Articolo metodologico

Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato

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DOI:

10.3791/56767

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11 aprile 2018

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1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Pathology Unit, Morgagni-Pierantoni Hospital, 3Unit of Surgery and Advanced Oncologic Therapies, Morgagni-Pierantoni Hospital

In questo articolo

Sommario

Il seguente protocollo si concentra sulla creazione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato (STS). Questo modello potrebbe aiutarci a comprendere meglio le priorità bassa molecolare e il profilo farmacologico di queste malignità rare e potrebbe rappresentare un punto di partenza per ulteriori ricerche finalizzate a migliorare la gestione di STS.

Abstract

Sarcomi dei tessuti molli (STS) rappresentano uno spettro di neoplasie eterogenei con un difficile diagnosi, classificazione e gestione. Ad oggi, sono state identificate più di 50 sottotipi istologici di questi rari tumori solidi. Così, grazie alla loro straordinaria diversità e bassa incidenza, la nostra comprensione della biologia di questi tumori è ancora limitato. Paziente-derivato culture rappresentano la piattaforma ideale per studiare la farmacologia e la patofisiologia di STS. Così abbiamo sviluppato un modello preclinico umano di m. a partire da esemplari del tumore raccolti da pazienti sottoposti a resezione chirurgica. Paziente-derivato di colture cellulari STS sono sono ottenuti da esemplari chirurgici di digestione della collagenosi e isolati mediante filtrazione. Cellule sono stati contati, seminate e lasciate per 14 giorni in colture monostrato standard e poi elaborate da analisi a valle. Prima di eseguire l'analisi molecolare o farmaceutici, l'istituzione di colture primarie di STS è stata confermata attraverso la valutazione delle caratteristiche citomorfologiche e, quando disponibili, gli indicatori immunohistochemical. Questo metodo rappresenta un utile strumento 1) per studiare la storia naturale di queste neoplasie scarsamente esplorate e 2) per testare gli effetti di diversi farmaci nel tentativo di saperne di più su loro meccanismi di azione.

Introduzione

Sarcomi dei tessuti molli (STS) includono una gamma di lesioni eterogenee della contabilità di origine mesenchimale per 1% di tutti i tumori solidi1,2, e la nuova classificazione dell'organizzazione mondiale della sanità riconosce la presenza di più di 50 diversi sottotipi3. Tra questi, gli istotipi più comuni sono del adipocyte sarcoma o liposarcoma e leiomiosarcoma, pari al 15% e 11% di tutte le m adulte, rispettivamente4,5. Anche se STS può svilupparsi in diverse parti del corpo, le estremità e il retroperitoneum sono i siti più comuni, che si verificano nel 60% e il 20% dei casi, rispettivamente6.

La pietra angolare della terapia per la malattia localizzata è la resezione chirurgica larga, considerando che i benefici della chemioterapia adiuvante e neoadiuvante sono ancora poco chiari e vengono considerati solo in casi selezionati7. In metastatica, la chemioterapia è lo standard di cura ma Mostra risultati limitati8. Una migliore comprensione della biologia molecolare di STS contribuirebbe a migliorare la diagnosi differenziale corrente, ottimizzare i trattamenti disponibili e identificare nuovi bersagli per la terapia.

In questo contesto, la ricerca sul cancro è stata eseguita per molti anni di utilizzo di linee cellulari immortalizzate9. Questi modelli sperimentali sono normalmente coltivati in monostrato standard supporta o impiantati nei roditori immunodeficienti per stabilire modelli in vivo dello xenotrapianto10. Linee cellulari immortalizzate rappresentano un materiale maneggevole e facile-a-store, con la quale un ampio numero di esperimenti di ricerca può essere eseguito. Sono, infatti, il meno costoso e più ampiamente usato strumento in studi preclinici11.

Tuttavia, modelli di base di cellula del cancro hanno anche alcune limitazioni, ad es. prolungata cultura in un sistema monostrato insieme a un numero crescente di passaggi induce fenotipica e deriva genetica, facendo le cellule meno probabile di ricapitolare chiave tumore caratteristiche. Inoltre, colture cellulari linea non riescono a riprodurre l'interazione cellula--cellula e la segnalazione area interattiva di molecola che imitano il comportamento biologico dei tumori e caratterizzano il microambiente tumorale. Questi problemi costituiscono la base del divario esistente tra risultati preclinici e clinici12.

