Un metodo migliore per la raccolta di liquido cerebrospinale da topi anestetizzati

Sommario

Questo protocollo descrive una tecnica migliore per la raccolta abbondante di liquido cerebrospinale (CSF) senza contaminazione da sangue. Con una maggiore raccolta di campioni e purezza, altre analisi possono essere eseguite utilizzando CSF per avanzare la nostra comprensione delle malattie che colpiscono il cervello e il midollo spinale.

Abstract

Il liquido cerebrospinale (CSF) è un prezioso fluido corpo per analisi in ricerca in neuroscienza. È uno dei fluidi in più stretto contatto con il sistema nervoso centrale così, può essere utilizzato per analizzare lo stato di malato del cervello o del midollo spinale senza accedere direttamente a questi tessuti. Tuttavia, nei topi che è difficile da ottenere dalla cisterna magna grazie alla sua vicinanza ai vasi sanguigni, che spesso contaminare i campioni. La zona per accumulazione di CSF in topi è anche difficile da sezionare per e spesso solo piccoli campioni sono ottenuti (massimo di 5-7 µ l o meno). Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica che migliora sugli attuali metodi di raccolta per minimizzare la contaminazione da sangue e consentire la raccolta abbondante di CSF (in media che 10-15 µ l possono essere raccolti). Questa tecnica può essere utilizzata con altri metodi di dissezione per raccolta di tessuto dai topi, come non impatto eventuali tessuti durante l'estrazione di CSF. Così, il cervello e il midollo spinale non sono interessati con questa tecnica e rimangono intatti. Con una maggiore raccolta di campioni di CSF e purezza, ulteriori analisi possono essere utilizzati con questa ricerca in neuroscienza fluido ad ulteriori aiuti e comprendere meglio le malattie che colpiscono il cervello e il midollo spinale.

Introduzione

Il CSF è un prezioso fluido corpo per analisi in ricerca in neuroscienza. Il CSF è principalmente fatta da plasma sanguigno, contenente alcune cellule (non di globuli rossi e pochi globuli bianchi) ed è quasi privo di proteine. È uno dei fluidi a stretto contatto con il sistema nervoso centrale (SNC) e può passare molti elettroliti dal cervello e il midollo spinale al sistema periferico. In esseri umani, i campioni di CSF possono essere raccolti per aiutare nella diagnosi di malattia o per scopi di ricerca negli studi clinici, come una puntura lombare (o puntura lombare) è una procedura invasiva, minore: il fluido di CSF può riflettere le modifiche nel SNC senza dover accedere direttamente a queste tessuti. Così, negli ultimi anni, per scopi di ricerca in clinica, i campioni di CSF sono stati ottenuti da pazienti di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e altre demenze^1,2,3. Ci sono molti saggi di biomarcatore che sono stati sviluppati utilizzando campioni di liquor per potenzialmente diagnosticare malattie in clinica^2,3. Tuttavia, c'è molto dibattito sull'affidabilità di questi test per produrre risultati coerenti e sensibili per specificamente diagnosticare malattia^4,5. Così, c'è un grande bisogno per lo sviluppo migliore nei test di obiettivi, che possono essere trovati nel CSF, per aiutare nella produzione di una tecnica standard per diagnosticare malattie neurodegenerative con maggiore sensibilità e specificità. A causa dell'importanza potenziale di campioni di CSF umano nella malattia, la collezione di CSF dai roditori in ricerca in neuroscienza è anche di interesse.

I topi sono animali importanti nella ricerca biologica e medica e consentono per la prova dei composti terapeutici potenziali e studi di prova prima di test clinici umani. Tuttavia, nei topi è difficile ottenere campioni di CSF grazie alla sua vicinanza al cervello in un piccolo animale, come il metodo usuale di accumulazione di CSF in topi è ottenerlo via della cisterna, un'apertura tra il cervelletto e superficie dorsale del oblongata del midollo. Questo provoca difficoltà nella raccolta dei campioni di CSF come questa zona è difficile da sezionare per e in prossimità di vasi sanguigni, aumentando il rischio di contaminazione da parte di cellule del sangue. A causa di queste difficoltà, la maggior parte dei ricercatori possono ottenere solo una piccola quantità di CSF per analisi (solitamente indicato come µ l 5-7) e la contaminazione dei campioni di CSF dalle cellule del sangue è una preoccupazione primaria per analisi^{6,7,8 , 9}. contaminazione sanguigna può oscurare i risultati e non veramente riflettere lo stato del SNC. Inoltre, limitato campione raccolto può influire la ricerca come la solita quantità raccolte da topi è sufficiente per la sola misura (in doppio o triplice copia) utilizzando analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA). Così, campioni di liquor sono solitamente in pool da topi multipli al fine di avere abbastanza campione per eseguire saggi multipli. Sviluppo di un protocollo per l'abbondante, collezione incontaminato di CSF dai topi è fortemente desiderato e sarà utile nel miglioramento della ricerca neuroscientifica utilizzando roditori.

