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Articolo metodologico

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

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DOI:

10.3791/56739

⸱

2 aprile 2018

 ,  , 
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un'elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per separare e identificare adenoma pituitario umano tessuto proteoma, che presenta un modello 2DE buona e riproducibili. Molte proteine sono osservati in ogni spot 2DE analizzando nel complesso cancro proteoma con l'uso di MS ad alta sensibilità.

Abstract

Adenoma pituitario umano (PA) è un tumore comune che si verifica nella ghiandola pituitaria umana nei sistemi di asse ipotalamo-ipofisi-mirati dell'organo e può essere classificato come PA clinicamente funzionali o non funzionali (FPA e NFPA). NFPA è difficile per diagnosi di stadio precoce e la terapia a causa di a malapena elevando gli ormoni nel sangue rispetto al FPA. Il nostro obiettivo a lungo termine consiste nell'utilizzare metodi di proteomica alla scoperta di biomarcatori affidabili per chiarimento dei meccanismi molecolari di PA e riconoscimento delle efficaci marcatori diagnostici, prognostici e bersagli terapeutici. Efficace elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiato con metodi di spettrometria di massa (MS) sono stati presentati qui per analizzare proteomi PA umani, compresa la preparazione dei campioni, 2D elettroforesi del gel, visualizzazione di proteine, analisi delle immagini, in gel digestione della tripsina, impronta digitale totale del peptide (PMF) e tandem (MS/MS) di spettrometria di massa. 2-dimensional gel elettroforesi matrix-assisted laser desorbimento/ionizzazione spettrometria totale PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS e le procedure di MS/MS cromatografia 2DE-liquido (LC) sono state applicate con successo in un'analisi del proteoma NFPA. Con l'uso di uno spettrometro di massa ad alta sensibilità, molte proteine sono state identificate con il metodo 2DE-LC-MS/MS in ogni gel 2D spot in un'analisi del complesso tessuto di PA per massimizzare la copertura del proteoma umano PA.

Introduzione

PA è un tumore comune che si verifica nella ghiandola pituitaria umana nei sistemi di asse ipotalamo-ipofisi-mirati dell'organo, che svolgono un ruolo importante nel sistema endocrino umano. PA comprende clinicamente funzionali e non funzionali PAs (FPA e NFPA)1,2. NFPA è difficile nella diagnosi di stadio precoce e la terapia a causa di livelli di ormone solo leggermente elevati (ad es., LH e FSH) nel sangue rispetto al FPA, che ha aumentato significativamente i livelli di ormoni corrispondenti nel sangue3,4 ,5. Il chiarimento dei meccanismi molecolari e scoperta di biomarcatori efficace è importante significato clinico nella diagnosi, terapia e prognosi di NFPA. Il nostro obiettivo a lungo termine è quello di sviluppare e utilizzare metodi di proteomica per studiare NFPA per la scoperta di biomarcatori affidabili per chiarire i meccanismi molecolari e riconoscere bersagli terapeutici efficaci così come marcatori diagnostici e prognostici. 2-DE accoppiato con metodi MS sono stati ampiamente usati nel nostro programma di ricerca a lungo termine per quanto riguarda umano PA proteoma1,2,6,7, compresa l'istituzione di riferimento proteome Mappe:3,8, analisi di proteine differenzialmente espresse profili9,10,11,12,13, varianti di ormone14 ,15, modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione della tirosina e14 nitrazione16,17,18, la variazione di proteomica di invasivo rispetto al non invadente NFPAs19e l'eterogeneità di proteomica di NFPA sottotipi13, che ha condotto alla scoperta di più reti via importante (disfunzione mitocondriale, disregolazione del ciclo cellulare, stress ossidativo e segnalazione MAPK anomalia di sistema) che vengono modificate in NFPA13,19,20.

2DE separa le proteine secondo il loro punto isoelettrico (pI) (messa a fuoco isoelettrica, IEF) e il peso molecolare (tramite elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. si tratta di una tecnica di separazione classica e comuni nel campo della proteomica, poiché l'introduzione dei concetti del proteoma e la proteomica in 199524. MS è la tecnica fondamentale per scoprire l'identità delle proteine 2DE-separati, comprese strategie di PMF e MS/MS. Il molto rapido sviluppo degli strumenti di MS, soprattutto negli aspetti della sensibilità di rilevazione e risoluzione, in combinazione con il miglioramento del sistema di LC, migliora notevolmente l'identità delle proteine di basso o bassissimo abbondanza in un proteoma per massimizzare la copertura di un proteoma. Essa contesta anche i nostri concetti tradizionali che solo uno o due proteine sono presenti in un gel 2D spot in un'analisi del proteoma di tessuto umano complesso e offre l'opportunità di identificare proteine multiple in un gel 2D spot in un'analisi del complesso tessuto umano proteoma e massimizzare la copertura del proteoma NFPA.

