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Articolo metodologico

Topo adulto DRG Explant e dissociato modelli cellulari per studiare neuroplasticità e risposte agli insulti ambientali, compreso l'infezione virale

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⸱

DOI:

10.3791/56757

⸱

9 marzo 2018

 ,  , 
1Department of Anatomy, Chicago College of Osteopathic Medicine (CCOM), Midwestern University, 2Department of Microbiology and Immunology, Chicago College of Osteopathic Medicine (CCOM), Midwestern University

In questo articolo

Sommario

In questo rapporto, vengono evidenziati i vantaggi delle colture organotipiche e colture primarie dissociate di gangli spinali del mouse-derivati per studiare una vasta gamma di meccanismi connessi con interazione neurone-glial, neuroplasticità, neuroinflammation e risposta all'infezione virale.

Abstract

Questo protocollo descrive un modello ex vivo di derivato del mouse radice dorsale gangli (DRG) espianto e in vitro DRG-derivati co-cultura di neuroni sensoriali dissociati e cellule gliali satellitare. Questi sono modelli utili e versatili per indagare su una serie di risposte biologiche associate condizioni fisiologiche e patologiche del sistema nervoso periferico (PNS) che vanno dall'interazione neurone-glial, neuroplasticità, neuroinflammation e infezione virale. L'utilizzo di espianto DRG è scientificamente vantaggiosa rispetto ai modelli semplicistici unicellulari per molteplici ragioni. Per esempio, come una coltura organotypic, explant DRG consente il trasferimento di ex vivo di un'intera rete neuronale, tra cui il microambiente extracellulare che giocano un ruolo significativo in tutte le funzioni neuronali e gliali. Ulteriormente, i DRG espianti possono essere mantenuti anche ex vivo per diversi giorni e le condizioni della coltura possono essere perturbate come desiderato. Inoltre, il DRG raccolte possono essere dissociate ulteriormente nella co-cultura in vitro di neuroni sensoriali primari e cellule gliali satellite per studiare l'interazione di un neurone-glial, neuritogenesis, cono axonal interazione con extracellulare microambiente e più generale, qualsiasi aspetto connesso con il metabolismo di un neurone. Pertanto, il sistema di DRG-espianto offre una notevole flessibilità per studiare una vasta gamma di eventi legati alle condizioni biologiche, fisiologiche e patologiche in un modo economicamente vantaggioso.

Introduzione

In questo manoscritto, segnaliamo un metodo per ottenere un modello ex vivo organotipiche di un sistema di modello DRG mouse derivato come un microambiente simil-tessuto conservato per studiare una vasta gamma di risposte biologiche agli insulti PNS che vanno dal neurone-glial interazione, neuroplasticità, indicatori infiammatori, all'infezione virale. Inoltre, abbiamo ulteriormente sviluppato un protocollo per creare una co-cultura primaria di DRG-derivato singoli neuroni sensoriali e cellule satelliti.

Il DRG sono grigio-materia-unità satellite situato di fuori del sistema nervoso centrale (SNC) lungo le radici spinali dorsali dei nervi spinali. DRG, situato in prossimità dei forami intervertebrali, casa pseudounipolar sensoriale neuroni e cellule gliali satellitare. I neuroni pseudounipolar dispongono di un singolo del neurite che si divide in un processo periferico che trasportano ingressi somatici e viscerali da bersagli periferici al corpo cellulare e un processo centrale che invia informazioni sensoriali dal corpo cellulare nel sistema nervoso centrale. Una capsula connettiva definisce e consente di isolare questo cluster periferico dei neuroni e cellule gliali dallo SNC. Nessuna migrazione cellulare postnatale a o dal DRG è mai stato descritto ed una nicchia delle cellule staminali locali è responsabile neurogeni eventi che si verificano nel corso della vita1. Pertanto, questo modello è particolarmente adatto a studiare nella neurogenesi adulta, assonogenesi, risposta alla lesione traumatica e cellule morte2,3,4,5,6,7 ,8,9 .

