Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

Sommario

Liquefazione dello sperma è richiesto per gli spermatozoi di essere liberato dal gel seminale. Questo studio fornisce le procedure per la raccolta dello sperma dal post-coito tratto riproduttivo femminile e misurazione del tempo di liquefazione dello sperma.

Abstract

In topi, sperma eiaculato è depositato nell'utero. Dopo l'eiaculazione, lo sperma cambia consistenza da gel-like a acquoso, un processo chiamato liquefazione. In questo studio, mostriamo come raccogliere il post-eiaculato sperma dal tratto riproduttivo femminile in un modello murino. In primo luogo, adulti topi femminili in fase di estro sono stati alloggiati nella gabbia del maschio durante la notte. La mattina successiva, copulazione è stata confermata dalla presenza di copulatoria spina all'apertura vaginale. I topi femminili con spine copulatore sono stati eutanasizzati e ogni tratto riproduttivo è stato raccolto nel suo complesso (vagina, utero, ovidotti, ovaie), garantendo un sistema chiuso per contenere lo sperma. Il tratto riproduttivo è stato disposto in una microcentrifuga da 1,5 mL, e la vagina è stata tagliata fuori per liberare il suo sperma nel tubo. Per garantire il volume di sperma massimo per l'analisi, senza denti forcipe sono stato utilizzato per spremere i corni uterini da ovarico fine a fine vaginale espellendo lo sperma restante. Il tratto intero riproduttivo è stato poi scartato. Il tubo che contiene lo sperma era filato brevemente verso il basso. Una pipetta capillare 25 μL è stato disposto nel tubo ad un angolo di 180° (parallela alla parete del tubo). La quantità di tempo utilizzato per riempire il tubo capillare alla riga 25 μL è stata registrata. Sperma da un allevatore provato maschio di solito prende circa 60-180 s per riempire un tubo capillare di 25 μL. Questa tecnica di raccolta dello sperma è utilizzabile anche in altre applicazioni a valle quali analisi di imaging e la motilità dello sperma.

Introduzione

Il tratto riproduttivo femminile comprende i tratti superiori e inferiori. Il tratto riproduttivo superiore include Tube di Falloppio, l'utero e l'endocervice. Il tratto riproduttivo inferiore comprende l'esocervice e vagina. In esseri umani, lo sperma eiaculato è depositato presso la parete anteriore della vagina, adiacente al ectocervix¹. In topi, tuttavia, lo sperma è spazzato in utero pochi minuti dopo l'accoppiamento di².

Lo sperma contiene gel seminale che si solidifica in pochi secondi di eiaculazione, causando lo sperma per essere intrappolati e immobilizzato³. Liquefazione rilascia lo sperma immobilizzato modificando lo sperma da un simil-gel ad una consistenza acquosa. Questo processo è essenziale per la motilità spermatica e la riproduzione dei mammiferi. Conoscenza della liquefazione dello sperma è principalmente basato su studi in vitro dove lo sperma diventa liquefatto in una piastra di coltura. In esseri umani, l'attività enzimatica di antigene prostatico specifico o PSA (noto anche come callicreina-correlati peptidasi 3 o KLK3) è il maggiore contributo per liquefazione attraverso idrolisi del semenogelins (gelificanti proteine presenti nel liquido seminale)^{4 ,5,6}. Degradazione di semenogelins libera lo sperma dal coagulo seminale, aumento della mobilità degli spermatozoi. Liberate lo sperma nuotare verso le tube di Falloppio per fertilizzare l'uovo. Liquefazione (o viscosità del liquido seminale) test sono uno delle proiezioni standard iniziale per analisi del liquido seminale in cliniche di fertilità per valutare la fertilità maschile⁷.

