Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Sommario

Oogenesi nei mammiferi sono noto per essere soggetta a errori, particolarmente dovuto malsegregazione di cromosoma. Questo manoscritto descrive metodi di preparazione di cromatina diffusa per profase mouse, metafase I e II-messa in scena di ovociti. Queste tecniche fondamentali consentono per lo studio della cromatina-proteine e morfologia del cromosoma in tutto mammiferi oogenesi.

Abstract

Tecniche di diffusione della cromatina sono stati ampiamente usati per valutare la localizzazione dinamica di varie proteine durante la gametogenesi, particolarmente per la spermatogenesi. Queste tecniche permettono per visualizzazione della proteina e modelli di localizzazione del DNA durante eventi meiotici quali cromosomi omologhi abbinamento, synapsis e riparazione del DNA. Mentre alcuni protocolli sono stati descritti nella letteratura, tecniche di diffusione generale della cromatina usando i oocytes profase mammiferi sono limitate e difficile dovuto i tempi di apertura di meiosi nelle ovaie fetali. In confronto, spermatociti profase possono essere raccolti da topi giovani maschi con rendimenti più alti senza l'esigenza di microdissection. Tuttavia, è difficile ottenere una popolazione pura sincronizzata delle cellule alle fasi specifiche a causa dell'eterogeneità delle popolazioni meiotica e post-meiotic delle cellule di germe nel testicolo giovanile e adulto. Per le successive fasi della meiosi, è vantaggioso per valutare gli ovociti che subiscono meiosi I (MI) o meiosi II (MII), perché gruppi di ovociti maturi possono essere raccolti da topi femminili adulti e stimolati per riprendere la meiosi nella cultura. Qui, metodi per le preparazioni di cromatina meiotica sviluppa usando i oocytes sezionato da fetale, neonatale e adulte ovaie sono descritti con dimostrazioni video di accompagnamento. Gli eventi di malsegregazione di cromosoma in mammiferi ovociti sono frequenti, specialmente durante MI. Queste tecniche possono essere utilizzate per valutare e caratterizzare gli effetti di mutazioni differenti o esposizioni ambientali durante le varie fasi dell'oogenesi. Come ci sono chiare differenze tra oogenesi e spermatogenesi, le tecniche descritte all'interno hanno un valore inestimabile per aumentare la nostra comprensione dell'oogenesi dei mammiferi e il sessualmente dimorphic caratteristiche delle dinamiche del cromosoma e della proteina durante la meiosi .

Introduzione

Durante la spermatogenesi, grandi onde semisincrona meiotiche delle cellule di germe sono rapidamente e continuamente rifornite nel testicolo all'inizio della pubertà e durante l'età adulta¹. In contrasto con i maschi, meiosi nelle femmine sono avviato esclusivamente durante lo sviluppo fetale. Dopo la nascita, gli ovociti rimangono arrestati in una fase prolungata dictyate di Profase I con un'intatto della vescicola germinale (GV; involucro nucleare) fino alla pubertà. Al momento della comparsa della pubertà, un sottoinsieme degli ovociti vengono selezionati ciclicamente a subire la crescita e la maturazione, segnando l'inizio della ripresa meiotica. Meiotica ripresa negli ovociti adulti si manifesta con la scomparsa del GV in un processo noto come rottura della vescicola germinale (GVBD). L'ovocita subisce quindi condensazione cromosomica e segregazione, seguita da estrusione corpo polare. Ovociti diventano arrestati sulla progressione di MII e sono stimolati per completare la divisione meiotica seconda e definitiva solo dopo la fecondazione.

