDNA inverso trascritto dal RNA isolato dalle cellule di TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 seguono doxiciclina trattamento20.- Trasferimento del full-length cDNA di ....
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Risultati
Secondo le informazioni fornite dal costruttore, la quantità di enzima E1 ed E2 nell'analisi della SUMOilazione standard è di 50 nM e 500 nM, rispettivamente. La quantità minima di E2 coniugando enzima Ubc9 che è in grado di SUMOylate p53 in primo luogo è stata determinata mediante un test di SUMOilazione in vitro . In basso come un quinto della quantità di Ubc9 usato nello standard in vitro protocollo di analisi di SUMOilazione ha saputo efficientemente SUMOylate p53 (<.......
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Discussione
Lo in vitro sumoilazione protocollo descritto qui è usata ordinariamente per stabilire lo stato di sumoilazione di identificati Ubc9 substrati. La limitazione principale utilizzando il protocollo standard per studiare la funzione di sumoilazione di SUMO E3 ligasi è l'abbondanza di SUMO E1 attivando ed enzimi di coniugazione E2 Ubc9 che massimizzano la coniugazione di SUMO in sistemi in vitro . Considerando questa sfida, noi crediamo che titolazione della quantità di enzimi SUMO E1 ed E2 al livello che a.......
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Dichiarazioni
Gli autori non divulgare nessun potenziali conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal Ministero della scienza e tecnologia (la maggior parte, 105-2320-B-010-007-MY3 a PCC), dall'Istituto di ricerca di salute nazionale (vi-EX105-10215BC a PCC), dal Ministero della scienza e tecnologia (più 105-2314-B-400-019 di HJK) e dell'Istituto di ricerca di salute nazionale (vi MG-105-SP-10, vi MG-106-SP-10 di HJK). Questo lavoro è stato supportato anche parzialmente con National Yang-Ming University sulla pubblicazione del manoscritto di PCC. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o riparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | vettore del baculovirus a doppia espressione |
| vettore pCR2.1-TOPO | Invitrogen | PCR | |
| cellula competente E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competente E. coli cellule A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competente E. coli cellule B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | reagente di trasfezione |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reticolo ridotto |
| T4 Ligasi | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | substrato di galattosidasi |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace' s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicina | Thermo Fisher 15750060 | ||
| Ampicillina | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamicina | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicina | Gibco | 15710-064 | |
| tetraciclina | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Brodo | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodio dodecil solfato | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoetanolo | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Latte scremato | Fonterra | ||
| glicerolo | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergente A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergente B |
| Poloxamer 188 soluzione | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergente C |
| Inibitore della proteasi Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Perline magnetiche | Sigma-Aldrich | M8823 | anticorpi etichettati |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | protocollo standard SUMOilazione |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Motivo attivo | 40220 | protocollo SUMOilazione standard |
| Kit di estrazione su gel QIAquick | QIAGEN | 28704 | |
| Mini kit di plasmidi QIAGEN | estrazione plasmidi | QIAGEN | 12123 |
| Provette in polipropilene | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Sollevatore cellulare | Corning | CNG3008 | |
| Punta di caricamento | Sorenson BioScience | 28480 | |
| in PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting | Bio-Rad | 1703932 | |
| Apparecchio per gel per lastre Mini (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Cella di trasferimento elettroforetica semi-secca | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL |
| miscelatore per sospensioni | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| Kansin instruments Co. | OS701 | ||
| ImageQuant LAS 4000 imager biomolecolare | GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anticorpo anti-p53 | Cell Signaling | #9282 | |
| anticorpo anti-coniglio | GE Healthcare | NA934-1ML |
Riferimenti
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al.
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Ristampe e permessi