Dato quanto sopra, l'interesse in colture primarie di paziente-derivato è aumentato13. Infatti, l'asportazione del tessuto maligno e normale riduce il rischio di perdere il fenotipo delle cellule di cancro ed eterogeneità, offrendo così il materiale di partenza che è più rappresentativo del microambiente tumorale. Inoltre, l'uso di campioni tumorali freschi raccolti da pazienti sottoposti a resezione chirurgica permette di indagare i singoli tumori e per confrontare diverse lesioni dalla stessa parte del corpo di un paziente14. Per i motivi suesposti, colture di cellule tessuto-derivate forniscono un materiale prezioso per studiare il tumore fisiopatologia e farmacologia15,16,17, soprattutto nella m. a quali linee di cellule di sarcoma commercialmente disponibili sono limitato18. Abbiamo così ottimizzato un metodo per stabilire una cultura cellula primaria STS paziente-derivati a partire da tumore chirurgicamente asportato tessuto13,19,20. Il nostro metodo consiste di disgregare l'esemplare del tumore in piccoli frammenti di tessuto seguiti da una notte dissociazione enzimatica del tessuto per ottenere una sospensione di singola cellula. Il giorno seguente, la digestione enzimatica viene arrestata con l'aggiunta di terreni di coltura fresco e la sospensione ottenuta viene filtrata per rimuovere frammenti di tessuto, aggregati cellulari e materiale in eccesso matrice o detriti. Infine, una frazione di cellule isolate del tumore è cytospinned su vetrini, fissato e memorizzati per analisi a valle puntato su confermando l'istituzione di colture primarie di STS da cytomorphological, immunohistochemical e valutazione citogenetica molecolare (ad es. analisi dei pesci di amplificazione MDM2 rappresenta la diagnosi differenziale standard per un liposarcoma bene-differenziato e il liposarcoma dedifferentiated) 4. le cellule restanti sono seminate in una cultura standard monostrato per studi farmacologici e profilatura di espressione genica. Tutti gli esperimenti sono effettuati utilizzando basso passaggio colture primarie per evitare la selezione di cancro specifico subcloni e analizzati da un patologo esperto sarcoma. Così abbiamo creato un pienamente umano m ex vivo modello13,19,20. Questo altamente versatile, facile da maniglia modello potrebbe rappresentare uno strumento utile per diversi tipi di ricerca preclinica, ad esempio per identificare nuovi marcatori molecolari per la diagnosi e la prognosi o per acquisire una più profonda comprensione dell'attività e meccanismi di azione di standard e nuovi farmaci utilizzati nella gestione delle m.

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Protocollo

Cellule di STS sono isolate da un tumore massa chirurgicamente asportato dai pazienti con STS. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico locale e viene eseguito secondo le linee guida di buona pratica clinica e la dichiarazione di Helsinki. Tutti i pazienti hanno dato consenso informato scritto a partecipare allo studio. Esemplari chirurgici sono analizzati da un patologo esperto sarcoma e trattati entro 3 ore dalla chirurgia.

1. tumore del prelievo e trattamento:

  1. Raccogliere campioni di tumore con l'aiuto di un patologo di sarcoma in un contenitore di urina sterile 100 mL con 50 mL di mezzo di glucosio basso DMEM sigillato con una pellicola di paraffina.
  2. Conservare i campioni a 4 ° C per un massimo di 3 h dopo resezione del tumore.
  3. Eseguire tutti i passaggi seguenti sotto una cappa di sterili per coltura.
    1. Sterilizzare il cofano con etanolo al 70% e indossare guanti sterili.
    2. Sterilizzare pinzette in acciaio inox con etanolo al 70% (utilizzare una garza sterile).
    3. Rimuovere la pellicola di paraffina dal contenitore di urina e scartare.
    4. Lavaggio esterno del contenitore dell'urina con etanolo al 70%.
    5. Aprire una capsula di Petri quadrato.
    6. Aprire il contenitore di urina e trasferire i campioni di tumore nella Piazza di Petri con le pinzette sterili in acciaio inox.
  4. Lavare due volte i campioni di tumore con PBS.
  5. Aprire un bisturi chirurgico sterile.
    1. Tagliuzzare finemente i campioni di tumore in 1-2 mm3 pezzi.
    2. Raccogliere un quarto del totale campione in una provetta 2 mL.
    3. Aggiungere 1 mL di reagente trizol (acquistato) al tubo e immediatamente congelato a-80 ° C (il campione verrà utilizzato nell'analisi a valle per la valutazione dell'espressione di gene STS).
  6. Raccogliere il resto del materiale finemente triturati tumore in una provetta da 15 mL.
    1. Aggiungere 4 mL di collagenasi di tipo I (tipo collagenosi viene disciolto in PBS, ad una concentrazione di 4 µ g/mL) di soluzione.
    2. Diluire la collagenasi tipo I soluzione con 4 mL di DMEM alta cultura media (concentrazione finale di collagenasi tipo io è di 2 µ g/mL).
    3. Chiudere il tubo 15 mL e sigillare con la pellicola di paraffina.
    4. Inserire il tubo 15 mL in uno shaker rotolamento in un incubatore a 37 ° C in condizioni di agitazione per 15 min attivare la digestione.
    5. Dopo 15 min conservare la provetta nello shaker rotolamento sotto agitazione Condizioni a temperatura ambiente durante la notte.
  7. Il giorno seguente metta il tubo 15 mL sotto il cappuccio sterile.
  8. Delicatamente e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro sterile 100 µm, fissato alla parte superiore di un tubo da 50 mL.
  9. Lavare il filtro con DMEM di alta coltura completato con 10% siero bovino fetale, la glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina.
  10. Gettare il filtro sterile di 100 µm, chiudere il tubo da 50 mL e centrifugare a 225 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  11. Scartare il surnatante capovolgendo la provetta.
  12. Risospendere le cellule con 1-2 mL DMEM alta cultura media completato con 10% siero bovino fetale, la glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina.
    Nota: Il volume dipende dalla quantità di campione del tumore trattato.
  13. Contare le celle con una camera di Neubauer.
    1. Diluire il campione 1:2 in blu di trypan e utilizzare 10 µ l della diluizione per contare le celle.
    2. Contare almeno due volte e calcolare la media dei replicati per conoscere il numero totale medio di cellule raccolte.
  14. Cellule di piastra in una cultura dello strato monomolecolare standard ad una densità di 80.000 cellule/cm2.
    Nota: Includere sempre controlli negli esperimenti. Eseguire almeno 3 replicati tecnici per ogni condizione. Eseguire almeno 2 repliche biologiche. Per farmacologia preclinica, espressione genica e analisi dell'espressione proteica, esperimenti dovrebbero essere effettuati con un basso numero di passaggi di cultura entro 30-45 giorni di cella semina per evitare di perdere cancro fenotipi cellulari.
  15. Preparazione del campione citologico.
    1. Raccogliere 100.000 cellule in 200 µ l di alta coltura DMEM completato con 10% siero bovino fetale, la glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina.
    2. Pipetta la soluzione (pipetta 200 µ l) in un imbuto monouso dotato di filtro e montato con una lastra di vetro.
    3. Aprire la citocentrifuga e inserire i campioni.
    4. Eseguire la citocentrifuga a 18,6 x g per 20 min.
    5. Scartare l'imbuto equipaggiato con il filtro.
    6. Difficoltà le diapositive in acetone per 10 min seguita da cloroformio per 5 min.
    7. Archiviare le diapositive a-20 ° C.
      Nota: Scongelare e idratare i campioni prima della colorazione ed eseguire la colorazione seguendo le istruzioni del produttore. Preparare almeno 3 replicati tecnici.