Fertilità femminile è altamente dipendente dal successo della Profase Meiotica I progressione. Chiave di questo è la formazione di un collegamento fisico tra cromosomi omologhi, conosciuto come i chiasme, che è mediata dalla riparazione dell'indotto del DNA doppio filo (DSBs) tramite crossover ricombinazione². Questo processo si verifica nel contesto di un'impalcatura proteico dinamico conosciuto come il complesso Sinaptonemale (SC) che si forma tra cromosomi omologhi per facilitare loro synapsis³. Lo SC è una struttura tripartita della chiusura lampo-come costituito da due elementi laterali paralleli collegati da proteine regione centrale che tiene gli omologhi insieme durante la riparazione del DNA in corso. Prima sinapsi, precursori degli elementi laterali, chiamati elementi assiali, formano tra la sorella cromatidi. Complesso Sinaptonemale proteine quali SYCP2 e SYCP3 formano elementi assiali che colocalize agli assi sorella-cromatidio coesione durante la profase precoce. Successivamente i servire come siti per la proteina del filamento trasversale, SYCP1, che facilita il montaggio di elemento centrale e sinapsi tra omologhi allineati⁴di legame. Nei oocytes del mouse, synapsis completa è indicata dalla presenza di 20 completamente sovrapposti tratti SYCP3 e SYCP1, che possono essere visualizzati utilizzando cromatina diffondere preparazioni. Synapsis è completato con l'entrata in sotto il tavolino di pachitene, per cui maturo crossover che sono destinati a chiasmata forma tra omologhi sono decorate con mutL dimeri di omologo (MLH1/3) per promuovere la loro accurata lavorazione^{5,6 , 7}. la manutenzione strutturale dei complessi di cromosomi (SMC), tra cui coesina, condensin e il SMC5/6 complessi, sono importanti per la regolazione della dinamica di cromosoma e struttura durante meiosi^{8,9, 10,11,12}. Collettivamente, questi eventi garantiscono bi-orientamento corretto di cromosomi omologhi a opposte pali dell'alberino dopo smontaggio della SC.

Il ciclo cellulare meiotico è un potente modello per esaminare i ruoli delle varie proteine in manutenzione di genoma a causa dell'induzione programmata e la successiva riparazione di DNA DSBs. Inoltre, la meiosi dei mammiferi sono anche un modello rilevante per lo studio delle modificazioni epigenetiche e imprinting¹³. Tuttavia, è tecnicamente difficile valutare questi eventi durante la meiosi femminile, che si svolge nelle ovaie fetali e neonatali nei mammiferi (Figura 1). Profase I posso essere divisa in 5 sottostadi: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema e dictyate. Qui, descriviamo come isolare e distinguere tra fetale e neonatale ovaie e testicoli (Figura 2). Adattato da metodi precedentemente descritti, questo manoscritto delinea anche un protocollo (fase 1) con video dimostrativo per la preparazione di Profase Meiotica femmina ho cromatina si diffonde^14,15,16,17 . Quando accoppiato con immunolabelling, come descritto nei passaggi 6-7, questo protocollo consente analisi microscopica dettagliata della Profase I eventi negli ovociti.

Oogenesi sono soggetta a errori ed eventi malsegregazione cromosoma durante la prima divisione meiotica rappresentano la fonte più comune di malattia genetica nella progenie^18,19. In questo manoscritto (punto 2 del protocollo), descriviamo un protocollo in cui gli ovociti maturi in scena GV sono estratti da innescato ovaie di topi femminili adulti. In condizioni favorevoli, ovociti adulti subiscono luteinizing ormone-indipendente ripresa della meiosi seguendo l'isolamento e la coltura²⁰. In seguito ripresa meiotica, ovociti progredire attraverso meiosi I, quindi arrestano in metafase II. Gli ovociti rimangono arrestati in metafase II, a meno che non fertilizzato. Nei passaggi 2-5, ci adattiamo protocolli precedentemente segnalati con video dimostrativo per descrivere come raccogliere, cultura e preparare gli ovociti MI e MII per cromatina diffusa preparazioni²¹. Questa tecnica di diffusione di cromatina consente immunolabelling chiaro di proteine associate con i cromosomi. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato anche per distinguere tra cromosomi bivalenti e univalent e può ulteriormente risolvere single sorella cromatidi per facilitare la valutazione della ploidia degli ovociti. Pertanto, oltre a rivelare modelli di localizzazione delle proteine meiotiche, questo protocollo può anche servire come uno strumento prezioso per il delucidamento potenziali cause di malsegregazione cromosoma durante MI e MII.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Johns Hopkins University. Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi C57BL/6J wild-type.