Qui descriviamo protocolli dettagliati di 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS e 2DE-LC-MS/MS che sono state utilizzate con successo nell'analisi del proteoma umano NFPA. I protocolli prevedono la preparazione di campioni, prima dimensione (messa a fuoco isoelettrica, IEF), seconda dimensione (SDS-PAGE), visualizzazione delle proteine (macchiatura d'argento e la macchiatura blu di Coomassie), analisi del gel 2D, digestione della tripsina in-gel, l'immagine purificazione di peptidi triptici, PMF, MS/MS e database bruciante3,8,25,26. Inoltre, questo protocollo si traduce facilmente per l'analisi di altri proteomi di tessuto umano.

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Protocollo

Il presente protocollo segue le linee guida del Xiangya ospedale medica etica Comitato della Central South University, Cina. Un tappo di testa e guanti devono essere indossati per l'intera procedura sperimentale evitare la contaminazione di cheratina da pelle e capelli8.

1. preparazione dei campioni

  1. Raccogliere tessuti PA (0,2 - 0,5 mg) dal reparto neurochirurgico. Immediatamente congelato in azoto liquido e poi il trasferimento a-80 ° C per la conservazione.
  2. Aggiungere 2 mL di 0,9% NaCl in acqua distillata deionizzata (ddH2O). Utilizzare questa soluzione leggermente lavare il sangue dalla superficie del tessuto (3x).
    Nota: ddH2O con una conducibilità di 18,2 MΩ/cm è utilizzato in tutto il protocollo. Alcune del tissuemight essere perso quando si lava via il sangue dalla superficie di un tessuto.
  3. Aggiungere un volume (10 mL; 4 ° C) della soluzione contenente acido acetico 2m e 0,1% (v/v) β-mercaptoetanolo per ogni 0,5 - 0,6 g di tessuto, omogeneizzare (1 min, 13.000 rpm, 4 ° C, x 10) con un omogeneizzatore del tessuto, trattare con ultrasuoni l'omogeneizzato per 20 s, lyophilize e conservare a − 80 ° C.
  4. Misurare il contenuto proteico del liofilizzato, omogeneizzati campioni usando acido bicinconinico (BCA) kit di saggi.
    Nota: Quantificazione di BCA non è una quantificazione assoluta, e il risultato della misurazione sarà alterato con un tecnico diverso e l'agente sperimentale. Uno standard di campione di concentrazione fissa deve essere utilizzato per diversi esperimenti. Pertanto, l'importo finale carico di proteine per ogni gel 2D sarà essere determinato con l'argento o tinto Coomassie buono-risoluzione immagine negli esperimenti pre-progettati.
    1. Aggiungere circa 300 µ g del campione omogeneizzato liofilizzato per un volume (µ l 282) di estrazione di proteine buffer (urea 8 M e 4% CHAPS), seguita da in piedi per 2 h, sonicating in un bagno d'acqua per 5 min, rotante per 1 h, sonicating nuovamente nel bagno d'acqua per 5 min , ruotando nuovamente per 1 h e centrifugazione a 15.000 x g per 20 min.
    2. Preparare soluzioni standard di BSA con concentrazioni come accennato: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 µ g/mL con lo standard commerciale di BSA (2 mg/mL).
    3. Reagente di BCA mix A e B (A:B = 50: 1) come soluzione di lavoro BCA prima dell'uso.
    4. Aggiungere 0,1 mL di campione o la soluzione standard a 2 mL di soluzione di lavoro di BCA in un tubo di microfuge, seguito da miscelazione e poi incubare a 37 ° C per 30 min. Infine raffreddare a temperatura ambiente per 10 min e misura A562 nm O.D. valore.
    5. Calcolare la linea lineare standard (A562 nm vs concentrazione BSA) per ottenere un'equazione di regressione per il calcolo del campione contenuto proteico con un valore di562nm .
  5. Utilizzare 150 µ g del campione liofilizzato equivalente proteico per la macchiatura d'argento, o 500 µ g di proteina per Coomassie macchiatura, per un pH di striscia 18 cm pH immobilizzati (IPG) gradiente 3-10 non lineare (NL).
    Nota: La striscia di asciutto di IPG è largo 0,5 mm spessa e 3 mm con lunghezze differenti compreso 7, 11, 13, 18 e 24 cm e intervalli di pH diversi tra cui pH 4-5, 4-7, 6-9 e 3-10 in entrambi una sfumatura lineare o non lineare pH. Il buffer IPG utilizzato deve inserirsi la striscia27,28.
  6. 1.6.Add 250 µ l di tampone di estrazione (7m urea, 2m tiourea, CHAPS 4% (p/v), 100 mM DTT (aggiungere prima dell'uso), 0,5% v/v pharmalyte (aggiungere prima dell'uso) e una traccia di blu di bromofenolo).
  7. Mantenere la soluzione sotto 30 ° C, seguita da Vortex per 5 min, sonicating per 5 min e rotanti per 50 min.
  8. 110 µ l di tampone di reidratazione (7m urea, 2m tiourea, CHAPS 4% (p/v), 60 mM DTT (aggiungere prima dell'uso), buffer di IPG 0,5% v/v (aggiungere prima dell'uso) e una traccia di blu di bromofenolo). Sonicare per 5 min. Quindi ruotare il campione per 50 min, vortexare per 5 min e centrifugare per 20 min a 15.000 x g.
  9. Raccogliere il surnatante (350 µ l) come la proteina esempio soluzione8.

