Un semplice Cell-based immunofluorescenza per rilevare autoanticorpi contro il recettore N-metil-D-aspartato (NMDA) nel sangue

Sommario

Abbiamo ectopically espresso NR1 subunità del recettore NMDA etichettato come proteina fluorescente verde in cellule embrionali umane (HEK293) come antigene per rilevare autoanticorpi diretti contro il recettore NMDA nel sangue di pazienti con sospettata con l'encefalite autoimmune. Questo semplice metodo può essere adatto per scopi nelle regolazioni cliniche di screening.

Abstract

La presenza degli autoanticorpi del recettore anti-NMDA può causare vari sintomi neuropsichiatrici in pazienti commoventi, definiti l'encefalite autoimmune di anti-NMDA receptor. L'individuazione degli specifici autoanticorpi contro il recettore NMDA nel sangue o liquido cerebrospinale (CSF) è essenziale per la diagnosi esatta di questa condizione. Il recettore NMDA è un complesso di proteine canale dello ione che contiene quattro subunità, tra cui due subunità di ricevitore NMDA 1 (NR1) obbligatoria e recettore NMDA uno o due subunità 2A (NR2A), 2B di subunità del recettore NMDA (NR2B), unità secondaria del ricevitore NMDA 2C (NR2C), o del recettore NMDA subunità 2D (NR2D). L'epitopo di autoanticorpi anti-NMDA del ricevitore è stato segnalato per essere presente nel dominio N-terminale extracellulare della subunità NR1 del recettore NMDA. L'obiettivo di questo studio è quello di sviluppare un test di immunofluorescenza basati su cellule semplice che può essere utilizzato come test di screening per rilevare la presenza di autoanticorpi diretti contro NR1 subunità del recettore NMDA nel sangue per facilitare la ricerca di base e clinica di encefalite autoimmune di anti-NMDA receptor.

Introduzione

L'encefalite autoimmune di anti-NMDA del ricevitore è un'entità recentemente riconosciuta di malattia che può accadere in pazienti di tutte le età e colpisce i pazienti prevalentemente femminile^1,2. È uno dell'encefalite più frequentemente diagnosticato fra i pazienti con eziologia sconosciuta iniziale di encefalite³. Pazienti affetti da encefalite di anti-NMDA receptor solitamente hanno sintomi prodromici di un mal di testa o febbre, seguita dallo sviluppo veloce del cambiamento di livello di coscienza e una varietà di sintomi neuropsichiatrici acuti, tra cui agitazione, irritabilità , ansia, insonnia, allucinazioni, deliri, aggressività, comportamenti bizzarri, anomalie del movimento, disregolazione autonomica e sequestro attacchi^4,5. Il riconoscimento iniziale di questa condizione e il tempestivo trattamento con immunoterapia sono importanti per un risultato migliore e anche pieno recupero in pazienti colpiti⁶. Quindi, esso è suggerito che l'encefalite autoimmune di anti-NMDA del ricevitore dovrebbe essere considerata come un'importante diagnosi differenziale dei pazienti che presentano con caratteristiche psicotiche acute o nuova insorgenza^7,8.

Oltre alle caratteristiche cliniche, rilevamento degli autoanticorpi contro il recettore NMDA nel sangue o CSF è essenziale per la diagnosi esatta di anti-NMDA receptor encefalite autoimmune⁹. La maggior parte dei test immunologici per rilevare il autoantibody del recettore anti-NMDA sono disponibile in qualche ricerca laboratori^10,11, e c'è solo un test di immunofluorescenza di basati su cellule commercialmente disponibili per lo screening del anti-NMDA receptor autoantibodies¹². L'obiettivo di questo studio è quello di sviluppare un test di immunofluorescenza di basati su cellule in-House semplice che può essere convenientemente utilizzato in laboratorio allo schermo anti-NMDA receptor autoanticorpi per facilitare la ricerca clinica del recettore NMDA anti encefalite autoimmune. Il recettore NMDA è una heterotetramer ione canale proteina complessa specificamente espressa nel cervello. È fatta di due unità secondarie NR1 obbligatorie e la combinazione di uno o due subunità NR2A, NR2B, NR2C o NR2D¹³. Un precedente studio riferito che l'epitopo principale mirato da parte degli anticorpi è presso il dominio N-terminale extracellulare della subunità NR1⁵. Quindi, in questo protocollo, esprimiamo la proteina ricombinante umana di NR1-subunità del recettore NMDA etichettato come proteina fluorescente verde (GFP) nella linea cellulare epiteliale embrionali umane del rene (HEK293) e sviluppare un test di immunofluorescenza basati su cellule per rilevare la classe di IgG del anti-NMDA receptor autoanticorpi nel sangue.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dall'istituzionale Review Board di Chang Gung Memorial Hospital presso Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).