1. raccolta ovaie fetale o neonatale e preparazione della cromatina profase si diffonde

1. Per estrarre gli embrioni a 14,5 – 19,5 giorni coitum dell'alberino (dpc) sacrificare le femmine incinte tramite dislocazione cervicale o CO₂ asfissia secondo linee guida IACUC.
   Nota: Per le ovaie postnatale giorno 1 – 5, passare al punto 1.3. Figura 1 riassume le fasi Profase Meiotica arricchite alle diverse età embrionale e post-natale.
2. Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, rendendo un'apertura a forma di V. Sezionare il corno uterino materno, separare gli embrioni dalla placenta e trasferire gli embrioni in 35mm di Petri contenente 3 mL di pre-riscaldato 1 x la soluzione salina tampone fosfato (PBS) a 37 ° C.
   Nota: Un fliptop incubatore a 37 ° C può essere utilizzato per mantenere la temperatura. Inoltre, una fase di vetro temperatura regolata utilizzabile anche per mantenere la temperatura durante la manipolazione dell'ovaia.
3. Con forbici chirurgiche da 3,5 pollici, sacrificare embrioni o cuccioli tramite decapitazione secondo linee guida IACUC. Posto decapitati embrioni o cuccioli in PBS preriscaldata prima dell'ulteriore dissezione.
4. Sezionare un embrione o cucciolo alla volta in una capsula Petri 35mm separato contenente 3 mL di PBS pre-riscaldato a 37 ° C. Procedere tagliando lungo la linea mediana ventrale della metà posteriore dell'embrione, lungo la metà anteriore sotto le zampe anteriori e direttamente sopra le arti posteriori e la coda come indicato in Figura 2A–B.
5. Aprire l'addome utilizzando forbici chirurgiche da 3,5 pollici. Usando il forcipe punta fine spostare o rimuovere il fegato e le anse intestinali, esponendo le ovaie in un nuovo 35mm di Petri contenente 3 mL di PBS pre-riscaldato a 37 ° C (Vedi Guida in Figura 2B). Le ovaie si trovano immediatamente sotto e dietro il rene verso la parete posteriore della cavità peritoneale (Figura 2B–C). Una guida per la differenziazione tra maschio e femmina gonadi è fornita in Figura 2D.
   Nota: Per condizioni ottimali, rapidamente sezionare le ovaie dopo donna incinta viene sacrificata.
6. Rimuovere entrambe le ovaie da ogni feto femminile usando un paio di pinze a punta fine sotto un ambito di dissezione e posto in una vetri da orologio o pozzetti separati di un multi-pozzo piastra da 0,5 a 1,0 mL di PBS preriscaldata e mantengono a 37 ° C.
7. Posizionare ogni coppia delle ovaie in 0,5 mL di tampone hypo-estrazione (17mm citrato trisodico biidrato, saccarosio 50 mM, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inibitore della proteasi, pH 8.2) in un vetro da orologio pulito o un piccolo pozzo di una piastra 9, avendo cura di immergere il comp di ovaie completamente. Incubare per almeno 15 min, ma non più di 30 min.
   Nota: Fare tampone di hypo-estrazione fresco e utilizzare entro 2 ore DTT aggiunta.
8. Durante l'incubazione, utilizzando una penna PAP barriera idrofoba, è possibile disegnare due 22x22 mm² quadrati in un bicchiere pulito 25 x 75 mm², vetrino da microscopio spessore 1 mm come mostrato in Figura 3A.
   Nota: Diapositive possono essere preparati prima del tempo.
9. 45 – 50 µ l di saccarosio di 100 mM su un vetrino pulito e trasferire una coppia delle ovaie per la discesa.
10. Utilizzando l'estremità tagliente di due aghi 27 G, prendere in giro le ovaie a pezzi per rilasciare cellule nella soluzione di saccarosio. Con una pinza, rimuovere pezzi grossi dell'ovaia e Pipettare attentamente la soluzione di saccarosio per disperdere le cellule.
11. Posto 40 µ l di soluzione fissante (1% paraformaldeide (PFA), 0,2% detergente (Vedi Tabella materiali), pH 9.2) in ogni quadrato del vetrino preparato. Con una punta di pipetta 200 µ l, distribuire la soluzione fissante uniformemente sopra la superficie di scorrimento.
12. Pipettare 20 µ l della miscela saccarosio sulla ogni piazza della diapositiva contenente il fissativo.
    Nota: Questo equivale a usare un paio di ovaie per ogni diapositiva.
13. Incubare i vetrini in una camera umida chiusa durante la notte a temperatura ambiente.
    Nota: L'incubazione overnight possa oscillare intorno ai (12-15 ore) a temperatura ambiente.
14. Aprire il coperchio e lasciare i vetrini asciugare completamente.
15. Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di soluzione imbibente-PBS 0,4% (Vedi Tabella materiali) per 2 min, lasciare asciugare all'aria e procedere al protocollo immunolabelling (passaggio 6).
    Nota: È possibile memorizzare le diapositive a-80 ° C per un uso successivo, ma questo varia a seconda della proteina di interesse. Per ottenere risultati ottimali procedere immediatamente al protocollo immunolabelling (passaggio 6).