2. bidimensionale del Gel elettroforesi

  1. IEF (prima dimensione): eseguire il sistema di messa a fuoco isoelettrico IEF come descritto di seguito.
    1. Aggiungere 350 µ l della soluzione del campione di proteina nella fessura di un titolare di striscia IPG 18 cm.
    2. Mettere un 18 cm IPG strip gel-side-down sulla soluzione di campione della proteina (evitare bolle).
    3. Aggiungere 3-4 mL di olio minerale per coprire la striscia IPG.
    4. Assemblare il supporto IPG nel sistemacon messa a fuoco isoelettrica l'estremità appuntita sulla piastra posteriore (+) e l'estremità quadrata sulla piastra anteriore (−).
    5. Reidratare il pernottamento (~ 18 h a temperatura ambiente).
    6. Impostare i parametri IEF: corrente massima 30 µA per striscia, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, passo e tenere premuto; 1.000 V, gradiente di 1h, 500 Vh, 8.000 V, gradiente di 1h, 4.000 Vh, 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, passo e tenere premuto; e 500 V, 0,5 h, 250 Vh, passo e tenere premuto. Lasciar correre a un tempo totale di 7,5 h e 36.875 Vh.
    7. Dopo IEF, togliere ogni strip IPG e rimuovere l'olio minerale con un tovagliolo di carta insolubile. Ora avvolgere la striscia in un foglio di pellicola trasparente e conservare a − 80 ° C.
      Nota: Il titolare di IPGstrip deve essere pulito con il titolare di IPGstrip soluzione detergente e acqua distillata.
  2. SDS-PAGE (seconda dimensione): eseguire SDS-PAGE in un sistema di elettroforesi cellulare verticale
    Nota: Ogni dimensione del gel di SDS-PAGE dovrebbe essere 255 x 190 x 1 mm.
    1. Utilizzare un multi-gel caster per lanciare 12% pagina risoluzione dei gel. Per colata 12% gel pagina, attenersi alla seguente procedura.
      1. Aggiungere mL 270 di ddH2O, 150 mL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL di soluzione madre di acrilammide/bisacrylamide 40% (p/v) (29: 1, 40% w/v acrilammide e 1,38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 mL di 10% ammonio persolfato e 150 µ l di TEMED per rendere il gel soluzione in un becher. Mescolare delicatamente ed evitare bolle.
      2. Versate la soluzione di gel delicatamente nella camera di multicasting fino all'altezza di gel previsto (19 cm).
      3. Immediatamente aggiungere circa 3 mL ddH2O su ogni gel di risoluzione per coprire i gel. Lasciare che il gel polimerizzare per circa 1 h.
    2. Preparare 20 L di tampone di elettroforesi (25 mM Tris, glicerina di 192 mM e 0,1% SDS). Riempire il serbatoio tampone di elettroforesi separazione unità con questo buffer.
    3. Togliere le strisce IPG focalizzate dal freezer ed equilibrare le strisce per 10 min da dondolo delicatamente in 4 mL di tampone di equilibrio (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urea, 2% (p/v) SDS, glicerolo 20% (v/v), 2% w/v DTT (aggiungere prima dell'uso) di ridurre e una traccia di blu di bromofenolo).
    4. Equilibrare per 10 min da dondolo delicatamente le strisce IPG ridotte in 4 mL di tampone di equilibrio alchilazione (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urea, 2% (p/v) SDS, 20% (v/v) glicerolo, 2,5% w/v iodoacetamide (aggiungere prima dell'uso) e una traccia di blu di bromofenolo).
    5. Durante gel equilibrio, smontare la camera di multicasting ed estrarre il vassoio del gel di risoluzione preparata. Lavare 3 volte con ddH2O. Remove in eccesso ddH2O con un tovagliolo di carta insolubile e messo in un gel di stander.
    6. Sciacquare le strisce IPG equilibrate con il tampone di elettroforesi ed eliminare il liquido in eccesso sulla superficie IPG striscia con il tovagliolo di carta insolubile.
    7. Mettere una striscia IPG sul gel di SDS-PAGE di risoluzione e lasciare che la plastica lato della strip IPG contattare la lastra di vetro più lungo e l'estremità appuntita verso sinistra.
    8. Versare 3-4 mL di caldo agarosio all'1% in tampone di elettroforesi di SDS (~ 80 ° C) rapidamente per sigillare la striscia IPG sulla cima di ogni gel di SDS-PAGE e mettere il lato superiore della striscia IPG fino alla cima della lastra di vetro più breve senza bolle e poi polimerizzare per 10 min.