2. colture di cellule di m.:

  1. Modifica supporto una volta a settimana (DMEM alta cultura media completato con 10% siero bovino fetale, glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina).
    1. Scartare il terreno di coltura utilizzando una pipetta di 200-1.000 µ l.
    2. Aggiungere nuovo mezzo fresco utilizzando una pipetta di 200-1.000 µ l.
    3. Passaggio delle cellule:
      1. Staccare le cellule quando la confluenza è circa 90%:
        Nota: STS cella cultura amplificazione dovrebbe essere effettuata una volta a settimana sulla base delle condizioni di coltura.
      2. Eliminare terreno, lavate con PBS e aggiungere 2-3 mL di tripsina 1 x in PBS
        Nota: Il volume della tripsina utilizzato dipende dalla quantità di cellule coltivate ottenute.
      3. Incubare le cellule per 3-5 min a 37 ° C.
      4. Raccogliere le cellule distaccate dalla piastra usando una pipetta di 200-1.000 µ l.
      5. Le cellule indipendente di pipettare in una provetta da 15 mL e aggiungere 4 mL di alta coltura DMEM completato con 10% siero bovino fetale, la glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina per fermare la reazione enzimatica.
      6. Centrifugare a 225 x g per 5 min a temperatura ambiente.
      7. Scartare il surnatante.
      8. Risospendere il pellet cellulare aggiungendo 1 mL di alta coltura DMEM completato con 10% siero bovino fetale, la glutamina 1% e 1% di penicillina/streptomicina.
      9. Le celle in una nuova piastra di coltura o una boccetta con un volume finale secondo le istruzioni del produttore del seme.
        Nota: Non dividere celle più di 1:3.

3. a valle analisi:

Nota: Una varietà di esperimenti differenti può essere effettuata utilizzando questo modello (Vedi sotto). È, pertanto, fondamentale per decidere in fase di progettazione dello studio che analizza deve essere eseguita in modo che un numero sufficiente di campioni e replicati possa essere preparato.

  1. Analisi di proliferazione come il bromuro di 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium di MTT
  2. Analisi apoptotiche quali transferasi terminale di deoxynucleotidyl (TdT) nick end labeling analisi (TUNEL)
  3. Analisi di Immunohistochemical
  4. Analisi dell'espressione genica
  5. Analisi Western blot
  6. Analisi di ELISA
  7. Fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS)
  8. In vivo modello dello xenotrapianto

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Risultati

Abbiamo progettato un metodo semplice per ottenere l'istituzione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato e riferire qui un esempio di risultati ottenuti su uno specifico STS histotype13. Il protocollo è stato utilizzato per la creazione di colture primarie di diversi istotipi m compreso il liposarcoma ben differenziato, dedifferenziate liposarcoma, liposarcoma myxoid, liposarcoma pleomorphic, mixofibrosarcoma, indifferenziato fibromat...

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Discussione

Ben definiti modelli preclinici sono necessari delucidare la priorità bassa molecolare dei tumori, predire la prognosi e sviluppare nuove strategie terapeutiche per i pazienti oncologici. Ciò è particolarmente importante per i tumori rari ad esempio STS cui alta eterogeneità in termini di morfologia, comportamento aggressivo di potenziale e clinico sfida la nostra comprensione della biologia di STS e gestione del paziente21. Inoltre, le poche righe di cellule di sarcoma commerciale disponibile lim...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrei ringraziare Gráinne Tierney per assistenza editoriale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM Alto glucosioEuroCloneECB7501L
Siero fetale bovinoEuroCloneECS0180D
GlutamminaGibco25030-024
Paraformaldeide 4% soluzione acquosa,Microscopia elettronicaScienze 157-4-100
Penicillina streptomicinaGibco15140122
Reagente TriazolAmbion Life-Technologies15596018
TripsinaEuroCloneECB3052D
di grado EM

Riferimenti

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
  3. Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
  4. De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
  5. Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
  6. Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294(2011).
  7. Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
  8. The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
  9. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  10. Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
  11. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
  12. Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
  13. De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662(2016).
  14. Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
  15. Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
  16. Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
  17. Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313(2008).
  18. Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
  19. Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309(2017).
  20. De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
  21. Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
  22. Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
  23. Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
  24. Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
  25. Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
  26. Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
  27. Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
  28. Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313(2008).

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