2. metafase ho raccolta degli ovociti

1. Per massimizzare il numero di follicoli antrali isolato da ogni mouse, iniettare intraperitonealmente topi femminili vergini sessualmente maturi con 5 UI di gonadotropina del siero di cavalla gravida (PMSG, gonadotropina corionica conosciuto anche come equina (eCG)).
   Nota: Per una resa ottimale degli ovociti, topi dovrebbero essere 1 a 3 mesi di età, come il numero di ovociti raccolti diminuirà con l'età. Per preparare PMSG, sciogliere bottiglia di 5.000 UI in 100 mL di PBS sterile (5ml U/0.1) Store in aliquote monouso di 600 µ l a-20 ° C.
2. Dopo 44 – 48 h, preparare il supporto di collezione, minimo essenziale medio alfa (MEMα) supplementato con 5% siero bovino fetale (FBS) e 3 mg/mL di sieroalbumina bovina (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Sterilizzare media attraverso un filtro di pori di 0,2 µm. Decantare 2,5 mL MEMα/BSA/FB medio in un piatto di vetro per topo e calda a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ .
   Nota: Altri raccolta e terreni di coltura che sono commercialmente disponibili (M2 e M16) sono inoltre comunemente usati.
   Attenzione: Si consiglia di rimuovere le piastre di coltura dall'incubatrice₂ CO 5% uno alla volta per una durata limitata minimizzare l'esposizione all'aria ambiente durante le fasi di manipolazione.
3. Sacrificare i topi tramite dislocazione cervicale o CO₂ asfissia secondo linee guida IACUC.
4. Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, facendo una grande apertura a forma di V. Usando il forcipe, spostare intestini verso la testa del mouse. Individuare ogni corno uterino; le ovaie sono presenti prossimale per la gabbia toracica. Tenere l'ovidotto con una pinzetta e tagliare il grasso superiore all'ovaia usando le forbici per dissezione (Figura 4). Continuare a tenere l'ovidotto e con un altro set di una pinzetta rilasciare ovaia dalla bursa e posto in un piatto di raccolta contenente mezzo MEMα/BSA/FBS.
   Nota: Come nel passaggio 1, è fondamentale per mantenere le ovaie a 37 ° C e mantenere al 5% CO₂. Un incubatore di fliptop collegato al 5% CO₂ mix utilizzabile per consentire il mantenimento ottimale della temperatura e i livelli di CO₂ . Inoltre, una fase di vetro temperatura regolata dovrebbe essere utilizzata anche per mantenere la temperatura durante la manipolazione degli ovociti.
5. Usando una siringa da 1 mL con un ago 27 gauge (o dimensioni simili), rilasciare complessi ovocita cumulo perforando manualmente i grandi follicoli antrali.
6. Osservando attraverso un microscopio di dissezione, raccogliere i oocytes GV-organizzato utilizzando una pipetta di vetro bocca-operati o capillare o una manuale micrometro-siringa (Figura 5). Raccogliere solo gli ovociti che vengono rilasciati da follicoli antrali. Gli ovociti GV hanno un diametro di circa 90 µm. GV ovociti possono essere circondati da 2-3 strati di cellule della granulosa e hanno un diametro totale di circa 200 µm.
7. Cultura di ovociti in un vetro da orologio pulito o una piastra 9-pozzetti contenenti MEMα/BSA/FBS mezzo per 6 h raggiungere la metafase I a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ .
8. Procedere al passaggio 4.