    9. Inserire il vassoio del gel assemblato verticalmente fra plastica guarnizioni del sistema di elettroforesi verticale. Mettere la parte superiore del gel con la striscia IPG accanto il catodo (−).
    10. Regolare il livello del buffer di elettroforesi per immergere il vassoio del gel.
    11. Collegare e impostare l'unità di controllo e alimentazione potenza in modalità di tensione costante e correre a 200 V per circa 370 min mentre la tintura di monitoraggio.
    12. Dopo l'esecuzione, estrarre il vassoio dal sistema di elettroforesi del gel e rimuovere delicatamente il gel dal vassoio del gel, evitando strappi il gel, seguito dalla colorazione delle proteine 2DE-separati.
  3. Colorazione delle proteine 2DE-separati
    1. Macchiatura d'argento
      1. Trasferire delicatamente il gel con le due mani in un vassoio contenente 250 mL di soluzione di fissaggio (metanolo al 50% (v/v) e acido acetico al 5% (v/v)) e agitare delicatamente il gel per 20 min.
      2. Scartare la soluzione e aggiungere 250 mL di metanolo al 50% (v/v) nel vassoio e agitare delicatamente per 10 min.
      3. Scartare il metanolo e aggiungere 250 mL di ddH2O nel vassoio. Agitare delicatamente per 10 min.
      4. Agitare il gel per 1 min in 250 mL di tampone di sensibilizzazione contenente 0,02% (p/v) di tiosolfato di sodio, delicatamente e scartare il liquido.
      5. Agitare delicatamente il gel in 250 mL di ddH2O per 1 min (ripetere ancora una volta). Eliminare il liquido dopo ogni passaggio.
      6. Agitare delicatamente il gel per 20 minuti in una soluzione di reazione 250 mL argento (nitrato d'argento 0,1% (p/v) con 200 µ l 37% (v/v) di formaldeide aggiunto prima dell'uso).
      7. Agitare delicatamente il gel in 250 mL di ddH2O per 1 min (ripetere ancora una volta). Eliminare il liquido dopo ogni passaggio.
      8. Agitare delicatamente il gel 250 mL di soluzione di sviluppo (carbonato di sodio 3% (p/v) con 100 µ l 37% (v/v) di formaldeide aggiunto prima dell'uso) fino ad ottenere l'intensità di colorazione desiderata (comunemente 1-3 min), quindi eliminare il liquido.
      9. Agitare il gel per 10 min in 250 mL di soluzione (acido acetico 5% (v/v)) di arresto delicatamente e scartare il liquido.
      10. Agitare per 5 min in 250 mL di ddH2O delicatamente e scartare il liquido.
      11. Tenere il gel 250 mL archiviazione soluzione del 8,8% glicerolo a 4 ° C.
    2. Colorazione blu brillante di Coomassie
      1. Preparare Coomassie macchiatura soluzione sciogliendo brillante di Coomassie blue G250 0,3 g, 25 g di solfato di ammonio e acido fosforico 25 mL in ddH2O e fino a un volume totale di 200 mL. Prima dell'uso, aggiungere metanolo 50 mL.
      2. Aggiungere 250 mL di Coomassie soluzione al gel di colorazione e agitare delicatamente a temperatura ambiente fino a clear spot proteici appaiono (~ 2-4 h). Eliminare il liquido.
      3. Aggiungere 250 mL di ddH2O e agitare lentamente per 5 minuti, quindi due volte più. Eliminare il liquido.
      4. Aggiungere 250 mL di soluzione decolorante (etanolo al 20% (v/v)) e agitare lentamente fino a quando il colore di sfondo diventa quasi incolore ed eliminare il liquido.
      5. Sostituire con la soluzione decolorante fresca quando il vecchio si sta facendo buio e scartare il liquido.
      6. Aggiungere 250 mL di ddH2O e agitare lentamente per 5 min. scartare il liquido.
      7. Aggiungere 250 mL di soluzione (8,8% glicerolo) di memorizzare e conservare a 4 ° C.
  4. Analisi di immagini di elettroforesi bidimensionale del gel
    1. Digitalizzare i gel colorati con uno scanner piano.
    2. Il sistema di analisi di immagine 2D gel, inserire l'immagine.
    3. Rilevare e quantificare ogni spot utilizzando un software di analisi di immagine 2D gel secondo il protocollo del produttore.
    4. Corrispondere le macchie tra gel differenti.