Un articolo pubblicato di recente mostra che l'analisi del liquido seminale raccolto da mouse femminile tratto riproduttivo post-corrispondersi può essere utilizzato per illustrare una carenza nella liquefazione che successivamente può causare difetti di fertilità⁸. Liquefazione difettoso come sperma iperviscosità contribuisce a 11,8-32,3% dei casi infertili in uomini⁹, suggerendo che normale liquefazione è indispensabile per la riproduzione dei mammiferi. Tuttavia, studi e trattamento dei difetti di liquefazione si sono concentrati esclusivamente sul maschio⁷. La possibilità che il tratto riproduttivo femminile svolge un ruolo nella liquefazione dello sperma non è stata esplorata. Di conseguenza, i metodi per la raccolta dello sperma e la misurazione del tempo di liquefazione fornire ai ricercatori un nuovo strumento diagnostico per determinare se la liquefazione potrebbe essere una delle cause della sterilità nell'organismo modello di interesse.

Protocollo

Tutti gli animali e le procedure utilizzate in questo studio sono state gestite secondo orientamenti Comitato di uso e cura degli animali di Washington State University (WSU) e in conformità a protocolli animale WSU-approvato 4702 # e #4735.

1. topi

1. Utilizzare standard topi del maschio adulto C57BL/6J o altri ceppi di interesse. Mantenere gli animali in un ambiente di temperatura e umidità controllata, con accesso ad libitum di acqua e cibo.
   1. Utilizzare riproduttori maschi che vanno da 8 settimane a 10 mesi di età. Utilizzare solo gli allevatori provati negli esperimenti.
2. Utilizzare topi adulti femminili con un'omissione selettiva dei tessuti del tratto riproduttivo dell'estrogeno recettore α (codificata dal gene Esr1 ) in cellule epiteliali¹⁰ (Wnt7a^{Cre / +}; Esr1^f/f, chiamato KO o "KO") e controllare littermates (Esr1^f/f, chiamato "CTRL") in questo studio.
   1. Utilizzare 8 settimana-vecchio femmine. Età delle femmine varia a seconda dell'esperimento di interesse.
3. Determinare le fasi del ciclo estrale la mattina alle 08:00 h. Usare solo le femmine allo stadio del ciclo di estro. Per metodi dettagliati di sbavature vaginali e analisi citologica, consultare le procedure pubblicate in precedenza¹¹.

2. accoppiamento e valutare copulatore spine

1. Al giorno di estro (16:00 h), casa la femmina nella gabbia del maschio.
2. La mattina successiva (08:00 h), separare la femmina dal maschio mouse.
3. Utilizzare un adattamento di un metodo precedentemente pubblicato¹² per accedere la presenza o l'assenza di un plug vaginale o copulatoria come un'indicazione dell'accoppiamento.
4. Tenere premuto il mouse femmina dalla base della coda per sollevare brevemente gli arti posteriori.
5. Trovare la spina copulatoria dalla presenza di un coagulo seminale biancastro all'apertura vaginale utilizzando uno stuzzicadenti. Se la spina copulatoria è presente, lo stuzzicadenti non sarà in grado di essere inserito nel canale vaginale.

3. preparazione prima dell'accumulazione del tessuto

1. Preparare 10 mL di mezzi di L-15 di Leibovitz, completati con 1% di siero fetale bovino (chiamato L15 media + 1% FBS) in una provetta da 15 mL. Incubare i media a 37 ° C per 15 min a bagnomaria.
2. Al fine di preservare la vitalità del tessuto e dello sperma per applicazioni a valle, aliquotare 2 mL di pre-riscaldato L15 media + 1% FBS in una microcentrifuga 2 mL tubo per la raccolta del tessuto.
3. Scaldare la fase dello stereomicroscopio a 37 ° C. Impostare il calore-blocco a 37 ° C e inserire un tubo del microcentrifuge vuoto 1,5 mL nel blocco.
4. Se le applicazioni a valle richiedono imaging di motilità dello sperma, calda il vetrino a 37 ° C.