3. metafase II (MII) ovocita collezione

1. Per massimizzare gli ovociti isolati da ogni mouse, iniettare intraperitonealmente topi femminili vergini sessualmente maturi con 5 IU di PMSG. Dopo 44 – 48 h, iniettare per via intraperitoneale con 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG).
   Nota: Per una resa ottimale degli ovociti, topi dovrebbero essere 1 a 3 mesi di età, come il numero di ovociti raccolti diminuirà con l'età. Per preparare hCG, sciogliere una bottiglia di 10.000 U in 200 mL di PBS (5ml U/0.1). Conservare in varie porzioni monouso di 600 µ l a-20 ° C.
2. Dopo 12-14 ore, preparare mezzo di raccolta MEMα/BSA/FBS, come descritto al punto 2.2, sopra.
3. Sacrificare i topi tramite dislocazione cervicale o CO₂ asfissia secondo linee guida IACUC.
4. Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, facendo una grande apertura a forma di V. Usando il forcipe, spostare intestini verso la testa del mouse. Le ovaie sono presenti prossimale per la gabbia toracica, individuare ogni corno uterino. Tenere l'ovidotto con una pinzetta e tagliare il grasso superiore all'ovaia usando le forbici per dissezione (Figura 4). Quindi rimuovere l'ovaia e l'ovidotto e porre nel piatto di raccolta contenente mezzo MEMα/BSA/FBS.
   Nota: Come nei passaggi 1 e 2, è fondamentale per mantenere le ovaie a 37 ° C e mantenere al 5% CO₂. Un incubatore di fliptop collegato al 5% CO₂ mix utilizzabile per consentire il mantenimento ottimale della temperatura e i livelli di CO₂ . Inoltre, una fase di vetro temperatura regolata dovrebbe essere utilizzata anche per mantenere la temperatura durante la manipolazione degli ovociti.
5. Utilizzando una siringa da 1 mL con un 27 G (o dimensioni simili) o sharp forcipe, strappare un buco nel ampulla di ovidotto per rilasciare gli ovociti MII.
   Nota: Fare attenzione a non danneggiare gli ovociti in ampulla. Ampulla apparirà gonfio e traslucido, tale che gli ovociti sono visibili (Figura 4).
6. Raccogliere gli ovociti MII dal ampulla dell'ovidotto in un piatto nuovo con medium collezione facendo uso di una pipetta di vetro bocca-operati o capillare o una manuale micrometro-siringa (Figura 5).
7. Procedere al passaggio 4.

4. ovocita denudamento e rimozione di Zona Pellucida

1. Preparare 300 IU/mL di ialuronidasi in medium MEMα completate con 3 mg/mL BSA a impoverire gli ovociti delle circostanti cellule del cumulo (2,5 mL/topo) in un vetro da orologio e mantenere a 37 ° C, 5% CO₂.
   Nota: L'efficacia dell'ialuronidasi diminuisce acutamente dopo 1 h di preparazione. Per ovociti MII, ialuronidasi trattamento non è necessario.
2. Esporre i complessi delle cellule ovocita-cumulo a 300 IU/mL di ialuronidasi in MEMα/BSA per 3 min a impoverire gli ovociti delle circostanti cellule del cumulo.
   Attenzione: Non superare 3 min di esposizione all'ialuronidasi, poiché potrebbe danneggiare gli ovociti.
3. Per lavare gli ovociti, trasferimento ovociti in un fresco riscaldato piatto medio MEMα/BSA. Utilizzando una pipetta di vetro bocca-operati o capillare (leggermente più grande rispetto al diametro dell'ovocita, che è circa 90 µm), pipettare i complessi su e giù per staccare completamente le cellule del cumulo. Consentire gli ovociti recuperare nell'incubatrice mentre si prepara per il prossimo passo.
4. Soluzione di caldo acida Tyrode, MEMα/BSA e media di Waymouth a 37 ° C (500 µ l/topo). Posto 300 µ l in ogni pozzetto di lastre di vetro 9-Pozzo piccolo.
5. Per rimuovere la zona pellucida (ZP) trasferire 5 – 10 ovociti in soluzione di Tyrode. Esporre gli ovociti per solo 30-45 s alla soluzione.
   Nota: Esposizione troppo poco alla soluzione non rimuoverà la ZP completamente, che impedirà gli ovociti da scoppio e cromosomi da spalmare. Troppa esposizione danneggiare e uccidere l'ovocita. Guardando la dissolvenza di ZP sotto il microscopio di dissezione può aiutare a ottimizzare il tempo di esposizione.
   Attenzione: Utilizzando la soluzione di Tyrode fresco è critica, come sua funzione diminuisce con l'età. Utilizzare un pozzo fresco della soluzione di Tyrode per ogni gruppo di ovociti trattati per assicurare uniforme digestione della ZP.
6. Immediatamente dopo la rimozione di ZP, lavare gli ovociti trasferendo in medio MEMα/BSA/FBS riscaldato. Ripetere questo passaggio di lavaggio.
   Nota: Fare attenzione durante il trasferimento, come gli ovociti attaccherà facilmente insieme e la pipetta di vetro o capillare segue la rimozione della ZP. La pipetta di vetro o capillare in mezzo di Waymouth di prebagnatura ridurrà ovociti attaccare insieme.
7. Trasferire e consentire gli ovociti recuperare per 30 minuti nel mezzo di Waymouth a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ .
8. Procedere al passaggio 5.