3. identificazione di proteine 2DE-separati con MS

  1. Preparazione della miscela peptide triptico
    Nota: Siliconata o bassa ritenzione tubi e puntali devono essere utilizzati per evitare qualsiasi perdita di proteine o peptidi.
    1. Argento-gel decolorante
      1. Asportare il gel macchie in un 1,5 mL siliconate tra tubo e lavare in 500 volte di2O 6 ddH µ l.
      2. Mettere il gel lavato in un nuovo tubo di 1,5 mL siliconato e usa mezzi in tanti piccoli pezzi (0,5-1 mm3).
      3. Decolorare i pezzi di gel in 20 µ l della soluzione decolorante che mescola una parte di ferricianuro di potassio di 30 mM e una parte di tiosolfato di sodio di 100 mM (1:1) prima dell'uso per lasciare il colore brunastro scomparire (comunemente 1-2 min). Eliminare il liquido.
      4. Lavare i pezzi di gel con 20 µ l di ddH2O 5 - 6 volte lasci il colore giallo a sparire. Eliminare il liquido dopo ogni passaggio.
      5. Aggiungere 20 µ l di bicarbonato di ammonio di 200 mM per i pezzi di gel e rimanere per 20 min. lavare i pezzi gel con ddH2O (20 µ l, 1 ora). Eliminare il liquido.
      6. Disidratare i pezzi gel con 30 µ l di acetonitrile, almeno due volte per lasciare che i pezzi di gel girare un bianco opaco e vuoto-centrifuga a secco per 30 min.
    2. Coomassie blu brillante del gel decolorante
      1. Tagliare macchie di gel in una provetta da 1,5 mL siliconato e lavare con 500 µ l ddH2O almeno 3 volte.
      2. Mettere il gel lavato in un nuovo tubo siliconato 1,5 mL e usa mezzi in più pezzi (0,5-1 mm3) con un puntale.
      3. Decolorare il gel in 50-100 µ l di soluzione decolorante (1:1 v/v mix 200mm NH4HCO3 con acetonitrile) a seconda del volume di gel, incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua. Ripetere e aggiungere soluzione decolorante fresco fino a quando il colore scomparirà (~ 1 h). Eliminare il liquido dopo ogni passaggio.
      4. Lavare i pezzi di gel una volta con 20 µ l di ddH2O.
      5. Disidratare i pezzi di gel in 100 µ l acetonitrile (almeno due volte) di lasciare i pezzi gel girare un opaco bianco.
      6. Vuoto a secco per 30 min.
    3. Digestione della tripsina in-gel delle proteine nei pezzi gel secchi
      1. Sciogliere 20 µ g (833 pmol) di polvere liofilizzata tripsina in 100 µ l di acido acetico 50 mM.
      2. Diluire 20 µ l di soluzione di tripsina (200 ng / µ l) a 16 ng / µ l con 230 µ l di bicarbonato di ammonio di 50 mM.
      3. Aggiungere 20-30 µ l (0,32-0,48 µ g) della soluzione diluita di tripsina in ogni provetta contenente gel secchi pezzi. Incubare per 18-20 h a 37 ° C in bagnomaria. Lasciare riposare a 4 ° C per 30 min.
      4. Centrifugare la soluzione delicatamente per 10 s. Sonicate in bagno d'acqua per 5-6 min a 30 ° C e poi Centrifugare a 12.000 x g per 2 min.
      5. Raccogliere il surnatante contenente miscela peptide triptico in un tubo siliconato 0.5 mL.
    4. Purificazione della miscela di peptide triptico con C18 microcolonna.
      1. Lavare ogni colonna C18 con acetonitrile (10 µ l, 5 volte) e poi con 50% acetonitrile (10 µ l, 5 volte).
      2. Equilibrare con 0,1% trifluoro acetico acido (TFA) (10 µ l, 5 volte).
      3. Dispensare il campione su e giù attraverso la colonna C18 preparata per 15 volte.
      4. Lavare il campione 2 x con 10 µ l 0,1% TFA.