In questo protocollo, una tecnica per l'abbondante (una media di 10-15 µ l) insieme di CSF da topi anestetizzati è descritta dettagliatamente e migliora il metodo attualmente conosciuto di accumulazione di CSF per minimizzare la contaminazione da sangue¹⁰. Un protocollo robusto per accumulazione di CSF sarà di aiuto nello sviluppo di analisi di biomarker basati su CSF, che potrebbero essere utilizzati per diagnosticare la malattia, come pure di migliorare la ricerca dei meccanismi che sono alla base di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le politiche della società per le neuroscienze (USA) e comitati etici Fudan University (Shanghai, Cina). Questa procedura è per un intervento chirurgico non-sopravvivenza.

1. installazione dell'apparecchiatura di raccolta di CSF

1. Tirare il vetro capillare (diametro interno 0,75 mm, diametro esterno mm 1,0) usando un estrattore micropipetta (come mostrato in Liu et al. ¹⁰; affilata capillare è illustrato nella Figura 1).
2. Posto un capillare nel supporto capillare in vetro affilato saldamente montato su un micromanipolatore (Figura 1A).
3. Rompere la punta del capillare affilata con il forcipe dritto sotto un microscopio per dissezione, in modo che il diametro interno della punta rotta è di circa 10-20 µm (Figura 1).
4. Collegare un tubo sottile e una siringa a altra estremità del capillare titolare e collegare il tubo sottile e la siringa con una valvola a tre vie.
5. Spostare la valvola a tre vie per aprire e immergere la siringa per soffiare aria dalla siringa attraverso del tubo di vetro capillare per espellere eventuali contaminanti e creare pressione positiva nel tubo capillare.
6. Ripetere un paio di volte da dis-collegamento e ricollegare la siringa alla valvola tre vie e redigere la siringa ~ 100-200 µ l prima l'ultima ri-connessione della siringa con la valvola a tre vie (Figura 1B).
7. Spostare il micromanipolatore con il vaso capillare di vetro al lato per evitare danni durante la dissezione del mouse.

Figura 1. Microscopio, micromanipolatore e capillare setup. (A) microscopio e micromanipolatore con capillare associata installazione, così come un'immagine più da vicino di (B) la siringa collegata e la valvola a tre vie per aprire (mostrato qui) o chiudere la tubazione e (C), un'ininterrotta (destra) e rotto (a sinistra) Punta capillare pronto per accumulazione di CSF. Una volta rotto, la punta del capillare deve avere un diametro interno di 0,75 mm, diametro esterno di 1,0 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. dissezione di Mouse

