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Summary

Questo protocollo descrive un sistema di espressione di proteina indotta da scossa di calore (sistema pDHsp/V5-His/sf9 cellulare), che può essere utilizzato per esprimere proteine straniere o per valutare l’attività anti-apoptotica di potenziali proteine straniere e loro troncato amminico acidi in cellule di insetto.

Abstract

Il sistema di espressione genica transitoria è una delle tecnologie più importanti per l’esecuzione di analisi funzionale della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Questo sistema è stato sviluppato per esprimere stranieri geni sotto il controllo del promotore baculovirus in plasmidi di espressione transiente. Inoltre, questo sistema può essere applicato a un’analisi funzionale del baculovirus sé o proteine straniere. Il sistema di espressione genica transitoria più ampiamente e commercialmente disponibile è sviluppato sul promotore del gene immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Tuttavia, è stato osservato un livello basso di espressione di geni estranei in cellule di insetto. Di conseguenza, un sistema di espressione genica transitoria è stato costruito per migliorare l’espressione della proteina. In questo sistema, plasmidi ricombinanti sono stati costruiti per contenere la sequenza di destinazione sotto il controllo del promotore (Dhsp70) 70 di Drosophila calore shock. Questo protocollo presenta l’applicazione di questo calore shock-base pDHsp/V5-His (epitopo V5 con 6 istidina) /Spodoptera frugiperda cell sistema (sf9 cella); Questo sistema è disponibile non solo per l’espressione genica ma anche per valutare l’attività anti-apoptotica di candidato proteine in cellule di insetto. Inoltre, questo sistema può essere sia transfected con un plasmide ricombinante o co-trasfettate due plasmidi ricombinanti potenzialmente funzionalmente antagonistiche in cellule di insetto. Il protocollo dimostra l’efficienza di questo sistema e fornisce un caso pratico di questa tecnica.

Introduction

Due sistemi di espressione della proteina sono stati comunemente utilizzati per la produzione di proteine: sistemi di espressione proteica prokaryote (sistema di espressione del gene diEscherichia coli ) e sistemi di espressione della proteina dell’eucariota. Un sistema di espressione della proteina eucariote popolare è il baculovirus espressione vettoriale sistema (BEVS)¹. Baculoviridae in primo luogo sono stati usati come agenti di controllo biologico in tutto il mondo dell’agricoltura e della foresta di parassiti. Negli ultimi decenni, Baculoviridae sono stati sviluppati come strumenti biotecnologici per vettori di espressione di proteine pure. I genomi di Baculoviridae sono costituiti da DNA circolare a doppia elica e avvolti i nucleocapsids². Ad oggi, più di settantotto baculovirus isolati sono state sequenziate³. Basato sulla cascata temporale di baculovirus espressioni di gene in cellule di insetto ospitante, trascrizione genica poteva essere classificata in quattro cascate temporale, compreso immediati-presto, geni di in ritardo-inizio, fine e molto fine⁴.

BEVSs sono stati indicati in modo che i promotori di geni molto tardi (cioè, poliedro o p10 promotore) sono stati usati per guidare i geni bersaglio, mentre il baculovirus ricombinanti è stato generato da una ricombinazione omologa. Espressione delle proteine straniere in cellule di insetto di baculovirus ricombinanti è simile a quella delle proteine dei mammiferi a modificazioni post-traduzionali (adatti per la produzione di glicoproteina). Così, il baculovirus è stato ampiamente usato^5,6,7. Tuttavia, una limitazione è la presenza di vie di N-glicosilazione differenti in cellule di insetto⁷.