1. preparazione del plasmide di espressione NR1-GFP

1. Miscelare 10 ng di plasmide NR1-GFP con 100 µ l del ceppo di cellule competenti di Escherichia coli DH5α in una sterile 1,5 mL Centrifuga tubo, dispensare la miscela delicatamente fino e giù 4 - 6 volte e incubare la provetta in ghiaccio per 20 min.
2. Incubare la provetta a 42 ° C per 1 min in un bagno di acqua, togliere il tubo dal bagno di acqua, aggiungere 1 mL di terreno di brodo (LB) Lisogenesi nel tubo e incubare la provetta a 37 ° C in un incubatore con agitazione per 1 h.
3. Diffusione di 50 µ l della miscela su una piastra di agar LB contenente ampicillina (0.1 mg/mL) e incubare la piastra di agar LB a 37 ° C in un incubatore per una notte.
4. Scegliere una singola Colonia dalla piastra di agar LB durante la notte, utilizzando una punta sterile, e agitare la punta in un in un tubo di coltura batterica contenente 5 mL di LB medium e ampicillina (0.1 mg/mL). Incubare la provetta a 37 ° C in un incubatore con agitazione durante la notte.
5. Aliquotare 3 mL di coltura batterica durante la notte in una beuta da 500 mL contenente 250 mL di terreno sterile di LB e ampicillina (0.1 mg/mL). Incubare la beuta a 37 ° C con agitazione. Controllare regolarmente la densità ottica (OD) della coltura batterica a lunghezza d'onda di 600 nm utilizzando uno spettrometro fino a quando il OD600 raggiunge 0,6-1,0.
   Nota: Mescolare ben 800 µ l della coltura batterica durante la notte con 200 glicerolo µ l per preparare il brodo di glicerolo e conservare lo stock di glicerolo sotto-80 ° C per un uso futuro.
6. Preparare il plasmide di espressione NR1-GFP dalla cultura batterica 250 mL
   1. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 6.000 x g per 15 min a 4 ° C.
   2. Risospendere il pellet di batteri in 10 mL di tampone di risospensione contenente RNasi A; miscelare accuratamente fino a nessun ciuffo è visto.
   3. Aggiungere 10 mL di tampone di lisi per la sospensione batterica, delicatamente capovolgere la miscela 4 - 6 volte e incubare a temperatura ambiente (TA) per 5 min lisato.
   4. Aggiungere 10 mL di tampone di precipitazione pre-refrigerati MU, capovolgere delicatamente la miscela di 4 - 6 volte.
   5. Versare il lisato nella canna di una cartuccia di filtro con l'apposito coperchio attendere 10 minuti a TA.
   6. Rimuovere il tappo dall'ugello di uscita della cartuccia, inserire uno stantuffo nella cartuccia e premere delicatamente lo stantuffo. Raccogliere il filtrato lisato in una provetta da 50 mL.
   7. Aggiungere 2,5 mL proprietarie di tampone dal produttore da filtrare lisato, mescolare la miscela capovolgendo la provetta circa 10 volte e incubare la miscela sul ghiaccio per 30 min.
   8. Applicare la miscela di lisato filtrata a una colonna di filtro che è stata equilibrata con 10 mL di tampone di equilibrazione. Consentire la colonna di scarico per gravità.
   9. Lavare la colonna con 30 mL di tampone di lavaggio due volte, quindi eluire il DNA dalla colonna con 15 mL di tampone di eluizione.
   10. Aggiungere 10,5 mL (0,7 volumi) isopropanolo al buffer di DNA eluite, mescolare bene e centrifugare la miscela a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C.
   11. Decantare il supernatante con cura, lavare una volta la pallina di DNA con 5 mL di etanolo al 70% privo di endotossina e centrifugare a 20.000 x g per 10 min.
   12. Decantare il supernatante, asciugare il pellet per 5-10 min in una cappa chimica e dissolva la pallina in 300-500 µ l di tampone privo di endotossina.
   13. Determinare la concentrazione di plasmide misurando l'assorbimento della soluzione a UV 260/280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
       Nota: Preparare il plasmide di espressione GFP usando lo stesso protocollo.

2. la transfezione di cellule HEK293 con plasmidi di espressione NR1-GFP

1. Aliquotare 200 µ l di soluzione di gelatina 2% a ciascuna di una piastra di coltura 48 pozzetti ed incubare la piastra a 37 ° C per almeno 30 min.
2. Aspirare la soluzione di gelatina dalle celle di 5 x 10⁴ HEK293 ben e seme in 200 µ l di terreno di coltura cellulare contenente 10% siero bovino fetale (FBS) in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore fornito con 5% di CO₂ durante la notte.
   Nota: Le cellule sono state contate utilizzando un emocitometro.
3. Il giorno successivo, sostituire il terreno di coltura ha trascorso con 200 µ l di terreno di coltura fresco contenente 10% FBS per pozzetto.
4. Per ogni singolo bene, preparare soluzione A mescolando 100 ng di plasmide NR1-tGFP con 20 µ l terreno di coltura e la soluzione B mescolando 0,8 µ l di reagente di transfezione con 20 µ l di coltura. Moltiplicare il numero di pozzetti necessari per preparare il volume totale per ogni esperimento.
5. Preparare soluzione C con soluzione A e soluzione B ed incubare la miscela a temperatura ambiente per 20-30 min.
6. Aliquotare 40 µ l di soluzione C per ogni bene che contiene le cellule HEK293, agitare delicatamente la piastra e incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore fornito con 5% di CO₂ durante la notte.
7. Verificare che l'espressione della proteina ricombinante NR1-GFP in cellule dell'ospite sotto microscopio a fluorescenza con ingrandimento 40x X-200 (eccitazione/emissione: 482/502 nm) e procedere con il test di immunofluorescenza basati su cellule.
   Nota: Transfect il plasmide di espressione GFP nelle cellule HEK293 usando lo stesso protocollo.