        Nota: I peptidi triptici purificati vengono mantenuti nella colonna C18.
      5. Aggiungere un volume (6 µ l) di soluzione (acido formico 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v) in un tubo siliconato pulito 0,5 mL, pipettare questa soluzione delicatamente e lentamente su e giù attraverso perle di peptide-C18 per 10 x lavare i peptidi di legame nella soluzione, asciugare e store (− 20 ° C) per analisi MS.
  2. Analisi MS
    1. Analisi MALDI-MS PMF
      1. Aggiungere 4 µ l di 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA per sciogliere la miscela peptide triptico purificata. Carico 2 µ l dissolto peptide triptico miscela su un piatto MALDI e immediatamente aggiungere 2 µ l di soluzione di acido а-cyano-4-idrossicinnamico (CHCA) che contiene 10 g/L a 500 mL/L di acetonitrile 1 mL/L TFA, quindi asciugare all'aria.
      2. Caricare la piastra MALDI con miscela peptide triptico in uno spettrometro di massa MALDI-MS.
        Nota: I parametri dello strumento sono impostati come modalità di reflector con 20 kV accelerando la tensione, polarità positiva e 160 ns ritardo tempo di estrazione. Ogni spettro MS viene acquisito con 200 colpi di laser con una gamma di m/z 1.000 a 4.000 dopo calibrazione esterna con il peptide standard massa.
      3. Utilizzare un software di elaborazione dello spettro MS per elaborare ogni spettro MS, tra cui la correzione della linea di base, rimozione del rumore (5%) e picco deisotoping.
      4. Correggere l'elenco di massa da ogni spettro MS con la rimozione di contaminanti masse da tripsina, matrix, cheratine e altri contaminanti sconosciuti in parallelo di esperimenti di vuoto-gel.
      5. Ingresso la massa corretta riportate in una proteina PMF-based software per identificare le proteine nel database di proteina di Swiss-Prot con i seguenti parametri di ricerca, compreso il tipo di ricerca PMF, umano, di ricerca clivaggio tripsina con 1 massimo persa, fisso carbamidomethyl cisteina, metionina variabile ossidazione, monoisotopic, tolleranza di massa del peptide 50ppm, carica del peptide di stato (1 +) e segnale/rumore (S/N) 5.0.
      6. Identificare le proteine con i punteggi di proteina statisticamente significativo, e dove la proteina Punteggio =-10 × log(p), dove p è la probabilità che la partita osservata è un evento casuale.
    2. Analisi MALDI-MS/MS
      1. Aggiungere 4 µ l di 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA per sciogliere la miscela peptide triptico purificata. Ogni miscela purificata peptide triptico (0,5 µ l) era macchiato su una piastra MALDI 384 pozzetti, immediatamente notato 0,5 µ l di saturi matrix CHCA in acetonitrile/0.1% 50% TFA sulla parte superiore del campione di peptide e poi essiccato all'aria.
      2. Lasciate che il MALDI-TOF-TOF MS/MS per essere gestita automaticamente, utilizzando 100 colpi di laser per acquisire uno spettro MS1, e accumulando 6 ripetuto MS1 spettri in uno spettro di MS1 sintetico.
      3. Impostare 4 ioni precursori più intenso da ogni spettro MS1 sintetico per analisi MS/MS. Uso laser 100 scatti per ogni ione precursore di acquisire uno spettro MS/MS e accumulare 4 ripetono spettri MS/MS in uno spettro di MS/MS sintetico.