Nel campo della neurorigenerazione, DRG raccolte da in vivo ed espiantati in vitro riproduce axonotmesis, una condizione di pregiudizio in cui assoni sono completamente reciso e il corpo cellulare neuronale viene disconnesso dalla destinazione innervata10 ,11. È noto che ferita periferica del nervo può causare l'espressione genica in diminuzione e aumento in DRG e molti di questi cambiamenti sono il risultato dei processi rigenerativi ma molti possono anche essere il risultato della risposta immunitaria o un'altra risposta da cellule non neuronali. Utilizzando un ex vivo sistema di DRG isolato, alcuni di questa complessità è rimosso e meccanicistiche vie è possibile analizzare più facilmente.

Oltre il suo ruolo centrale nel trasmettere input sensoriali al sistema nervoso centrale, l'abbondanza di recettori per molti neurotrasmettitori quali GABA12,13,14,15 a livello del soma neuronale nonché prove di interneuronale Croce-eccitazione possono suggerire che DRG sono sofisticati integratori preliminari di input sensoriali16,17. Queste nuove scoperte conferiscono al explant DRG le caratteristiche di un sistema di rete mini-neuronale simile ad altri modelli di "mini-cervello", che sono nervoso-tessuto-specifica organoids utilizzato per più ampi campi sperimentali di indagine e terapeutico approccio a malattie neurologiche18,19. Queste evidenze insieme al fatto che il DRG è un cluster discreto e ben definito del tessuto neuronale, circondato da una capsula connettiva, lo rendono un organo adatto per il trapianto di ex vivo .

Coltura mouse DRG presenta un'interessante opzione pluricellulare per modellare pathophysiologies umano dovuto le somiglianze strutturali e genetiche tra le specie. Inoltre, un grande repository di ceppi di topi transgenici è altamente favorevole per futuri studi meccanicistici. Estensione del neurite sia durante lo sviluppo che dopo la ferita richiede interazioni meccaniche tra crescita cono e substrato20,21. Nano - e micro-fantasia substrati sono stati utilizzati come strumenti per diretta conseguenza del neurite e dimostrare la loro capacità di rispondere alle caratteristiche topografiche in loro microambienti. I neuroni sono stati indicati per sopravvivere, aderire, migrare e orientare i loro assoni per navigare caratteristiche superficiali come scanalature in substrati22,23. Tuttavia, questi studi sono in genere utilizzate linee cellulari coltivate ed è difficile prevedere come primario un neurone cellule volontà rispondere agli spunti ben definite e fisico in vivo o ex vivo.

Il modello ex vivo espianto del mouse DRG utilizzati per questa proposta imita l'interazione cellula-cellula reale e segnali biochimici che circonda gli assoni crescenti. Tra i tanti diversi paradigmi sperimentali che vanno dalla rigenerazione assonale, produzione neurosphere, a neuroinfiammazione, DRG explant modello continua a servire come un valido strumento per indagare l'aspetto virale infezione e latenza all'interno sensoriale gangli24,25,26,27.

Il sistema nervoso (SN) in generale è la destinazione per le infezioni virali28,29,30. Maggior parte dei virus infettano superfici delle cellule epiteliali ed endoteliali e si dirigono dal tessuto superficiale al NS via nervo periferico fibre sensoriali e motorie. In particolare, il virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) dopo un'infezione iniziale in cellule epiteliali stabilisce una latenza tutta la vita nei gangli sensoriali preferibilmente, il DRG del PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacità di infettare il PNS infine conduce a malattie neurologiche33.

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Protocollo

Tutte le procedure compreso l'uso degli animali sono state approvate dai protocolli di imbarcare-approvato di revisione istituzionale (IACUC-Midwestern University).

