Articolo metodologico

In Vivo Valutazione dello sviluppo di callo di frattura durante la guarigione dell'osso nei topi utilizzando un MRI-compatibile con osteosintesi per il femore di Mouse

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DOI:

10.3791/56679

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14 novembre 2017

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1Institute of Orthopedic Research and Biomechanics, University Medical Center Ulm, 2RISystem, 3Core Facility Small Animal MRI, University Medical Center Ulm, 4Department of Traumatology, Hand-, Plastic-, and Reconstructive Surgery, University Medical Center Ulm

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La valutazione dello sviluppo del tessuto nel callo di frattura durante endochondral guarigione ossea è essenziale monitorare il processo di guarigione. Qui, segnaliamo l'uso di una risonanza magnetica (RM)-fixator esterno compatibile per il femore del mouse per consentire MRI scansioni durante la rigenerazione ossea nei topi.

Abstract

Guarigione di frattura endochondral è un processo complesso che coinvolge lo sviluppo del tessuto fibroso, cartilagineo e osseo nel callo di frattura. La quantità dei diversi tessuti nel callo fornisce importanti indicazioni riguardanti la frattura che guarisce il progresso. Tecniche disponibili in vivo longitudinalmente monitorare lo sviluppo del tessuto di callo negli studi preclinici di guarigione di frattura utilizzando piccoli animali includono radiografia digitale e formazione immagine di µCT. Tuttavia, entrambe le tecniche sono solo in grado di distinguere tra tessuto mineralizzato e non mineralizzato. Di conseguenza, è Impossibile discriminare cartilagine da tessuto fibroso. Al contrario, la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) Visualizza le strutture anatomiche in base al loro contenuto di acqua e potrebbe quindi essere in grado di identificare in modo non invasivo molli e cartilagine nel callo di frattura. Qui, segnaliamo l'uso di un fixator esterno di MRI-compatibile per il femore del mouse per consentire le esplorazioni di MRI durante la rigenerazione dell'osso in topi. Gli esperimenti hanno dimostrato che il fissatore e un dispositivo di montaggio su misura consentono ripetitive le esplorazioni di MRI, consentendo in tal modo l'analisi longitudinale di sviluppo del tessuto di callo di frattura.

Introduzione

Guarigione della frattura secondaria è la forma più comune di guarigione ossea. È un processo complesso che imita gli aspetti specifici di ontogenic endochondral ossificazione1,2,3. L'ematoma di frattura precoce consiste principalmente di cellule immunitarie, granulazione e tessuto fibroso. Tensione dell'ossigeno basso e alti biomeccanici ceppi ostacolano la differenziazione degli osteoblasti allo spacco frattura, ma promuovono la differenziazione delle cellule progenitrici nei chondrocytes4,5,6. Queste cellule iniziano a proliferare il sito della lesione per formare una matrice cartilaginosa fornendo stabilità iniziale dell'osso fratturato. Durante la maturazione del callo, condrociti diventati ipertrofici, subiscono gli apoptosi, o trans-differenziarsi in osteoblasti. Neovascolarizzazione presso la zona di transizione della cartilagine-osso fornisce i livelli elevati dell'ossigeno, consentendo la formazione di tessuto osseo7. Dopo ossuta colmare il divario di frattura, è aumentata la stabilità biomeccanica e osteoclastica rimodellamento del callo di frattura esterna si verifica per aumento osseo fisiologico contorno e struttura3. Di conseguenza, la quantità di tessuto fibroso, cartilagineo e osseo nel callo di frattura forniscono informazioni importanti sul processo di guarigione dell'osso. Disturbato o ritardata guarigione diventa visibile da alterazioni dello sviluppo del tessuto di callo sia in esseri umani e topi8,9,10,11. Tecniche disponibili in vivo longitudinalmente monitorare lo sviluppo del tessuto di callo in preclinico frattura che guarisce gli studi utilizzando piccoli animali includono radiografia digitale e µCT12,13di imaging. Tuttavia, entrambe le tecniche sono solo in grado di discriminare tra tessuto mineralizzato e non mineralizzato. Al contrario, MRI fornisce tessuti molli eccellente contrasto e potrebbe quindi essere in grado di identificare il tessuto molle e cartilagine nel callo di frattura.