5. MI e MII ovocita della cromatina si diffonde

1. Utilizzando una penna PAP, disegnare un rettangolo di² 11 x 44 mm su vetrino come mostrato in Figura 6A.
2. Ricoprire il vetrino con un sottile strato di fissativo (1% paraformaldeide, 0,2% Triton-X100 in H₂O, pH 9.2) di Pipettare 100 µ l di fissativo sulla diapositiva e dondolo avanti e indietro la diapositiva. Tocca la diapositiva per sbarazzarsi di fissativo in eccesso.
3. Pick up tra 5-10 ovociti con un ago di pipetta piccola bocca con come mezzi piccoli come possibile e trascinare l'ago in una linea attraverso la diapositiva rivestite con fissativo mentre depositando gli ovociti da 1 cm sopra il vetrino nella soluzione fissante. Eseguire questo passaggio utilizzando un microscopio di dissezione per garantire che gli ovociti sono stati depositati e che essi hanno scoppiato.
   Nota: Gli ovociti dovrebbero scoppiare immediatamente sulla diapositiva. L'altezza alla quale gli ovociti vengono depositati impatto il grado di diffusione della cromatina. Vedere risultati rappresentativi nella Figura 6 per ulteriori dettagli.
4. Incubare i vetrini a temperatura ambiente in una camera umidificata chiusa durante la notte per consentire la cromatina di aderire.
5. Lasciare i vetrini asciugare completamente e sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di 0,4% imbibente-H₂O, pH 8.0.
6. Procedere al passaggio 6.

6. Immunolabelling

1. Preparare il tampone di diluizione di anticorpo (ADB) descritto nella tabella 1.
2. Preparare due vasetti di Coplin contenente 50 mL di soluzione di lavaggio tampone (WB) (10% ADB diluito in PBS) e uno di Coplin contenente 50 mL di WB e 0,05% di soluzione detergente (ad esempio, aggiungere 250 µ l di 10% detergente 50ml WB).
3. Lavare le diapositive che sono state preparate nella sezione 1 e 5 del presente protocollo per 10 min in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di WB.
   Attenzione: Non lasciate che le diapositive asciutto in qualsiasi punto durante il immunolabelling.
4. Lavare i vetrini per 10 min nel Coplin jar contenente 50ml WB e 0,05% di soluzione detergente. Quindi, lavare i vetrini nel restante di Coplin contenente 50 mL di soluzione di WB per 10 min.
5. Tocca Disattiva diapositiva in eccesso di liquido e copertura con 100 µ l di anticorpi primari selezionati diluito in ADB. Incubare a 4 ° C durante la notte in una camera umida chiusa.
   Nota: L'incubazione può essere ridotto a 2-3 ore a 37 ° C. Utilizzare volumi più piccoli dell'anticorpo (ad es., 50 µ l) coprendo il vetrino con un vetrino coprioggetto o parafilm.
6. Sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin contenente 50 mL di soluzione di 0,2% imbibente-PBS, pH 8.0.
7. Ripetere i passaggi da 6,2 e 6,5.
8. Tocca Disattiva diapositiva in eccesso di liquido e copertura con 100 µ l di anticorpi secondari selezionati diluito in ADB. Incubare i vetrini 1 a 2 ore a 37 ° C in una camera umida chiusa.
9. Lavare i vetrini 2 volte per 10 min in vasetti di Coplin contenente 50 mL di soluzione di 0,2% imbibente-PBS, pH 8.0.
10. Lavare i vetrini 2 volte per 5 min in vasetti di Coplin contenente 50 mL di soluzione imbibente-H₂O di 0,2%, pH 8.0.