      4. Utilizzare i dati sintetici di MS/MS per la ricerca di proteine attraverso una proteina basate su MS/MS, software di ricerca con parametri tra cui MS/MS Ion ricerca, database umano di Swiss-Prot, tripsina con un massimo di 1 mancato clivaggio, carbamidomethyl fisso (C), variabile Ossidazione (M), valore di massa monoisotopic, peptide massa tolleranza ± 100 ppm e frammento di massa tolleranza ± 0,7 Da.
      5. Identificare una proteina con una probabilità statisticamente significativa basata sul punteggio di Mowse e ioni Punteggio = -10 x Log(P), dove p è la probabilità che la partita osservata è un evento casuale.
    3. Analisi LC-ESI-MS/MS
      1. Aggiungere 6 µ l di acido formico al 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v per sciogliere la miscela peptide triptico purificata.
      2. Utilizzo un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) online accoppiato con un'ionizzazione electrospray (ESI)-MS/MS di massa spettrometro con un software di gestione dati-acquistata di MS/MS per gestire l'intera operazione.
      3. Utilizzare la colonna C18 trappola (300 µm i.d. × 5 mm di lunghezza) e colonna di fase inversa C18 (75 µm i.d. x 15 cm di lunghezza) con un gradiente di separazione al 98% di solvente A (0,1% formico acido) e 2% solvente B (acido formico 0.1% a 100% acetonitrile) per 2 min , 2% al 40% solvente B per 45 min, 40% al 95% solvente B per 5 min e solvente B al 95% per 10 min (un totale di 65 min a 300 nL/min).
      4. Impostare modalità ioni positivi e sorveglianza automatica dipendente dai dati di acquisire spettri MS e MS/MS e impostare la dissociazione indotta da collisione (CID) per frammentazione di ioni.
      5. Impostare ogni scansione MS su un intervallo di massa di m/z 350-1.800 con una risoluzione di 100.000 a m/z 400. Eseguire la scansione per i 7 ioni più intenso durante la scansione di MS.
      6. Proteina basate su uso MS/MS, software di ricerca ho per cercare nel database per l'identificazione delle proteine.
        1. Selezionare il database di proteina umana.
        2. Selezionare tripsina con uno sito di clivaggio mancato permesso.
        3. Impostare la tolleranza del peptide (± 10 ppm), frammento di tolleranza dello ione (± 0.8 Da), peptide carbamidomethylation di carica (2 + 3 + e 4 +), fissato a cisteina e ossidazione variabile a metionina.
        4. Fissare i tassi di falsi scoperta (FDR) < 1% e solo peptidi con rango 1 sono accettati.
        5. Identificare la proteina con PSM≥1 (PSMs: il numero totale di sequenze peptidiche identificati (PSMs) per la proteina, comprese quelle identificate ridondante) e almeno due peptidi unici per proteina.
      7. Inoltre, è possibile utilizzare basato su MS/MS di software di proteine cercato II per cercare nel database per l'identificazione delle proteine.
        1. Convertire i file raw di MS in un file di .mgf.
        2. Selezionato il database di proteina umana (uniprothuman_20161031.fasta che contiene 70940 sequenze e 23897047 residui).
        3. Selezionare digestione della tripsina con un massimo di 2 divisioni perse.
        4. Fisso carbamidomethyl (C), variabili deamidati (NQ) e ossidazione (M), tolleranza di massa dello ione precursore 10ppm, tolleranza di massa dello ione figlia 0.8 Da e monoisotopic picco.
        5. Identificare le proteine con una soglia di significatività di 0,05 e almeno 2 dei peptidi unici.