3. cell-based immunofluorescenza

1. Aspirare il medio speso dai pozzetti, quindi lavare ogni pozzetto con 200 µ l di fosfato tampone salino (PBS), tre volte.
2. Aggiungere 200 µ l di soluzione di paraformaldeide 4% ad ogni pozzetto; Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 min.
3. Aspirare la soluzione di paraformaldeide dai pozzetti e lavare ogni bene con 200 µ l di PBS tre volte.
4. Aggiungere 200 µ l di 10% latte scremato in PBST (0.1% Tween-20 in PBS) soluzione per ciascuno ed incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 h con agitazione delicata.
5. Aspirare il latte scremato 10% in soluzione PBST dal pozzo, quindi lavare i pozzetti con 200 µ l PBST una volta.
6. Incubare i pozzetti con plasma diluito (1: 100 in PBST) come l'anticorpo primario con agitazione delicata a temperatura ambiente per 1 h.
   Nota: Il Plasma è ottenuto da sangue di pazienti ritenuti sospetto di avere l'encefalite autoimmune.
7. Aspirare il plasma diluito dai pozzetti e lavare ogni bene con 200 µ l di PBST tre volte.
8. Aggiungere 200 µ l di capra anti-IgG umane, coniugati con Alexa Fluor 594 (1:1, 000 diluizione in PBST) ad ogni pozzetto e incubare la piastra di coltura a RT con agitazione delicata per 1 h.
9. La capra anti-IgG umane, coniugati con Alexa Fluor 594 soluzione di aspirare e lavare ogni bene con 200 µ l di PBST tre volte.
10. Aggiungere 100 µ l di soluzione di glicerolo (glicerolo al 50% in PBS e 1: 100.000 di 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) in ciascun pozzetto.
11. Osservare e le cellule sotto un microscopio a fluorescenza utilizzando un 10 X oculare e 4x, 10x e 20 X obiettivi di immagine.
    Nota: Utilizzare il filtro corretto per ogni colorante: per NR1-GFP (eccitazione/emissione = 482/502 nm), per Alexa Fluor 594 (eccitazione/emissione = 561/594 nm), per DAPI (eccitazione/emissione = 358/461 nm). Condurre il controllo negativo usando le cellule HEK che esprimono GFP nello stesso modo.

Risultati

In media, potremmo ottenere 200-300 µ g plasmide endotossina-libera espressione NR1-GFP e GFP da coltura batterica 250ml seguendo le procedure descritte nella sezione 1 del protocollo. Un importo di 100 ng/pozzetto del plasmide di espressione è stato utilizzato per la transfezione delle cellule HEK293 coltivate nella piastra 48 pozzetti come descritto nella sezione 2 del protocollo. 24-30 h dopo trasfezione, le cellule hanno espresso la NR1-GFP, e proteine ricombinanti GFP potrebbero esse...

Discussione

Ci sono parecchi saggi immunologici basati su celle a schermo la presenza di autoanticorpi diretti contro il recettore NMDA segnalati nella letteratura, compreso immunofluorescenza diretta basati su cellule test¹¹, fissata il test di immunofluorescenza basati su cellule⁹ , e¹⁴di analisi basati su citometria a flusso. Il test di immunofluorescenza diretta basati su cellule deve essere eseguito subito dopo la preparazione delle celle ectopically esprim...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
GRIN1 (GFP-tagged) - Recettore del glutammato umano, ionotropico, N-metil D-aspartato 1 (GRIN1), variante di trascrizione NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	clone NR1-cDNA marcato con sequenze tGFP C-terminali
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	mammifero vettore con tag tGFP C-terminale
Maxi Kit EndoFree Plasmid	Qiagen (Hilden Germany)	12362
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Siero ridotto Medium	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, glucosio alto, piruvato	Thermo Fisher	11995-065
Siero bovino fetale caratterizzato, origine statunitense	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Anticorpo secondario anti-IgG umano di capra (H+L), Alexa Fluor 594 coniugato	Thermo Fisher	A-11014
Controllo positivo: recettore anti-glutammato (tipo NMDA)	Euroimmun AG, Lü beck, Germania	CA 112D-0101
			di test Euroimmun