1. Anestetizzare il mouse.
   Nota: per questo protocollo, C57BL/6 e amiloide precursore della proteina/presenilina 1 (APP/PS1) transgenici (modello murino di malattia di Alzheimer) topi sono stati utilizzati e anestetizzati con 4% cloralio idrato (in dH₂0) a 10 µ l/g di peso del mouse via intraperitoneale iniezione.
2. Quando completamente anestetizzato, assicurarsi che il mouse è adeguatamente anestetizzato. La risposta di ritiro alla punta pizzico, leggermente estendendo gli arti posteriori e pizzicare le dita dei piedi e guardando per una risposta di ritiro, viene eseguita per assicurare un'anestesia adeguata. Verifica di pizzicare tutte e quattro le membra; Se non c'è nessuna reazione il mouse correttamente è anestetizzato. Tagliare e tagliare i capelli sul retro della testa del mouse da sopra gli occhi, tra le orecchie alla parte inferiore del collo con le forbici per dissezione (Figura 2A). In alternativa, i clippers o crema depilatoria può essere utilizzata per aiutare nella rimozione dei capelli.
3. Fissare la testa del mouse utilizzando un adattatore mouse (dietro la testa rivolta verso l'alto con il naso puntato verso il basso a ~ 45 °, Figura 2A). Difficoltà bar orecchio tra le orecchie e gli occhi del mouse e stringere. Assicurarsi che la testa non può muoversi ed è fissata saldamente l'adattatore spingendo delicatamente verso il basso sulla testa del mouse.
4. Ricontrollare la risposta di ritiro per punta pizzico prima di effettuare l'incisione chirurgica e regolarmente da allora in poi per assicurare aereo chirurgica di anestesia. Visivamente notare qualsiasi cambiamento nella frequenza respiratoria durante la procedura per indicare cambiamenti nei piani di anestesia. Una tecnica pulita, non asettici, può essere utilizzata per questo breve intervento non-sopravvivenza. Con delle forbici, pinzetta, tagliare attraverso la pelle e il primo strato del muscolo finché la base del cranio è esposto con solo un sottile strato di muscolo.
   Nota: Tagliare attraverso la pelle del mouse attraverso la parte posteriore del collo e quindi tagliare la pelle giù la metà del cranio tra le orecchie e gli occhi del mouse. Pelle e tessuto può essere tirati quindi apart e fuori dalla zona sopra la cisterna magna.
5. Mentre la visione attraverso il microscopio per dissezione, accuratamente sezionare distanza l'ultimo sottili strati del muscolo sopra la base del cranio usando il forcipe e spostare questi strati del muscolo al lato e fuori dell'area di interesse. Se c'è sanguinamento, utilizzare bastoncini di cotone per rimuovere e aiutare a fermare l'emorragia.
6. Una volta che il dura sopra la cisterna magna è esposto (forma triangolare con solitamente 1-2 grandi vasi sanguigni che attraversa la zona; entrambi i lati della o tra i vasi sanguigni sono ottimali per inserimento capillare e accumulazione di CSF, Figura 2B), utilizzare un bagnato Cotton fioc per pulire la membrana e quindi utilizzare un batuffolo di cotone asciutto per asciugare la zona.

Figura 2. Configurazione del mouse e dissezione con immagini rappresentative di inserimento capillare per accumulazione di CSF. Installazione del mouse pronto per l'estrazione di CSF con (A) rasato la testa bloccata nel posto per dissezione e (B) una dettagliata immagine (10 x view) di un mouse dissecata dura che copre la cisterna magna (freccia tratteggiata indica un vaso sanguigno che attraversa la zona e solida freccia Mostra la zona ottimale per inserimento capillare). Immagini dettagliate (vista x 10) (C) affilata punta del capillare di vetro allineato contro dura della cisterna magna, (D), il punto in cui il capillare punture quasi dura, con una certa resistenza da dura e (E), la punta capillare con attacco filettato con il dura per raccogliere CSF. CSF dovrebbe essere un liquido limpido, raccolto nel vetro capillare (freccia tratteggiata). Tutte le barre della scala nella parte inferiore destra di ogni immagine al microscopio indicano 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. CSF collezione da Mouse anestetizzato