Il lavoro precedente ha mostrato risultati promettenti per post mortem MRI in topi con fratture articolari MRI14 ed in vivo in topi durante la guarigione del difetto osseo intramembranous15. Tuttavia, entrambi gli studi anche dichiarato contrasto di tessuto e risoluzione spaziale limitato. Precedentemente abbiamo dimostrato la fattibilità di MRI ad alta definizione in vivo per la valutazione longitudinale della formazione del callo molle durante la frattura endochondral murino guarigione16. Qui, segnaliamo il protocollo per l'utilizzo di un fixator esterno di MRI compatibili per osteotomia di femore in topi al fine di monitorare lo sviluppo del tessuto di callo longitudinalmente durante la frattura endochondral processo di guarigione. La progettazione di un dispositivo di montaggio su misura per l'inserimento del fissatore esterno assicurato una posizione standardizzata durante le scansioni ripetute.

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Protocollo

tutti gli animali esperimenti rispettate norme internazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dalle autorità di regolamentazione regionale (n. 1250, Regierungspräsidium Tübingen, Germania). Tutti i topi sono stati mantenuti in gruppi di due-cinque animali per gabbia su una leggera 14-h 10-h scuro ritmo circadiano con acqua e cibo fornito ad libitum.

1. preparazione del materiale chirurgico e trattamento preliminare dei topi

materiale
  1. sterilizzare tutto chirurgica. Utilizzare una temperatura di sterilizzazione in autoclave di 120-135 ° C per 20-30 min di tempo di sterilizzazione.
  2. Acquisto C57BL/6 topi o topi da un altro ceppo che sono tra i 19-35 g di peso corporeo. Seguire la cura appropriata degli animali e protocolli sperimentali in conformità con le linee guida nazionali che è approvato dal ricercatore ' s istituzionale Animal Care e Comitato di uso. Consentire un minimo di periodo di acclimatazione di 7 giorni prima di iniziare la procedura.
  3. Fornire l'analgesia per tutti i topi tramite l'acqua potabile un giorno prima dell'intervento chirurgico fino al terzo giorno postoperatorio.