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Risultati

1. 2DE-MALDI MS PMF: con la procedura sperimentale descritta sopra, sono stati estratti un totale di 150 µ g proteine dai tessuti NFPA FSH-espresso (donna; 50 anni, ACTH (-), GH (-), PRL (-), (-) di LH e FSH (+) e TSH (-)) e schierati con un 18cm IPG strip (pH 3-10 NL) e un gel di SDS-PAGE di grande formato, poi visualizzati con la macchiatura d'argento. Abbiamo ottenuto un modello di gel 2DE riproducibile e buona di NFPA tessuto proteoma (

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Discussione

2de, accoppiato con MS metodi tra cui 2DE-MS PMF e 2DE-MS/MS, è stato utilizzato con successo nel nostro programma a lungo termine - l'uso della proteomica per studiare la variazione di proteomica umane NFPA e rete molecolare per la delucidazione dei meccanismi molecolari e scoperta di biomarcatori efficace per NFPAs. Proteomica comparativa basata su 2DE con buona riproducibilità svolge un ruolo importante nell'identificazione di NFPA proteomica variazioni9,10

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non esiste alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant n. 81572278 e 81272798 a XZ), le sovvenzioni da Cina "863" Plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 a XZ), i fondi di ospedale Xiangya per introduzione di talento (a XZ) e il Hunan Fondazione di scienza naturale provinciale della Cina (Grant No. 14JJ7008 a XZ). Gli autori riconoscono anche il contributo scientifico del Dr. Dominic M. Desiderio in Health Science Center della University of Tennessee. X.Z. continuamente sviluppato e utilizzato metodi 2DE-MS per analizzare il proteoma di adenoma pituitario a partire dal 2001, concepito il concetto per il manoscritto presente, ha scritto e rivisto il manoscritto, coordinato i lavori pertinenti ed è stato responsabile per la sostegno finanziario e il lavoro corrispondente. Y.L. partecipato revisione del manoscritto. Y.H ha partecipato insieme di riferimenti e revisione del manoscritto. Tutti gli autori approvato il manoscritto finale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ettan IPGphor 3 Sistema di focalizzazione isoelettricaGE Healthcare
Ettan DALTsix ruota multigelAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II SystemAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAIl sistema di elettroforesi verticale
Ettan IPGphor strip holderAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USARuota multigel
Voyager DE STR MALDI-TOF MSABI, Foster City, CAMALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, BrukerMALDI-MS/MS spettrometro di massa
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA,Spettrometro di massa ESI-MS/MS
EASY-NANO LC SYSTEM&NBSP;Proxeon Biosystems, Odense, DanimarcaSistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni
PepMap C18 trap column 300 μ m i.d. &volte; Lunghezza 5 mm; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 colonna75 μ m i.d., lunghezza 15 cm; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, Stati Uniti
KimWipeKimvipeAsciugamano di carta insolubile
Watter Realizzatoda PURELAB strumento
Polytron Modello P710/35 omogeneizzatoreBrinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  Hercules, CASoftware di analisi di immagini su gel 2D
SEQUEST Thermo Proteome Discoverer 1.3 (versione n. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) softwareper l'elaborazione dello spettro
Software Mascotsoftware per la ricerca di proteine basato su PMF   
Softwareper la ricerca di proteine basato su MS/MS
Software Proteome Discoverer v.1.3 betaSoftware Thermo Scientific
Xcalibur v.2.1Software di gestione dei dati acquisiti MS/MS 
Uniprot versione 201410.1_HUMAN.fastaDatabase di proteine umane
SEQUEST (versione n. 1.3.0.339) Software per la ricerca di proteine basato su MS/MS I
MASCOT (versione 2.3.02) Software per la ricerca di proteine basato su MS/MS Kit standard per
Millipore
PeptideMass perPerspective Biosystems
Kit per il dosaggio delle proteine BCA PierceTermo  Fisher Scientific23227
Kit Quant 2DGE Healthcare80-6483-56
BIS-ACRILAMMIDEAMRESCO0172
ACRILAMMIDEAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
TioureaSigma-AldrichT8656
UreaVETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
Ammonio PersolfatoAMRESCOM133
TripsinaPromega, Madison, WI, USAV5111
IPG tampone pH 3-10, NLGE Healthcare17-6000-87
Striscia Stagna Immobilina pH 3-10NL,18cmGE Healthcare17-1235-01
. USA flessibile MS software Mascot Software microcolonna microcolonna C18

Riferimenti

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