7. montaggio vetrini

1. Per profase della cromatina spread preparato nel passaggio 2, aggiungere 100 µ l di mezzo di montaggio contenente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Per cromatina MI e MII si diffonde preparato nel passaggio 5, aggiungere 50 µ l di mezzo di montaggio contenente DAPI (1.5µg / mL). Asciugare delicatamente il liquido in eccesso assente.
2. Porre un coprivetrino 22 x 60 mm sulla parte superiore e sigillare con smalto trasparente. Conservare in una scatola di diapositiva a 4 ° C o -20 ° C fino alla valutazione tramite microscopia a fluorescenza.
   Nota: Toccare leggermente il coprioggetto per sbarazzarsi di mezzo di montaggio in eccesso prima di sigillare con smalto.

Risultati

Abbiamo descritto due tecniche per visualizzare e valutare i cromosomi meiotici negli ovociti. La prima tecnica è adatta per valutare la progressione della profase in ovaie embrionale e neonatale. Profase della cromatina diffusione preparazioni sono incredibilmente utili per la visualizzazione di numerosi processi dinamici durante la meiosi, tra cui cromosoma abbinamento, synapsis e desynapsis, ricombinazione omologa e rimodellamento epigenetico del cromosoma. Qui, abbiamo dimostrato l'ut...