1. Allineare il capillare di vetro alla parte posteriore della testa del mouse in modo che il punto affilato è proprio dietro la membrana a un ~ angolo di 30-45 ° (Figura 2).
2. Immergere la siringa una volta o poche volte e redige la siringa ~ 100-200 µ l (per assicurarsi che non ci sono nessun contaminanti e non c'è pressione negativa nel vetro capillare).
3. Utilizzando il micromanipolatore, spostare il capillare punta più vicino alla membrana fino a resistenza può essere visto, ma non puntura (Figura 2D).
4. Una volta che la resistenza è visto tra la punta del capillare e la membrana, picchiettare delicatamente il tubo capillare attraverso la membrana battendo sui controlli micromanipolatore. Usare il microscopio per vedere il punto affilato della puntura capillare della cisterna. CSF automaticamente deve essere disegnato nel tubo capillare, una volta che l'apertura sia stato punto (Figura 2E).
5. Lasciare il capillare per raccogliere lentamente CSF. Se il CSF ha smesso di disegno, disegnare lentamente la siringa una piccola quantità (~ 50 µ l) per creare la pressione negativa nel capillare per estrarre fuori il CSF.
   Nota: In alternativa, il capillare può essere delicatamente e lentamente tirato fuori del cervello utilizzando i controlli bene micromanipolatore per consentire CSF di fluire nuovamente nel capillare. Un importo totale di ~ 10-15 µ l di CSF (~ 3-4 cm nel capillare) prende ~ 10-30min e occasionalmente 20 µ l o più possono essere raccolti. Anche se non assolutamente necessario, si consiglia di utilizzare un pad termico durante l'accumulazione di CSF. Accumulazione di CSF è stata eseguita a temperatura ambiente (~ 23 ° C).
6. Una volta raccolti la quantità di CSF desiderata, chiudere il tubo spostando la valvola a tre vie per chiudere (per interrompere il disegno fuori il CSF).
7. Estrarre la siringa collegata ai tubi e aprire e chiudere la tubazione (per creare pressione equalizzato in capillare, tubature e l'area esterna del capillare). Ricollegare la siringa con la valvola a tre vie, ma non immergere la siringa.
8. Rimuovere delicatamente il capillare di vetro dal mouse utilizzando il micromanipolatore.
9. Posizionare il tubo di raccolta (microprovette da 1,5 mL con 1 µ l di 20x inibitore della proteasi) sotto il punto di affilata del vetro capillare.
10. Aprire il tubo e immergere delicatamente la siringa: il CSF dovrebbe fluire fuori del vaso capillare e nel tubo di raccolta.
11. Dopo la raccolta, rapidamente centrifugare (impulsi spin per 5 s alla velocità massima utilizzando una mini centrifuga) CSF per mescolare il campione con l'inibitore della proteasi nella parte inferiore del tubo di raccolta.
    Nota: I campioni di CSF possono essere aliquotati e poi conservati per un'ulteriore analisi a-80 ° C. Il resto del mouse può essere sezionato per altri tessuti, quali il cervello e il midollo spinale. Il mouse è ancora vivo in questa fase e così il sangue anche può essere raccolto, se necessario.

Risultati

Utilizzando la procedura descritta qui (Figura 1 e Figura 2), il CSF immediatamente raccolti nel capillare dovrebbe essere chiaro (Figura 2E), non rosa o rosso. Se c'è una rosa a tinta rossa al fluido raccolto nel capillare, poi c'era contaminazione con il sangue.

Come un esempio di applicazione del campione di CSF raccolti con questo metod...

Discussione

Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica che migliora il corrente metodi¹⁰ di accumulazione di CSF per minimizzare la contaminazione da sangue e consentire la raccolta abbondante di CSF (in media ~ 10-15 µ l può essere ottenuta) dai topi. Rompendosi la punta capillare, la punta del capillare non deve essere troppo piccola (è come allora verranno estratti molto lentamente il CSF) o troppo grande (non sarà abbastanza per raccogliere il CSF bello e tessuto può rimanere incastrato nel capil...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Idrato di cloralio (usato come anestetico)	Sinopharm Chemicals Reagen Co., Ltd.	30037517	numero CAS 302-17-0.
Forbici da dissezione	66 tecnologia di visione	54002
Pinze curve da dissezione	66 tecnologia di visione	53072
Pinze diritte da dissezione	66 tecnologia di visione	53070
Adattatore per mouse (con barre auricolari)	Realizzato internamente.	N/A	Attrezzature simili disponibili presso World Precision Instruments.
Microscopio da dissezione	Meiji Labax	Modello 15381
Micromanipolatore	World Precision Instruments	M3301
Base magnetica per micromanipolatore	Kanetec	MB-K
Capillari in vetro	World Precision Instruments	1B100-4
Estrattore per micropipette	Sutter Instruments	Modello P-1000
Siringhe (1ml)	Tansoole	02024692	Per 1ml.
Microprovette (1,5 ml)	Axygen	MCT-150-C
Inibitore della proteasi Cocktail Set III Senza EDTA	Calbiochem	539134
A & beta; 42 Kit ELISA	Invitrogen	KHB3441
Piping (tubo in teflon)	World Precision Instruments	MMP-KIT	Ottenuto da un kit di microiniezione e fissato al supporto del capillare e alla siringa.
Mini centrifuga	Tiangen Biotech	OSE-MC8
Cotton fioc	Ottenuto da qualsiasi negozio di casalinghi/farmacia.	N/A