Dissezione e cultura Explant della Allantois murino per l'analisi In Vitro di allantoico allegato

Sommario

Descriviamo un test in vitro per allegato corio-allantoidea di modello, il primo passo nella formazione della placenta. Il protocollo dimostra la cultura dissezione ed espianto di murino allantoides su integrina α4β1 immobilizzato. Allegato allantoide viene valutato microscopicamente a intervalli di tempo predeterminati.

Abstract

La placenta è essenziale per la crescita e lo sviluppo degli embrioni dei mammiferi. Per questo motivo, numerose alterazioni genetiche e probabili insulti anche ambientali che disturbano lo sviluppo della placenta o funzione possono causare perdita iniziale di gravidanza nei topi e nell'uomo. Tuttavia, mancano semplice in vitro test per lo screening per i potenziali effetti sulla formazione della placenta. Qui, ci concentriamo sulla modellazione il primo e fondamentale passo nella formazione della placenta, che consiste dell'attaccamento del allantois di chorion. Descriviamo un metodo per valutare rapidamente l'attaccamento degli espianti allantoico su integrina α4β1 immobilizzato, che funge da un substrato chorio-mimetici. Questo approccio in vitro consente una valutazione qualitativa dell'allegato e diffondendo il comportamento di più allantoide espianti in diversi momenti consecutivi. Il protocollo può essere utilizzato per studiare l'effetto di mutazioni mirate del mouse, droghe o vari fattori ambientali che sono stati collegati alle complicanze della gravidanza o perdita fetale su allantoide allegato ex vivo.

Introduzione

La placenta è indispensabile per la crescita embrionale e sviluppo nell'ambiente uterino. Esso costituisce l'interfaccia per ossigeno, metabolita e scambio di nutrienti tra la circolazione fetale e materna e anche funzioni come un organo endocrino e immunologico. Qualsiasi insulto endogena o esogena che altera lo sviluppo placenta può portare a ritardo di sviluppo intrauterino, perdita fetale o complicazioni di gravidanza, sia in topi ed in esseri umani¹. Mentre il numero di mutazioni mirate del mouse che causano fisiologia placenta anormale continua ad aumentare di², con 219 genotipi attualmente elencati nel sito Web del Mouse Genome Informatics (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), molti di questi fenotipi non sono ben compresi da un punto di vista meccanicistico. Oltre alle alterazioni genetiche, anticorpi monoclonali, farmaci, tossine, agenti patogeni, metaboliti in eccesso o vari agenti ambientali possono influenzare lo sviluppo della placenta e funzione^{3,4,5 , 6 , 7}. ancora, semplice in vitro dosaggi che modello passaggi critici nello sviluppo della placenta sono scarse.

Murino sviluppo placenta è iniziato nella prima metà, quando l'allantoide (il precursore dello sviluppo del cordone ombelicale) emerge dalla parte posteriore dell'embrione come un germoglio che cresce verso il corion⁸. Chorioadhesive cellule nello strato esterno del germoglio allantoico mediano l'allegato e la diffusione della allantois sulla superficie del corion (corio-allantoidea "fusione"). Il corion successivamente piega in villi in cui il sistema vascolare della allantois cresce per formare il labirinto, lo strato interno placenta, dove le sostanze nutrienti e l'ossigeno vengono scambiati tra sangue materno strettamente giustapposti sinusoidi e vasi embrionali^{9 ,10}.

L'attaccamento della allantois al corion è il passo iniziale e fondamentale nella formazione del labirinto, e difetti di questo processo sono tra le cause più comuni di mortalità embrionale in midgestation¹. Anche se un numero di mutanti del topo con stato descritto dove chorioallantoic allegato non riesce a verificarsi¹⁰, e il database MGI attualmente elenca 108 mutanti del topo che sono caratterizzati dalla fusione di corio-allantoidea anormale (http:// www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), l'interazione intercellulare tra vascolare delle cellule adesione molecule-1 (VCAM-1, espressa il mesoderma allantoico) e integrina α4β1 (espressa su corionico mesotelio, che è derivato da mesoderm extraembryonic) sembra essere indispensabile per chorioallantoic allegato e fusione^11,12,13. La macchiatura di Immunohistochemical di embrioni di selvaggio-tipo intero-monta ha dimostrato che VCAM-1 è espresso all'interno di due terzi distali del gambo allantoico al giorno circa embrionale (E) 7.5¹³ (1-4 fase somite), e che la sua espressione rimane elevato durante il collegamento corio-allantoidea e - fusion^11,12. Fallimento di allantoico attaccamento al corion viene in genere rilevata dalle analisi istologiche dei germogli di utero. Tuttavia, allantoide dimensioni sono fisiologicamente altamente variabile in mezzo e anche all'interno di cucciolate della stessa fase inerente allo sviluppo¹⁴e allantois possibile collegare solo il corion quando ha raggiunto una dimensione sufficiente per rendere il contatto fisico. Riflettendo questa variabilità naturale, corio-allantoidea allegato si svolge qualche tempo tra ~ E 8.0 e 9.0 E nell'uteroe una valutazione statisticamente affidabile di questo processo dall'istologia dipende pertanto l'analisi di un gran numero di conceptuses per ottenere abbastanza campioni presso lo stadio di sviluppo appropriato.