1. raccolta DRG da embrioni di topo

  1. I topi adulti dal metodo di asfissia (CO2) seguiti dalla decapitazione di eutanasia. Procedere immediatamente a rimuovere chirurgicamente la colonna vertebrale.
    1. Esporre la colonna vertebrale riducendo lo strato della pelle dorsalmente utilizzando forbici bene. Isolare la colonna vertebrale di taglio attraverso le costole su entrambi i lati della colonna e la colonna vertebrale di separazione dal resto dell'animale sacro.
    2. Montare la colonna vertebrale (lato ventrale verso l'alto) su una stuoia chirurgica utilizzando aghi/perni.
  2. Usando le forbici bene fare un doppio taglio su entrambi i lati dei corpi vertebrali per esporre il lato ventrale del canale vertebrale.
  3. Sotto un microscopio chirurgico (ingrandimento impostato su 4 X), usare le forbici per spostare delicatamente il midollo spinale dal lato per esporre le radici spinali dorsali controlaterale e individuare il DRG, lungo le radici dorsali dei nervi periferici. Ogni ganglio è parzialmente nascosta all'interno del forame di coniugazione intervertebrale.
  4. Per raccogliere il DRG, pizzicare la radice dorsale (tra il midollo spinale e il DRG) con un forcipe ed estrarre delicatamente il DRG dall'orifizio intervertebrale.
  5. Posizionare la pinza seconda sul nervo spinale periferici al DRG e tirare il DRG insieme al nervo spinale e la radice spinale.
  6. Posizionare il DRG raccolti in una capsula di Petri contenente 3 mL di siero ghiacciata supporti liberi (SFM)34da 35 mm.
  7. Trasferire ciascun DRG individuali in un bicchiere asciutto di Petri e, sotto un microscopio operatorio, pulire e tagliare le fibre in eccesso e del tessuto connettivo ancora attaccato al DRG utilizzando una lama. Il DRG è facilmente identificabile come una struttura trasparente bulgy lungo bianca/radice di nervo spinale. Vasi sanguigni si trovano spesso che circonda il DRG.
  8. Posizionare il DRG puliti in una nuova piastra Petri contenente ghiacciata SFM media.
  9. Stemperate il composto gelatinoso proteina (Vedi Tabella materiali) in SFM ghiacciata (1:1).
  10. Piatto il DRG ex vivo in 12 pozzetti prerivestiti con 10/20 µ l di miscela proteica gelatinoso e disporli all'interno dell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per 30-60 min.
  11. Delicatamente aggiungere 1,5-2 mL di SFM al sistema cultura per coprire l'intero espianto e mantenere gli espianti a coltura condizioni (37 ° C e 5% CO2).
    Nota: Questo è un passo fondamentale perché il DRG è ancorato per i piatti di vetro solo da miscela proteica gelatinoso polimerizzato. Tempo di polimerizzazione e di pipettaggio competenze sono fondamentali per evitare mobile.
  12. Cambiare il mezzo di crescita DRG ogni 72 ore e lasciare che il DRG crescere per finché necessario.