Discussione

Cromatina diffusione preparati permettono ai ricercatori di studiare cronologicamente femmina mammiferi meiosi e la localizzazione dinamica delle proteine coinvolte. Gli spread di cromatina embrionale e neonatale consentono analisi di eventi durante la profase meiotica. Metafase I e metafase II cromatina spread può essere utilizzato per distinguere single sorella cromatidi da accoppiato cromosomi omologhi appaiati e sorelle così come valutare ploidia. In confronto, il protocollo descritto qui può essere vantaggioso rispe...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10X Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4	Qualità Biologico	119-069-161
Piastre di Petri da 60 mm x 15 mm	Denville	T1106
Piastre di Petri da 35 mm x 12 mm	Denville	T1103
Pinza fine	VWR	300-050
Forbici per microdissezione	Ted Pella	1340
Sezionamento  forbici, punta affilata, 41/2 "	VWR	82027-578
Orologio in vetro quadrato 1 5/8	Carolina Biological Supply Company	742300	Autoclave prima di ogni utilizzo
Saccarosio	Sigma	S8501
Citrato trisodico diidrato	Sigma	S1804
EDTA	Sigma	E6758
Trizma Base	Sigma	T1503
1,4-Ditiotreitolo (DTT)	Sigma	646563	Aggiungere al tampone ipotonico immediatamente prima dell'uso
50x Inibitore della proteasi	Roche	11873580001	Aggiungere al tampone ipotonico immediatamente prima dell'uso
Siringa di turbercolina con ago (1cc, 27 G x 1/2 in)	Becton, Dickinson (BD)	309623
Vetrini in vetro ultra frost con sigillo d'oro (25X75mm, spessore 1mm)	Thermo	3063-002
Penna Super PAP, grande (bloccante di liquidi)	Scienze della microscopia elettronica (EMS)	71310
acquosa al 16% di paraformaldeide	(EMS)	15710
Triton X-100	Sigma	T8787	Detergente nel manoscritto
Camera di umidità per macchie immunologiche	Barattoli Evergreen	240-9020-Z10
Coplin	Fisher	08-815
Photo-flo 200	Scienze della microscopia elettronica (EMS)	74257	Agente umettante nel manoscritto
Gonadotropina sierica cavalla gravida (PMSG)	Sigma	G4877	Conservare le aliquote a -20C
Gonadotropina corionica umana (HCG)	Sigma	C0434	Conservare le aliquote a -20C
Piastre spot PYREX con nove cavità concave	Fisher	13-748B	Autoclave prima di ogni utilizzo
Capillare in vetro	Fisher	22260943	Per realizzare aghi per la raccolta degli ovociti
Marca Parafilm M	Sigma	BR701501	Per la realizzazione di aghi per la raccolta degli ovociti Tubo
lattice di gomma (diametro interno 3,2 mm x diametro esterno 6,4 mm)	Fisher	14-178-5B	Per la realizzazione di aghi per la raccolta degli
ovocitiTubo in lattice di gomma (diametro interno 6,4 mm x diametro esterno 11,1 mm)	Fisher	14-178-5D	Per realizzare aghi per la raccolta di ovociti
Nasello flessibile in gomma siliconica, bocchino in plastica dura e 15 pollici di tubo in lattice	Sigma	A5177-5EA	Per la realizzazione di aghi per la raccolta di ovociti
Testina micrometrica	Mitutoyo Mituoyo	150-208	Per la realizzazione di aghi per la raccolta di ovociti
Siringa 5 ml	BD Biosciences	309646	Per la realizzazione di aghi per la raccolta di ovociti
Filtro per siringa 0,45 μ m filtro	Corning	431220	Per fare aghi per la raccolta degli ovociti
Pipetta in vetro Pasteur 5 3/4"	Fisher	13-678-6A	Per fare aghi per la raccolta degli ovociti
83 x 0,5 mm punta per pipetta	Denville	P3080	Per fare aghi per la raccolta degli ovociti
α-MEM	Invitrogen	11415049
Waymouth's media	Life Technologies
Siero fetale bovino	Fisher	A3160602
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma	A3311	Per terreni di coltura di ovociti
Unità filtranti da 500 ml 0,22	um Denville	F5227
Ialuronidasi	Sigma	H3506
Tyrode' s soluzione	Sigma	T1788	Conservare le aliquote a -20C
Siero di cavallo	Sigma	H-1270	Per ADB/tampone di lavaggio
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma	A1470	Per ADB/tampone di lavaggio
Mezzo di montaggio antisbiadimento VECTASHIELD con DAPI	Vector Labs	H-1200
Vetrini di copertura per microscopio (22mmx60mm)	Fisher	12-544-G
Smalto trasparente	Amazon	N/A
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Microscopi
SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Observer Z1	Zeiss
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Anticorpi primari
Topo anti-MLH1	Life Technologies	MA5-15431	Fattore di diluizione- 1:100
Coniglio anti-SYCP1	Life Technologies	PA1-16763	Fattore di diluizione- 1:1000
Capra anti-SCP3	Santa Cruz	sc-20845	Fattore di diluizione- 1:50
Proteina umana anti-centromero	Anticorpi incorporati	15-235	Fattore di diluizione- 1:100
Coniglio anti- TOPOII	Abcam	ab109524	Fattore di diluizione - 1:100
Topo anti-istone H4 (di metile K20, tri metil K20)	Abcam	ab78517	Fattore di diluizione- 1:500
Coniglio anti-Rec8	Per gentile concessione della dottoressa Karen Schindler	N/A Fattore	di diluizione- 1:10.000
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpi secondari
Asino anti-capra IgG (H+L) Alexa Fluor 568 coniugato	Thermo-Fisher Scientific	A-11057	Fattore di diluizione - 1:500
Asino anti-topo IgG (H+L) Alexa Fluor 488 coniugato	Thermo-Fisher Scientific	A-21202	Fattore di diluizione - 1:500
Asino anti-coniglio IgG (H+L) Alexa Fluor 647 coniugato	Thermo-Fisher Scientific	A-31573	Fattore di diluizione - 1:500
IgG anti-topo di capra (H+L) Alexa Fluor 568 coniugato	Thermo-Fisher Scientific	A-11004	Fattore di diluizione - 1:500
Anticorpo secondario anti-IgG umano di capra (H+L) Cross-Adsorbito, Alexa Fluor 488	Thermo-Fisher Scientific	A-11013	Fattore di diluizione - 1:500
IgG anti-coniglio di capra (H+L) Alexa Fluor 568 coniugato	Thermo-Fisher Scientific	A-11011	Fattore di diluizione - 1:500