Qui, descriviamo un metodo per valutare allantoico allegato ex utero che è meno dipendente dalle dimensioni allantoide. Dimostriamo la dissezione di embrioni di topo e loro allantoides dalla uterina di topi incinta ~ 8 giorni post coitum del (dpc; dpc 0,5 indica il rilevamento di un plug vaginale), e la successiva cultura di allantoide espianti su α4β1 immobilizzato integrine. Questo metodo consente una valutazione rapida e funzionale l'allegato e diffondendo il comportamento degli espianti di allantoide multipli in parallelo e in diversi momenti successivi. Il protocollo può essere utilizzato per schermare per gli effetti di vari fattori ambientali, farmaci o mutazioni mirate su allantoide allegato ex vivo.

Protocollo

Allevamento del mouse è stato approvato dalla Regierung Unterfranken, e tutte le analisi sono state effettuate in conformità con tutti i tedesco e Unione europea leggi e normative applicabili relative alla cura e utilizzo degli animali da laboratorio.

1. rivestimento di microtitolo piastre con integrina α4β1 per Ex Utero Allantois Explant cultura

1. Ricostituire l'integrina α4β1 murino liofilizzato a 200 µ g/mL in soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS). Diluire a una concentrazione finale di 10 µ g/mL in pre-riscaldato (37 ° C) PBS. Pipettare 20 µ l/pozzetto di soluzione integrina α4β1 diluito nel numero necessario di pozzetti di una piastra microtiter (1 allantoide/pozzetto).
   Nota: Evitare la formazione di bolle d'aria quando rivestimento dei pozzetti di micropiastre.
2. Incubare le piastre di microtitolazione per 60 min a 37 ° C mettendoli in un incubatore umidificato coltura del tessuto.
3. Aspirare accuratamente il surnatante con una pipetta. Utilizzare aspirazione delicata e inclinare il piatto per evitare di toccare il fondo con la punta della pipetta. Lavare i pozzetti due volte aggiungendo 50 µ l di terreno di coltura pre-riscaldata (37 ° C) come di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) e rimuovere il mezzo di lavaggio di aspirazione delicata.
4. Passaggio critico: blocco siti di legame con l'aggiunta di 50 µ l/pozzetto di 0,1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) / DMEM ed incubare per 30 min a 37 ° C ≥ inserendo le piastre di microtitolazione in un'incubatrice umidificata tessuto coltura.
   Nota: Espianti Allantois possono allegare a varie superfici in presenza di siero. È quindi imperativo per bloccare i siti di legame non specifico, dopo la verniciatura i pozzetti con integrina e prima di aggiungere l'allantoide sezionati per explant cultura nel liquido contenente siero medio (Vedi punto 4.4).
5. Tenere i pozzetti coattati la soluzione bloccante a 37 ° C fino a quando necessario al punto 4.4.

2. utero dissezione da un Mouse incinta al Dpc 8

Nota: Ridurre i tassi di gravidanza falso positivo da peso guadagno discriminazione¹⁵.

1. Sacrificare il mouse di dislocazione cervicale. Disinfettare il cappotto nella zona addominale spruzzando con etanolo al 70% (v/v).
   Nota: Indossare guanti durante la manipolazione di topi. Eutanasia di dislocazione cervicale senza anestetici previene la contaminazione chimica dei allantois, che può interferire con allegato allantoide.
2. Aprire la pelle dell'addome facendo una piccola incisione al midline con le forbici. Utilizzare le dita guantate per tenere la pelle sopra e sotto l'incisione e tirare la pelle verso il petto e la coda del mouse.
3. Afferrare il peritoneo con la pinzetta. Con l'altra mano, fare un'incisione a forma di V da anteriore verso posteriore usando le forbici e spostare il tessuto via per esporre la cavità addominale. Utilizzare le pinze per spingere l'intestino da un lato al fine di ottenere l'accesso all'utero.
4. Individuare i due corni uterini. Tenere il collo dell'utero (il segmento caudale) con il forcipe e tagliare i legamenti con forbice. Quindi scollegare entrambi i corni uterini da recidere ovidotti con le forbici.
5. Utilizzare pinze per trasferire l'utero in un piatto di 10cm sterile contenente sterile, PBS a temperatura ambiente (TA). Rimuovere il tessuto adiposo, vasi e nervi che circondano i corni uterini con una pinzetta e/o forbici (Figura 1A).