Di conseguenza, un nuovo sistema di espressione di baculovirus, il sistema di espressione del gene transitoria, è stato sviluppato. Questo sistema esprime geni estranei sotto l’unità di baculovirus immediati-presto promotori (promotore diie-1 ) in cellule di insetto. Utilizzando questo sistema, la proteina bersaglio può essere espresso immediatamente sotto il controllo del promotore ie-1 durante la modifica la via di N-glicosilazione in cellule di insetto, con conseguente migliore oligosaccaridi N-collegati⁷. Inoltre, geni immediati-presto baculovirus sono trascritti dalla RNA polimerasi II cellula ospite e non richiedono alcun fattore virale per attivazione⁴. Di conseguenza, proteine straniere possono essere espresso in cellule di insetto in breve tempo. Ad oggi, il transitorio sistema di espressione genica è una delle tecnologie più importanti per l’esecuzione di saggi funzionali della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Il sistema può essere applicato per analizzare la funzione di baculovirus o proteine straniere. Uno dei sistemi di espressione genica transitoria commercialmente disponibile si basa sui promotori di geni immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 e OpIE1 promotori).

Tuttavia, il livello inferiore di espressione di geni estranei in cellule di insetto era ancora un problema quando il sistema di espressione del gene transitoria basata sul promotore di OpIE è stato usato^8,9,10. Così, un altro sistema di espressione genica transitoria è stato costruito in base il promotore della drosofila calore shock protein 70 (hsp70) gene di^8,9. Il promotore di hsp70 funziona più efficientemente di baculovirus IE promotore quando indotta da shock termico in cellule di insetto¹⁰. In questo sistema, sono stati espressi i geni bersaglio sotto l’unità del promotore di Drosophila heat shock 70 (Dhsp70). Geni estranei possono essere facilmente clonati nel plasmide di espressione genica transitoria con i metodi di clonazione PCR-basati. Inoltre, il controllo di temporizzazione per l’espressione genica può essere eseguito tramite induzione di scossa di calore.

In questo rapporto, seguiamo l’approccio ed esprimere tre diversi troncamenti del gene di baculovirus (inibitore dell’apoptosi 3, iap3 da Lymantria xylina MNPV) utilizzando il sistema di espressione basati su scossa transitoria della proteina di calore e applicare ulteriormente queste proteine espresse sulla analisi delle attività anti-apoptotica. Questo sistema può sia esprimere proteine straniere rapidamente o essere applicato alla valutazione delle attività anti-apoptotica della proteina in cellule sf9, pur avendo anche il potenziale per essere applicato ad altre analisi di attività della proteina.