2. isolare la singola cella neuroni da DRG

  1. Luogo tutti i DRG raccolti in una provetta sterile da 1,5 mL con 1,2 mL di 1,25 mg/mL di collagenasi IV che contenevano F12 e incubare a 37 ° C e 5% CO2 per 45 min. Ripetere questo passaggio per un altro 45 min dopo la prima incubazione.
  2. Trattamento di espianti con 2 mL di tripsina (0.025%) per 30 min che contenevano F12 immediatamente dopo il trattamento di collagenasi IV a 37 ° C e 5% CO2.
  3. Incubare con 2 mL di F12 supporto contenente siero bovino fetale (FBS; 33%) a 37 ° C e 5% di CO2 per 15 min.
  4. Lavare espianti tre volte con 2 mL di F12 media e procedere meccanicamente dissociare li con una pipetta di vetro fino a quando i media diventa nuvoloso.
    Nota: Questa procedura comporta la raccolta di DRG pulire/tagliato dall'animale come spiegato nella sezione precedente. Quando si esegue la dissociazione meccanica degli espianti, sii gentile e non usare una forza eccessiva poiché può portare a perdite e perdita di materiale di lavoro.
  5. La coltura delle cellule dissociate filtrare su filtro da 0,22 µm per rimuovere eventuali impurità e l'eccesso di tessuto connettivo. Centrifugare il filtrato cella lysata a (2.500 x g) per 2 min.
  6. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di media neurobasal contenente supplemento per coltura neuronale (1x), miscela antibiotica (1x), L-glutammato (0,5 mM) e del nervo del fattore di crescita (5 µ g/mL) (Vedi Tabella materiali).
  7. Piastra le cellule dissociate sui vetrini di copertura rivestite con laminina (50 µ g/mL; Vedi Tabella materiali) ad una densità cellulare preferito. Determinare la densità delle cellule utilizzando un contatore di cellule.
    Nota: Abbiamo placcato cellule alle cellule 25.000/vetrino. Questa tecnica permette la dissociazione di sia i neuroni e cellule gliali satellitare. La componente glial co-coltivata con i neuroni pseudounipolar svolge un ruolo critico per la sopravvivenza neuronale.

3. HSV-1 infezione di espianti DRG e cellule dissociate DRG-derivate

Nota: Questo lavoro è stato svolto seguendo rigorosamente i requisiti di (BSL-2) livello 2 di biosicurezza che noi abbiamo un laboratorio attrezzato che è approvato dal comitato di biosicurezza Midwestern University. Un ceppo di KOS di HSV-1 è stato utilizzato in questo studio. Se lavora con ceppi di virus, si prega di prendere adeguate misure e precauzioni di sicurezza secondo le linee guida delle istituzioni locali.

  1. Determinare e preparare il virus nelle corrette diluizioni in media SFM per infettare il modello. Il virus usato in questo studio era di ceppo di KOS di HSV-1. Quando lavoro con DRG-derivato dissociato celle, utilizzare 1 unità di molteplicità di infezione (MOI) per l'infezione, che significa il numero di virus uguale il numero di celle.
  2. Se infettare DRG espianti, utilizzare il numero di virioni (ad es., 10.000 virioni) non è possibile stabilire un numero esatto delle cellule in un explant.
  3. Posizionare l'espianto/cellule per essere infettati con il virus in un tubo contenente una miscela di SFM media e virus o sterile cella piastra.
    Nota: Abbiamo usato 25.000 virioni per un vetrino contenente 25.000 cellule (1 MOI). Per infettare un explant, usiamo 10.000 virioni.
  4. Posizionare la piastra o il tubo a 37 ° C per l'infezione di prendere posto; tempo di esposizione virale può variare a seconda di infettività virale.
    Nota: Entrata virale è stata confermata usando ortho-nitrofenil-β-Galattoside (ONPG) e 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) saggi26.

4. immunofluorescenza

  1. Difficoltà gli espianti e singola cella campioni in formalina 4% preparato in tampone fosfato salino (PBS). Lavare i campioni per 10 min ciascuno per 3 volte in PBS.
  2. Incubare i campioni con anticorpi primari desiderati (anti-β-tubulina, anti-desmina, anticorpo di anti-eparan solfato (HS), e/o anti-glicoproteina D (gD); Vedi Tabella materiali per diluizioni), diluiti in tampone PBS con 0.3% Triton-X (PBST) e 10 % di siero di capra normale. Conservare i campioni a 4 ° C durante la notte.
  3. Lavare i campioni per 10 min ciascuna con PBS per 3 volte. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 1 h all'anticorpo secondario appropriato (488 e/o Cy3; Vedi Tabella materiali per diluizioni) diluito in PBS.
  4. Lavare i campioni per 10 min ciascuna con PBS per 3 volte. Incubare i campioni con colorante Hoechst (1,5 µM) in PBS per 20 min prima della fase di montaggio.
  5. Montare i campioni sulle lastre di vetro utilizzando un mezzo di montaggio di fluorescenza e il vetrino coprioggetti.