3. embrione dissezione

Nota: Eseguire la procedura seguente sotto uno stereomicroscopio dotato di una gamma di zoom 8:1.

1. Separare gli embrioni di taglio tra i siti di impianto con le forbici. Afferrare il rivestimento uterino muscolare dei germogli dell'utero con la pinzetta e tirare lo distingue per esporre la decidua (Figura 1B).
2. Usando il forcipe, trasferire i germogli di utero in un nuovo piatto di 10 cm contenente sterile, RT PBS.
3. Difficoltà decidua intorno l'embrione con le punte delle pinze.
4. Praticare un'incisione sul lato anti-mesometrial della decidua con una pinzetta (Figura 1) e togliere la decidua con pinze per esporre l'embrione (Figura 1).
   Nota: Il Polo di mesometrial della decidua è altamente vascolarizzato e può essere maggiore alla sua base la parte anti-mesometrial, che contiene l'embrione e appare più pallido.
5. Sezionare l'embrione con il forcipe (Figura 1E, F).
6. Utilizzando un micro-cucchiaio, trasferire l'embrione in una goccia di PBS sterile contenuta in un piatto sterile cm 3,5.
7. Trasferire l'embrione in una fresca goccia di PBS nello stesso piatto 3,5 cm utilizzando un micro-cucchiaio e sezionare l'embrione dal sacco vitellino usando il forcipe (Figura 1, H).
8. Facoltativamente, se necessario (ad es., per la genotipizzazione mediante polymerase chain reaction), trasferire il sacco vitellino in una provetta sterile aspirando con ~ 5 µ l PBS in punta di una pipetta di grande orifizio 200 µ l. Conservare a-20 ° C.
   Nota: Tessuto materno (cioè, il sacco vitellino parietale tra cui membrana di Reichert e il cono di ectoplacental) che potrebbe contaminare la preparazione del sacco vitellino può portare a risultati erronei genotipizzazione. Rimozione di questi tessuti è più semplice prima della dissezione dell'embrione dal sacco vitellino.

4. allantois dissezione e cultura Ex Utero su integrina α4β1 immobilizzato

1. Tagliare l'allantoide dal suo sito di inserimento basale all'estremità posteriore dell'embrione utilizzando una pinzetta (Figura 1 H).
2. Facoltativamente, se è necessaria la messa in scena dello sviluppo, è possibile contare le coppie somite dell'embrione mediante ispezione visiva utilizzando un microscopio dotato di ottica di contrasto di fase e un 5 × e 10 × obiettivo.
   Nota: L'embrione può essere esteso con pinze per facilitare il conteggio del somite. Fusione e corio-allantoidea allegato si verificano tra E 8.0 e 9.0 E embrioni con coppie di ≥ 6 somite. Tornitura comincia negli embrioni con 6-8 coppie di somite.
3. Dispensare 40 µ l/pozzetto di DMEM completati con 10% (v/v) di siero bovino fetale, L-Glutammina e antibiotici nel numero necessario di pozzetti di piastra prepatinato necessari (vedere sezione 1).
4. Raccogliere l'allantoide galleggiante aspirando con ~ 5 µ l PBS in un grande orifizio della punta di una pipetta 200 µ l. Trasferire 1 allantoide/pozzetto.
5. Incubare il allantoides inserendo le piastre di microtitolazione in un incubatore umidificato coltura tissutale (37 ° C, 5% CO₂) per es., 6, 12 e 24 h. Al fine di evitare interferenze con allegato allantoide, non spostare le piastre di microtitolazione tra questi intervalli di tempo.
6. In ogni punto del tempo, Punteggio allegato allantoide (ad es., nessun allantoide galleggiante e allegato; parzialmente o completamente annesso allantoide; completamente diffusione allantoide) utilizzando un microscopio dotato di fase contrasto o differenziale interferenze ottiche di contrasto e un × 5 o 10 × obiettivo (Figura 2).
   Nota: Gli esempi rappresentativi di recente isolate e completamente attaccato allantoides sono mostrati nella Figura 2. Ex utero, la punta distale del allantoides isolate da topi C57BL/6J wildtype attribuisce all'interno di 4-6 h (questo si riferisce a come parziale allegato della allantois), e allegato completo della allantois intero viene raggiunto entro ~ 12 h di cultura. Da 18-24 h, explant ha appiattito e assume una forma circolare (di cui per come completamente diffondere allantoide) con un plesso vascolare di CD31-positivo^9,16.