Protocol

1. preparati Coltura delle cellule dell’insetto Preparare 50 mL di mezzo di coltura cellulare. A tale scopo, aggiungere 500 µ l di antibiotici (anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicillina = 100 unità/mL, streptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL di siero bovino fetale inattivati al calore nel mezzo di coltura privo di siero cellulare (senza FBS o antibiotici).Nota: Riscaldare il siero bovino fetale a 65 ° C per 30 min in un bagno di acqua prima dell’uso. Mantenere Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), cellule di insetto sf9. Staccare ca. 80% delle cellule dal matraccio di cultura di 25cm2 cella agitando la beuta e verifica nell’ambito di microscopia. Quindi, trasferire 50% della sospensione delle cellule in un pallone di cultura cellulare di nuovo 25 cm2 e permettono alle cellule di allegare per 15 min a temperatura ambiente. Sostituire il mezzo con terreno di coltura di cellule fresche 5ml e crescere in un incubatore a 28 ° C. Cellule di passaggio ogni 2 o 3 giorni a seconda della crescita delle cellule. Preparazione di plasmidi per la transfezione delle cellule Per inserire i frammenti di DNA bersaglio (ad es., Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gene e suoi costrutti di eliminazione) in pDHsp/V5-His PCR-basata clonazione metodo11. Controllare la crescita di colonie trasformate dalla Colonia PCR usando PCR Master Mix (2 X) e il primer pDhsp-F2/Op-IE2R impostata. Confermare le sequenze di plasmide dal servizio commerciale sequenziamento.Nota: La tabella 1 elenca i primers utilizzati per PCR e i costrutti corrispondenti. Colonie batteriche sequenziate unica di cultura, che contengono le costruzioni di cui sopra plasmide (punto 1.2) in 200 mL LB medium contenente selezionato antibiotici (50 µ g/mL), rispettivamente. Estrarre i plasmidi dalla colta e. coli utilizzando Midi plasmide Kit secondo istruzioni12 del produttore. Preparare mezzo di placcatura con 1,5 mL di terreno di coltura cellulare e 8,5 mL di mezzo di coltura privo di siero cellulare. Preparare il terreno di coltura cellulare actinomicina D (ActD) aggiungendo 1,5 µ l di brodo ActD (1 mg/mL) in 10 mL di terreno di coltura cellulare (concentrazione finale = 150 ng/mL). Conservare a 4 ° C. 2. espressione transiente proteina Semina cellulare Raccogliere le cellule sf9 agitando il matraccio di cultura, rovesciare e cadere la sospensione cellulare per tubo da 50 mL e trasferire 10 µ l in emocitometro mediante una pipetta P10. Contare il numero delle cellule al microscopio ottico. Piastra 3 × 105 sf9 cellule in tutti i pozzetti in una piastra a 24 pozzetti per 15 min a temperatura ambiente. Sostituire il mezzo con 0,5 mL di mezzo di placcatura. Transfezione di plasmidi Reagente di transfezione cellulare diluito: diluire 8 µ l di reagente di transfezione delle cellule in 100 µ l mezzo di coltura privo di siero cella e mescolare nel Vortex per 1 s. Aggiungere 2 µ g del DNA del plasmide (pDHsp70-Ac-P35/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-anello/V5-His) in 100 µ l di terreno di coltura cellulare privo di siero e mescolare nel Vortex per 1 s (Figura 2). Combinare il DNA del plasmide diluito e reagente di transfezione delle cellule diluito (210 µ l) e mescolare nel Vortex per 1 s. Incubare per 30 min a temperatura ambiente. Aggiungere 210 µ l di miscela di reagente di transfezione del DNA goccia a goccia sulle celle mediante una pipetta P1000. Incubare a 28 ° C per 5 h. Sostituire il mezzo di placcatura con 0,5 mL di mezzo di coltura cellulare utilizzando una pipetta P1000. La piastra a 24 pozzetti con nastro adesivo ed incubare le cellule a 28 ° C per 16 h. Le cellule trasfettate di scossa di calore: mettere il piatto in un bagno d’acqua di 42 ° C (galleggianti sulla superficie dell’acqua). Riscaldare per 30 min e riporre la piastra a 24 pozzetti nell’incubatore di 28 ° C. Rilevazione dell’espressione della proteina Dopo 1 h o shock termico 5h, lavare le cellule con 0,5 mL di tampone PBS 1X brevemente tre volte.Nota: Diluire il tampone PBS 1x tampone PBS 10X aggiungendo 1 mL di tampone PBS 10X a 9 mL sterilizzato ddH2O Lisare le cellule con 40 µ l di 1 x tintura di caricamento SDS pipettando su e giù.Nota: Diluire 4 x tintura di caricamento SDS miscelando 30 µ l di tampone PBS 1X e 10 µ l di tampone campione SDS: 4x. I campioni della proteina a 98 ° C per 10 min in un blocco di calore di calore, rotazione verso il basso per 1 min e messo sul ghiaccio per l’analisi di Western blot. Western blot analisiSeguire la procedura di analisi occidentale della macchia da Eslami e Lujan13. Eseguire gel SDS-PAGE14: un gel sottoposto al blu di Coomassie macchiatura (controllo di carico per verificare che la quantità di proteina campioni caricati in ogni bene è uguale in quantità) e l’altro sottoposti a Western blot test, secondo Eslami e Lujan13 . Rilevare le proteine di fusione V5-taggati con anticorpo di coniglio anti-V5 (5 mg/mL) (diluizione 1: 5000 nel buffer di TBST a lavorare concentrazione 1 µ g/mL) e coniugato di capra anti-coniglio IgG-rafano perossidasi (HRP) (0,8 mg/mL) (diluizione 1: 10000 nel buffer TBST per lavoro concentrazione 0.08 µ g/mL).Nota: Regolare la percentuale di poliacrilammide al 17,5% quando il peso molecolare della proteina sia < 17 kDa. 3. anti-apoptotiche analisi di attività Apoptosi cellulare indotta da gene: ripetere la procedura di cui sopra da 2.1 a 2.3. Co-transfect 1 µ g di DNA (gene di induttore di apoptosi contenenti) pDHsp/D-rpr/bandiera-His plasmide con 1 µ g di DNA plasmidico [pDHsp70/V5-His vector (controllo negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controllo positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-anello/V5-His, rispettivamente.]. Alle 5h post-calore trattamento d’urto, condurre l’analisi di attuabilità delle cellule (Figura 2). Apoptosi cellulare indotta da chimica: ripetere la procedura di cui sopra da 2.1 a 2.3. Al punto 2.1.2, piastra 1 x 106 sf9 celle in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Transfect 4 µ g di DNA plasmidico [pDHsp70/V5-His vector (controllo negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controllo positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-anello/V5-His, rispettivamente.]. A scossa di post-calore 5h, trattiamo sf9 cellule con 2 mL di terreno di coltura cellulare ActD per 16 h e condurre l’analisi di attuabilità delle cellule (Figura 2).Nota: Volume minimo per coprire un pozzetto della piastra a 6 pozzetti è di 1 mL. Eseguire gli esperimenti di analisi attività anti-apoptotica sopra, tra cui 3.1 e 3.2 in triplici copie. 4. cellule Lavare le cellule trattate con l’aggiunta di 1 mL di tampone PBS 1X per 1 min 3 volte. Risospendere le cellule pipettando 1 mL di tampone di PBS 1x contenente blu di trypan 0,04% e macchia per 3 min a temperatura ambiente. Trasferire la sospensione cellulare in una microprovetta 1,5 mL.Nota: 0,4% trypan blu soluzione diluita da 9 mL di 1X PBS buffer e 1 mL 0,4% trypan blu soluzione di miscelazione. Trasferire 10 µ l trypan blu-macchiato cella sospensione per l’emocitometro con una pipetta P10 e contare le cellule vitali intatti sotto un microscopio chiaro. Analisi statistica Calcolare i dati registrati e presentare come il mezzo ± S.D. per tutti i conteggi. Analizzare i dati utilizzando il test di Student a due code t di con Microsoft Excel. Definire i dati statisticamente significativi come P-valore < 0.05.