2. Procedura chirurgica e l'applicazione del fissatore esterno

  1. posto il mouse in un tubo precaricato con 5-7% di isoflurano e 60 mL/min di ossigeno. Dopo la perdita di riflessi posturali, rimuovere il mouse dal tubo di induzione dell'anestesia e mantenere l'anestesia tramite una maschera di inalazione fornendo ossigeno isoflurano e 60 mL/min 1-3%.
    1. Monitor la zampa di pattern e posteriori di respirazione riflesso durante l'anestesia. Assicurarsi che la frequenza respiratoria è circa 100 cicli/min e il riflesso della zampa posteriore è assente.
      ​ Nota: la quantità di gas necessaria dipende da età, sesso, peso corporeo e ceppo del mouse.
  2. Prima della chirurgia, iniettare il mouse con una singola dose di antibiotici per via sottocutanea (Clindamicina, 45 mg/kg). Inoltre, per il mantenimento dell'equilibrio fluido fisiologico, iniettare il mouse con un deposito di fluida sottocutaneo di soluzione fisiologica 500 µ l (0,9% NaCl).
  3. Per prevenire corneale asciugatura, applicare unguento oculare agli occhi del mouse. Posizionare il mouse su una piastra riscaldante a 37 ° C durante l'anestesia e la procedura chirurgica per mantenere la fisiologica temperatura corpo.
  4. Rimuovere la pelliccia dalla destra dell'arto e strofinare l'area chirurgica con un disinfettante a base alcolica. Coprire la zampa destra posteriore con una piccola parte di un guanto sterile per evitare zone non sterili. Disinfettare l'arto posteriore destra tre volte. Posizionare un telino sterile sopra il mouse intero ad eccezione dell'area chirurgica.
  5. Incise la pelle circa 1 cm longitudinalmente lungo il lato anteriore del femore di destra con un bisturi. Separare con pinze e forbici micro senza mezzi termini il m. bicipite femorale e il m. lateralis vastus. Tagliare il lato di origine del tendine presso il trocantere del femore con una micro forbice per consentire il libero accesso alla parte anterolaterale dell'osso. Assicurarsi che il nervo sciatico è conservato.
  6. Posizionare il fixator esterno (rigidezza assiale di 3 N/mm, Figura 1 A) parallelamente al femore. Perforare i fori attraverso la corteccia con una punta da 0,45 mm e posizionare la ceramica perni di montaggio in pozzi trivellati manualmente. Iniziare con il perno più prossimale, seguita dal pin più distale e i due perni in mezzo.
    1. Assicurarsi che non ci sia nessuna tensione, compressione o sollecitazione di taglio sul fixator durante le operazioni di montaggio, altrimenti il divario di osteotomia raggiunto non sarà sufficiente a causa del rilassamento del fissatore.
  7. Umidificare l'osso con una piccola quantità di soluzione sterile di NaCl per evitare la disidratazione durante la procedura di sawing.
  8. Creare un osteotomy di 0,4 mm attraverso l'intero osso tra i due pin all'interno utilizzando una sega a filo gigli 0,4 mm.
    Nota: Facoltativamente, una sega oscillante micro può essere utilizzata per creare l'osteotomia. Assicurarsi di evitare eventuali trucioli di metallo dalla sega nella zona di osteotomia.
  9. a filo il divario di osteotomia attentamente con 2 mL di soluzione sterile di NaCl per rimuovere frammenti ossei tra le due cortecce fratturate.
  10. Adattare i muscoli utilizzando una sutura continua con una sutura riassorbibile (Vedi Tabella materiali). Quindi adattare la pelle utilizzando interrotte suture non riassorbibili (Vedi Tabella materiali). Per evitare ferita mordere, non collocare la sutura sulla parte della ferita cranica.
    Nota: Non usare la colla di pelle o clip poiché topi solitamente rimuoverlo dalla ferita che causa ulteriori danni alla pelle.
  11. Pulire l'area chirurgica con un disinfettante e posizionare il mouse nella sua gabbia. Monitor mouse e fornitura sufficiente calore (ad es. dalla luce infrarossa) fino a quando è completamente sveglio. monitorare il peso corporeo, assunzione di cibo e acqua dopo l'intervento chirurgico per Assicurarsi che l'animale non è nel dolore e afflizione. Fornire l'analgesia per tutti i topi tramite l'acqua potabile fino al terzo giorno postoperatorio.
    Nota: Topi possono essere alloggiati in gruppi di fino a quattro animali.
  12. Monitorare il mouse ' attività s giorni 1-5 dopo la chirurgia. Durante quel tempo, il mouse dovrebbe sopportare il peso sull'arto operato. In caso contrario, il mouse dovrà essere esclusi da ulteriori analisi.