4. tessuto collezione

1. Portare preriscaldata L15 media + 1% aliquota FBS alla zona di raccolta del tessuto.
2. La femmina di eutanasia (~ 08: 30h) utilizzando anidride carbonica asfissia seguita da dislocazione cervicale.
   Nota: Questo è circa 8 h dopo l'accoppiamento, supponendo che l'accoppiamento avviene a mezzanotte.
3. Metti l'animale in posizione supina per esporre la zona addominale.
4. Spruzzare alcool al 70% sull'addome vicino arti posteriori.
5. Utilizzare le forbici per dissezione per fare un piccolo taglio (~ 1 cm) sulla pelle dell'addome più basso.
6. Utilizzare la mano dominante per tirare la coda (e arti posteriori se necessario) mentre la mano non dominante tira la pelle in direzione opposta (verso la testa) per esporre il muscolo addominale. Questo metodo viene utilizzato per ridurre al minimo la contaminazione di capelli agli organi viscerali.
7. Tagliare il muscolo addominale in una forma di V alla base dell'addome, adiacente alla vagina, per esporre gli organi viscerali.
8. Spostare gli intestini e grasso addominale verso il lato per esporre il tratto riproduttivo.
9. Tagliare dalla vescica e altri tessuti sopra la zona vaginale.
10. Tagliate la sinfisi pubica per ottenere l'accesso al tessuto vaginale.
11. Sollevare il tessuto vaginale all'apertura vaginale e utilizzando forbici per separare il canale vaginale dal tessuto rettale.
12. Tagliate accuratamente il grasso mesenterico da entrambi i lati dell'utero utilizzando forbici di primavera.
    Attenzione: L'utero è molto fragile con lo sperma all'interno. Fare attenzione a non perforare l'utero, altrimenti lo sperma sarà perso.
13. Sollevare il basso tratto riproduttivo e tagliare il cuscinetto di grasso ovarico fuori entrambi i lati.
14. Trasferire il tratto intero riproduttivo nel tubo di pre-riscaldato Leibovitz L-15 media + 1% FBS.

5. misurazione della liquefazione dello sperma (viscosità) dalla raccolta contenuto uterino

1. Sul piatto riscaldato dello stereomicroscopio, trasferire i tessuti in un piatto di coltura di tessuto sterile 35 mm riempiti con 3,5 mL pre-riscaldati L-15 media + 1% FBS per pulire i tessuti di sangue e di altri contaminanti.
   Attenzione: Durante il lavaggio, afferrare i tessuti per il grasso, non l'utero. A questo punto, lo sperma dovrebbe essere intatto all'interno dell'utero.
2. Asciugare i tessuti del terreno in eccesso utilizzando salviette di laboratorio.
3. Tenere il tessuto all'estremità vaginale mentre inserendo l'estremità ovarica nel tubo del microcentrifuge pre-riscaldata. Tenendo l'estremità vaginale, tagliata i corni uterini alla base dell'utero, permettendo i corni uterini cadere nel tubo del microcentrifuge.
4. Lasciate che lo sperma fuoriuscire i corni uterini nella provetta. Utilizzare pinze senza denti per spremere delicatamente i corni uterini dall'estremità ovarica fino alla fine vaginale, espellendo fuori lo sperma rimasto.
5. Scartare i tessuti in sacchetto biohazard e incenerire.
6. Si sono fermati brevemente lo sperma in un minicentrifuge (~ 1-2 s).
7. Disporre il tubo, parallelo al piatto riscaldato - sperma non versare fuori.
8. Hanno il timer pronto e impostare a 'contare'.
9. Inserire un tubo capillare di 25 µ l del campione di sperma con un angolo di 180° (parallelo alla parete del tubo). Questo è per ridurre al minimo la variabilità tra ciascun investigatore da che tiene il tubo capillare in diverse angolazioni.
10. Premere il timer, non appena il tubo capillare fa contatto con lo sperma.
11. Registrare il tempo (s) necessario per lo sperma a raggiungere la linea di 25 µ l.
12. Quando la misurazione è terminata, immediatamente messo il tubo contenente sperma indietro nel blocco a calore secco per ulteriori analisi funzionale, come l'imaging dei video di motilità dello sperma.
13. Disinfettare il tubo capillare contenente sperma immergendo il tubo nella soluzione di candeggina al 10% per 20 min e scartare il tubo capillare nell'apposito contenitore.