Representative Results

L’intera lunghezza e altri due troncamenti (domini BIR e anello) di Ly-IAP3 da LyxyMNPV overexpressed in cellule sf9, basato sul calore shock-base pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda (sf9 cella) sistema di celle. Il pDHsp/V5-His conteneva un promotore di un proteina di scossa calore di Drosophila , che aziona l’espressione genica a valle ad una temperatura di 42 ° C condizione utilizzando fattori trascrizionali cellulari e la traduzione del sistema (<strong class="xfig"…

Discussion

Il concetto di sistema basati su shock cellulare pDHsp/V5-His/sf9 calore era in primo luogo descritto da Clem et nel 1994⁸. Confronto del promotore del gene di baculovirus (IE1) e Drosophila hsp70 ha mostrato che quel hsp70 aveva una maggiore efficienza nella zanzara cellule¹⁰. Inoltre, a causa dell’induzione di scossa di calore, la tempistica dell’espressione della proteina potrebbe essere controllata precisamente dopo trattamento di sho…

Materials

Antibiotic-Antimycotic, 100X	Gibco	15240-062	for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	serum-free cell culture medium
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
25cm2 cell culture flask	Nunc, Thermo Fisher	156340
Inverted light microscopy	WHITED	WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller)	Bioman	LBL407
Agar, Bacteriological Grade	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	selection antibiotic
PCR Master Mix (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)	Geneaid	PIE25
Actinomycin D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL tubes
Hemocytometer	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	142475	24-well plate
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher	10362100	cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4×SDS Loading Dye	Bioman	P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)	Merck Milipore	IPVH00010	PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system	BIO-RED	1703930	Blotting device
Ponceau S solution	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	145380
0.4 % trypan blue solution	AMRESCO	K940-100ML
P10 pipetman	Gilson	F144802
P1000 pipetman	Gilson	F123602
Tape	Symbio	PPS7	24 well tape ( 19 mm×36 M)