5. conferma la macchiatura della Allantois espiantati per il CD31 marcatore delle cellule endoteliali

1. Aspirare il terreno di coltura di espianti di diffusione completamente e fissare le cellule con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di paraformaldeide 4% (p/v) / PBS.
   Nota: Paraformaldeide è tossico. Indossare guanti e occhiali di sicurezza per evitare il contatto dell'occhio e della pelle.
2. Incubare per 10 min a RT, quindi aspirare il supernatante. Lavare tre volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.
3. Permeabilize le cellule e bloccare i siti di legame non specifico aggiungendo 40 µ l/pozzetto di 0.1% (v/v) del siero di capra normale Triton X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) in PBS per 30 min a RT. Wash due volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.
   Nota: Il protocollo può essere sospesa durante la notte a questo punto.
4. Macchia le cellule con l'aggiunta di 20 µ l/pozzetto di anticorpi anti-CD31 primario diluito 01:50 in 0,1% (p/v) BSA/PBS durante la notte a 4 ° C. Lavare tre volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.
5. Rilevare gli anticorpi primari legati con l'aggiunta di 20 µ l/pozzetto di fluorescente-etichetta secondaria capra gli anticorpi anti-ratto diluito 1: 200 in 0,1% (p/v) BSA/PBS per 1h a RT. Protect di microtitolo dalla luce avvolgendo in carta stagnola o inserendo in una camera oscura. Lavare tre volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.
6. Incorporare le cellule con l'aggiunta di 20 µ l/pozzetto di mezzo di montaggio. Incubare per ~ 1h a RT fino a quando il mezzo di montaggio ha solidificato. Conservare le piastre di microtitolazione a temperatura ambiente o a 4 ° C, al riparo dalla luce.
7. Immagine del plesso vascolare della allantois espianti sotto un microscopio a fluorescenza dotato di un × 5 o 10 × obiettivo e filtri di fluorescenza adatto.
   Nota: Immagini rappresentative del plesso vascolare CD31-positivi di un allantoide completamente diffusione sono mostrati nella Figura 3. Altri marcatori per il plesso vascolare, quali gli anticorpi diretti contro Flk-1, Flt, Tie-1 o Tie-2 può essere utilizzato come ben¹⁶.

Risultati

Questo protocollo descrive un metodo per isolare ed explant allantoides murino ex vivoe la valutazione qualitativa dell'allantoide attaccamento di integrina α4β1, un processo critico durante in vivo chorioallantoic fusione di dettagli. I risultati rappresentativi mostrati in Figura 1A–H illustrano i passaggi successivi di isolamento allantoide a partire dall'utero incinto. Tessuti materni che circondano i co...

Discussione

In presenza di siero, che è una fonte ricca di molecole pro-adesiva della matrice extracellulare quali fibronectina, allantoide espianti verranno prontamente collegato a vari in plastica, vetro o filtro superfici^9,16. Così, se lo scopo del test eseguito è quello di studiare in particolare l'effetto di una modificazione genetica o qualsiasi altro trattamento allegato allantoide per immobilizzato α4β1, è fondamentale per bloccare i siti di legame non specifico (