6. video Imaging di motilità dello sperma

1. Accendere il microscopio e video software di imaging.
2. Pipettare 20 µ l di sperma restante nella diapositiva di vetro pre-riscaldato, mentre il vetrino viene collocato sul piatto riscaldato.
3. Coprire con un vetrino coprioggetti.
4. Posizionare il lato del vetrino coprioggetto diapositiva sul microscopio.
5. Utilizzare 20 X Diametro obiettivo per trovare l'area di interesse.
6. Cambiare a 100 X Diametro obiettivo per l'imaging dei video.
7. Registrare il video a 12 fotogrammi/s (fps) per 30 s.
8. Casualmente è possibile registrare i video in almeno 3 diverse aree per animale.
9. Eseguire l'imaging rapidamente e minimizzare l'esposizione alla luce alla diapositiva al fine di preservare la motilità e vitalità.
   Nota: Questa procedura di imaging deve essere eseguita entro 2-3 min.
10. Eseguire l'analisi di dati utilizzando software ImageJ come descritto in precedenza⁸.

Risultati

Lo sperma è stato raccolto da CTRL e KO femmine circa 8 h dopo l'accoppiamento con i maschi fertili di CTRL. Liquefazione (o viscosità del liquido seminale) è quantificata mediante il tempo impiegato per riempire il tubo capillare di 25 μL di sperma. Lo sperma raccolto da uteri di CTRL preso 2,06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) per riempire il tubo capillare (Figura 1). Tuttavia, lo sperma raccolto da uteri di KO ha avuto più di 60 min (60,0 ' di ± 0.0, mean±S.E.M, n = 5) di ...

Discussione

Raccolta di sperma da uteri del mouse possa fornire vantaggi rispetto sperma analisi in vitro come l'ex può illustrare le interazioni fisiologiche tra lo sperma e le secrezioni dal tratto riproduttivo femminile. Le tecniche presentate in questo studio permettono ai ricercatori di determinare la qualità dello sperma nonché la vitalità degli spermatozoi e la motilità in condizioni fisiologiche ideali. Inoltre, ci sono varie analisi a valle che possono essere eseguite utilizzando lo sperma raccolto dalla u...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stuzzicadenti	Diamond	750-Flat	Autoclavato sterile, utilizzare stuzzicadenti smussato. Non utilizzare
forbici da dissezione	Fisher	08-940
Forbici a molla	Roboz	RS-5600
Pinze fini	Roboz	RS-5045
25-μ Tubo capillare in vetro L	VWR	53432-761
Leibovitz' s Terreni L-15	Life Technologies	Integratore con l'1% di FBS
Siero fetale bovino (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106
Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml	Axygen	MCT-150-C
Provetta per microcentrifuga da 2 ml	Axygen	MCT-200-A
Riscaldatore digitale a blocco secco	VWR	13259-052	Per riscaldare la provetta per microcentrifuga prima della raccolta dello sperma
Minicentrifuga	Corning	LSE 6765
Piatto di coltura da 35 mm	VWR	10861-656
Provetta da centrifuga in polipropilene da 15 ml	VWR	10025-686
Bagno d'acqua	Precisione	TSGP05
Stereomicroscopio a tavolino riscaldato	Leica Microsystems	MZ10F	Per mantenere caldo il tessuto prima di
Microscopio a campo chiaro	Leica Microsystems	DMi8	Opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi
la fotocamera	Leica Microsystems	DMC2900	opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi
Vetrini Fisher		12-552-3	Opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi
Vetrino coprioggetti	VWR	48393-059	Opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi
candeggina			diluire in dH2O al 10% di concentrazione

a punta 11415064 , , ,