3. Procedura MRI e analisi di immagine

  1. prima del MRI scansione procedura, anestetizzare il mouse secondo il protocollo ai punti 2.1 e 2.3 e mantenere il tasso respiratorio circa 100 cicli/min inserire il fixator esterno presso la destra dell'arto posteriore della mouse con attenzione in un dispositivo di montaggio su misura ( Figura 1 B, C).
    1. Assicuratevi di evitare piegature o compressione del fissatore durante questo passaggio poiché questo potrebbe interferire con la guarigione della frattura.
      Nota: Le esplorazioni di MRI possono essere condotta già nel 3 giorni dopo l'intervento, a seconda della cura degli animali e il protocollo sperimentale.
  2. Posizionare il mouse su una culla a temperatura controllata per introduzione nel dispositivo MRI. Collegare il dispositivo di montaggio rigidamente alla bobina testa di quattro elementi.
  3. Dati di MRI acquisire utilizzando un sistema di MRI dei piccoli animali ad alto campo dedicato operanti a 11,7 T.
    ​ Nota: geometria di acquisizione dati il MRI è allineato con l'osso del femore, ortogonalmente alle viti.
    1. Acquisire dati applicando una protone-densità grasso-soppresse multi-slice TSE sequenza di (PD-TSE) utilizzando parametri di acquisizione: Eco/ripetizione tempo TE = 5,8 ms/TR = 2.500 ms, risoluzione Δr = 52 × 52 × 350 µm³, campo di vista (FOV) = ² di 20 × 20 e larghezza di banda Δω = 150 KHz.
    2. Nota: il tempo di acquisizione totale per 22 fette è 36 min.
  4. Aprire i dati acquisiti con software di analisi di immagine. Immettere la dimensione del voxel come 0.05 x 0.05 x 0,35 mm 3. Segmentare i vari tessuti nel callo di frattura (osso, cartilagine, tessuto fibroso/midollare) basati sulla loro intensità con soglia semi-automatica come segue.
    1. Clic il " modifica nuova etichetta campo ", fare clic " aggiungere materiale " e rinominare il materiale a " callo ". Distinguere la zona di callo dai tessuti circostanti basati sul segnale IPO-intenso dal periostio utilizzando il " lazo " strumento.
    2. Clic " aggiungere al materiale ". Fare clic " aggiungere materiale " e rinominare il materiale a " cartilagine ". La cartilagine del segmento utilizzando il " soglia " strumento e " selezionare solo materiale corrente " da " callo ". Fare clic su " cartilagine " e " aggiungere al materiale ". Ripetere la procedura con " osso " e " del tessuto del midollo osseo/fibroso ".
  5. Generare ricostruzioni 3D dei femori fratturati sulla base dei dati di segmentazione dei tessuti utilizzando software di analisi di immagine. Fare clic su " superficie di generare ", applicare " nessuno " per " tipo di levigatura " e fare clic su " superficie vista ".
    Nota: Molto piccoli, iper-intense aree circostanti la enDS delle cortecce fratturate rischiano di essere artefatti a causa la transizione da ossuto al tessuto molle. Queste aree dovrebbero escludersi da ulteriori analisi. Hyper-intenso aree al centro la frattura callo durante la fase di endochondral della frattura che guarisce rappresentano tessuto cartilaginoso. Zone di IPO-intenso presso il callo di frattura distale dal gap osteotomia nella fase di ossificazione endochondral e zone con la stessa intensità in tutto il callo di frattura intero alle fasi di guarigione più tardi rappresentano tessuto di recente formazione di callo osseo. Anche se queste aree hanno un segnale IPO-intenso, l'intensità di segnale da osso maturo (corteccia) è ancora più basso. Dopo la soglia l'intensità del segnale per il tessuto osseo e tessuto cartilagineo nel callo di frattura, contrassegnare il tessuto restante come midollo osseo e del tessuto fibroso. Sono i valori per la segmentazione di tessuto: tessuto ossuto (tra cui corteccia matura, trabecular dell'osso ed il tessuto di callo osseo) è segmentato all'interno della gamma di 1-3.3 (intensità del segnale normalizzato alla corteccia matura), tessuto del midollo osseo/fibroso all'interno della gamma di 3.4-5.4, e tessuto cartilagineo callo all'interno della gamma di 5.5-6.2.
  6. Se necessario, ripetere la scansione MRI longitudinalmente durante il processo di guarigione di frattura. Per monitorare lo sviluppo del callo cartilagineo, scansione i topi nei giorni 10, 14 e 21 dopo chirurgia.
    Nota: I punti di tempo possono dipendere dalla cura degli animali e il protocollo sperimentale.

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Risultati

In primo luogo, il successo della procedura chirurgica può essere confermato dall'analisi delle scansioni MRI (Vedi esempio nella Figura 2). Tutti i quattro perni devono essere posizionati al centro del pozzo femorale. La dimensione del gap osteotomia deve essere compresa tra 0,3-0,5 mm. Se la dimensione del gap osteotomia varia notevolmente da questi valori, il mouse deve essere escluso da ulteriori analisi.

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Discussione

Le modifiche e la risoluzione dei problemi:

L'obiettivo principale di questo studio era di descrivere un protocollo per l'utilizzo di un fixator esterno di MRI compatibili per osteotomia di femore nel topo con la possibilità di monitorare lo sviluppo del tessuto di callo longitudinalmente durante il processo di guarigione di frattura endochondral. La progettazione di un dispositivo di montaggio su misura per l'inserimento del fissatore esterno assicurato una posizione standard...