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C57BL/6J topi wildtype	The Jackson Laboratory	Codice prodotto:
70 % (v/v) Etanolo	VWR International	930031006
Pinza standard Fine	Science Tools	11000-12	Pinza utilizzata per aprire la cavità addominale.
Micro pinza da dissezione	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 forcetti per biologia medica con punta fine e affilata.
Forbici fini	Fine Science Tools	14094-11	Lame dritte.
Forbici a molla	Fine Science Tools	15012-12	Forbici a molla Noyes con lame da 14 mm per la dissezione delle gemme dell'utero.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Diametro cucchiaio.
Piastre per microtitolazione	ibidi	81501	Utilizziamo vetrini per angiogenesi sterili e non rivestiti (volume interno 50 & micro; L) con una superficie idrofobica che non è trattata con coltura tissutale per ridurre i nonα 4β Legame mediato da 1 alla plastica.
Piatto da 10 cm	Nunc	150350	Piatti sterili per coltura tissutale.
Piatto da 3,5 cm	Nunc	150288	Piastre sterili per coltura tissutale.
Puntali per pipette con orifizio grande	Biozym	VT0140X	Puntali per pipette a basso binding, 200 µL.
α 4β 1 integrina	R& D Systems	6054-A4	Murine α 4β 1 integrina espressa in modo ricombinante e purificata da una linea cellulare di ovaio di criceto cinese.
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	senza Ca2+ e Mg2+.
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	La formulazione contiene 4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruvato di sodio e 3,7 g/L di NaHCO3 ma non di L-glutammina, che viene aggiunta separatamente.
Penicillina/Streptomicina	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10.000 U/mL Penicillina e 10.000 µ g/mL di streptomicina). Preparare e conservare le aliquote a -20 gradi C per evitare il gelo/disgelo.
L-Glutammina	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Soluzione madre. Preparare e conservare le aliquote a -20 gradi C per evitare il gelo/disgelo.
Siero fetale bovino	Biochrom	S 0115	Utilizziamo FBS inattivato a caldo (riscaldato a 56 ° C per 30 min con miscelazione per inattivare il complemento).
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	Utilizziamo albumina priva di proteasi e acidi grassi. Preparare una soluzione allo 0,1% (p/v) in DMEM. Filtrare sterile la soluzione attraverso un filtro monouso per colture cellulari con un 0,22 µ m dimensione dei pori e bassa membrana legante le proteine, e immagazzinare aliquote a -20 °C.
para-Formaldeide	Carl Roth	0335.2	Per realizzare una soluzione di formaldeide in PBS, pesare para-formaldeide in polvere in una cappa ventilata e aggiungerla al PBS preriscaldato a circa 60 ° C in un bicchiere su una piastra per mescolare. Aggiungere 1 N NaOH goccia per goccia fino a quando la soluzione non si chiarisce. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e filtrare con una siringa filtrante da 0,22 mm. Regolare il pH con HCl diluito a circa 6,9 e regolare il volume finale con PBS. Aliquotiamo e congeliamo la soluzione, ma può anche essere conservata a 4 ° C per circa quattro settimane.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Utilizzare puntali per pipette a orifizio largo per maneggiare Triton X-100 non diluito.
Siero di capra normale	Sigma Aldrich	G9023	Per bloccare il legame non specifico degli anticorpi nelle analisi di immunofluorescenza.
α-CD31 Anticorpi	BD Biosciences	550274	Anticorpi monoclonali purificati anti-topo di ratto, clone MEC 13.3.
Anticorpi secondari anti-ratto di capra	Thermo Fisher	A-11006	IgG anti-ratto di capra (catene pesanti e leggere), adsorbiti in modo incrociato, marcati in fluorescenza con Alexa Fluor 488. Sono possibili anche altre etichette fluorescenti.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Terreno di montaggio per citochimica. MW ~31.000
Labovert	Leitz	Labovert	Microscopio a contrasto di fase invertito dotato di un obiettivo 4 x e 10 x per il conteggio delle coppie di somiti. Sono adatti anche altri microscopi a contrasto di fase (come quelli che vengono utilizzati abitualmente nelle colture tissutali).
M80	Leica Microsystems	M80	con gamma di zoom 8 : 1 (con un ingrandimento compreso tra 7,5 x e 60 x) per la dissezione di embrioni e allantoidi.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Sistema di microscopio per istologia con illuminazione a LED. Utilizziamo obiettivi HCX PL FLUOTAR 5 x/0,15 e HC PL FLUOTAR 10 x/0,30. Altri microscopi dotati di ottiche a contrasto di fase e a fluorescenza possono essere utilizzati per segnare l'attacco dell'allantoide.
Fotocamera digitale	JVC	KY-F75U	3-CCD fotocamera di acquisizione digitale collegata al microscopio LED DM4000B. Utilizziamo il software Diskus (Hilgers) per far funzionare sia il microscopio che la fotocamera.
Microscopio confocale	Leica Microsystems	SP5	Microscopio confocale per l'imaging ad alta risoluzione degli endoteli nel plesso vascolare degli espianti di allantoide. Le immagini in immunofluorescenza sono state scattate con un obiettivo 40x.

000664 Stereomicroscopio