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Risultati

Molteplici aspetti dell'interazione neurone-ambiente e neuroplasticità possono essere studiati mediante DRG e un modello di cultura unicellulare dissociata. Abbiamo iniziato gli studi isolando un espianto DRG e cellule dissociate DRG-derivate, come schematicamente rappresentate nella Figura 1. Sia in tessuto che in modelli di cellule singole possono essere analizzati utilizzando una varietà di tecniche molecolari quali immunofluorescenza, Western blot, analisi genomiche e altre tecniche anal...

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Discussione

Il modello DRG ex vivo è estremamente utile per studiare una vasta gamma di eventi quali interazione neurone-glia così come l'effetto del microambiente su entrambi del metabolismo di un neurone e glial37. Ulteriormente, il DRG-modello potrebbe essere utilizzato come uno strumento conveniente per affrontare questioni rilevanti riguardanti il meccanismo patogeno e associati marcatori sviluppando ex vivo sistemi per fase acuta cronica e latente dell'infezione o in una determinata pa...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla di divulgazione.

Ringraziamenti

Ringraziamo sinceramente l'Imaging core-impianto a Midwestern University (MWU) e il gruppo di studenti [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo e Casey Sigerson] per i loro contributi nella coltura delle cellule e il funzionamento di imaging. Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla MWU intramurale concedere finanziamenti ai fondi di Start-up M.F. e ricerca per V.T.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Topi adulti NIH/SwissHarlan Laboratories
Piastra di Petri da 35 mmCell Treat229635
Matrigel ECMSigma-AldrichE1270di proteine gelatinose
F12 MediaGibco11765-054*Parte dei terreni SFM
Collagenasi IVSigma-AldrichC5138
TripsinaSigma-Aldrich25200-056
FBSSigma-AldrichF6178
Filtro da 0,22 umBD Falcon352350
Terreni neurobasaliGibco10888-022
Integratore B27Gibco17504-044Integratore per colture neuronali
PSN antibioticiGibco15640-055*Parte di SFM media
Miscela antibiotica
L-glutammatoSigma-AldrichG7513*Parte del terreno SFM
NGFAlomone LabsN-100Fattore di crescita nervoso
Vetrino coprioggetto rivestito di lamininaNeuvitroGG-14-Laminin
ONPG subtratoPierce34055
X-galInvitrogen15520034
Anticorpo anti-B-tubulinaSigma-AldrichT8328diluizione 1:2000
Anticorpo anti-periferinaMilliporeAB1530diluizione 1:1000 colorante
HoechstThermo Fisher622491,5 &; M concentrazione finale
Anti-eparan solfatoUS BiologicalH1890-100.180555556
Anticorpo anti gDVirostat196diluizione 1:10
BSA Sigma-AldrichA2153-100G*Parte del terreno SFM
BMEGibco21010-046*Parte del terreno SFM
GlucosioSigma-AldrichG7021-1KG*Parte del KIT del terreno SFM
(Insulina-transferrina-Selenio-A)Gibco51300-044*Parte del terreno SFM
Vitamina-CSigma-AldrichA4403*Parte del terreno SFM
PutrescineSigma-AldrichP7505*Parte del media SFM
488 (capra anti-topo)Life TechnologiesA11029
Cy3 (capra anti-coniglio)Jackson Immunoresearch laboratories111-165-003
Siero di capra normale VectorS-1000
Soluzione di formalinaSigma-AldrichHT5014-120ML
PBSGibco10010-031
Triton-XSigma-AldrichT9284-500ML
VectaShieldVectorH-1500Montatura a flurescenza
Vetrini in vetro bianco diamantatoGlobe Scientific1380-20
miscela

Riferimenti

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