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Dichiarazioni

L'autore Romano Matthys è un dipendente della RISystem AG Davos, Svizzera che produce la protesi e impianti specifici strumenti utilizzati in questo articolo. Tutti gli altri autori non hanno concorrenti finanziari interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo Sevil Essig, Stefanie Schroth, Verena Fischer, Katja Prystaz, Yvonne Hägele e Anne Subgang per il supporto tecnico eccellente. Ringraziamo anche la Fondazione di ricerca tedesca (CRC1149, INST40/499-1) e la Germania di AO Trauma Foundation per il finanziamento di questo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubo per anestesiaFMI, Seeheim, GermaniaZUA-82-ANA-TUB-Mouse
Macchina per anestesia FMI, Seeheim, GermaniaZUA-82-GME-MA
Pinza per arteriaAesculap, Tuttlingen, GermaniaBH104R
AutoclaveSystec, Wettenberg, GermaniaDX-150
Imballaggio per autoclaveStericlin, Feuchtwangen, Germania2301-04/06/10/12/16
Avizo softwareFEI, Burlington, USA-Versione8.0.1
BioSpec 117/16 sistema di risonanza magneticaBruker Biospin, Ettlingen, Germania117/16
Morsetto Bulldog Aesculap, Tuttlingen, GermaniaBH 021R
Bisturi in acciaio al carbonio n. 11/15Aesculap, Tuttlingen, GermaniaBA211/215
Perno di montaggio in ceramica 0,45 mm RISystem, Davos, SvizzeraHS691490
Clindamicina (300 mg / 2ml)Ratiopharm, Ulm,Germania-Pinze
per medicazione 115 mm Aesculap, Tuttlingen, GermaniaBD210R
Pinza per medicazione 130 mm Aesculap, Tuttlingen, GermaniaBD025R
Punta da trapano rivestita 0,45 mm RISystem, Davos, SvizzeraHS820420
Porta aghi Durogrip 125 mm Aesculap, Tuttlingen, GermaniaBM024R
Foliodrape Hartmann, Heidenheim, Germania2513026
FrekadermFresenius, Bad Homburg, Germania4928211
sega Gigli 0,44 mm RISystem, Davos, SvizzeraRIS.590.110.25
Trapano a manoRISystem, Davos, SvizzeraRIS.390.130-01
Piastra riscaldante FMI, Seeheim, GermaniaGuanti IOW-3704
HygonormHygi, Telgte, Germania2706
IsofluraneAbbot, Londra, Regno UnitoForene
Micro pinze 155 mm Aesculap, Tuttlingen, GermaniaBD343R
Micro forbici 120 mm Aesculap, Tuttlingen, GermaniaFD013R
Mouse FixEx L 0,7 mm RISystem, Davos, SvizzeraRIS.611.300-10
Custodia per aghi per trapani Aesculap, Tuttlingen, GermaniaBL911R
Porta aghiAesculap, Tuttlingen, GermaniaBB078R
OcteniseptSchü lke, Norderstedt, Germania121403
software OsirixPixmeo SARL, Bernex,Svizzera-Versione4.0
Ossigeno, grado medicoMTI, Ulm,Germania-Resolon
5/0Resorba, Nü rnberg, Germania88143
Soluzione salina 0,9%Braun, Melsungen, Germania3570350
Manico bisturi 125 mmAesculap, Tuttlingen, GermaniaBB073R
Forbici 150 mm Aesculap, Tuttlingen, GermaniaBC006R
Sigillante per imballaggio in autoclave Hawo GmbH, Obrigheim, GermaniaHM500
Sterican 27 G Braun, Melsungen, Germania4657705
Lame chirurgiche sterili n. 11/15 Aesculap, Tuttlingen, GermaniaBB511/515
Guanti chirurgici Hartmann, Heidenheim, GermaniaPeha-micron 9425712
Lampada chirurgicaMaquet SA, Ardon, FranciaLinea blu 80
siringhe 5 ml Braun, Melsungen, GermaniaInjekt 4606051V
Pinze per tessuti 80 mmAesculap, Tuttlingen, GermaniaOC091R
Tramadolo 25 mg/lGrü nenthal, Aquisgrana, Germania100mg/ml
Vasofix Sicurezza Braun, Melsungen, Germania4268113S-01
Vicryl 5-0 Ethicon, Norderstedt, GermaniaV30371
Unguento per gli occhi Visdisic Bausch & Lomb, Berlino, Germania3099559

Riferimenti

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