In questo protocollo, descriviamo una tecnica per scoprire Zika il peptidi diagnostico specifici di virus ha usando un microarray ad alta densità del peptide. Questo protocollo può essere idoneamente adattato per altre malattie infettive emergenti.
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Articolo metodologico
Virus di Zika specifico diagnostico dell'epitopo Discovery
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microarrays ad alta densità del peptide consentire lo screening dei peptidi più di seimila in una diapositiva di microscopia singola standard. Questo metodo può essere applicato per la scoperta di farmaci, identificazione del target terapeutico e lo sviluppo della diagnostica. Qui, presentiamo un protocollo per scoprire peptidi diagnostici specifici di virus (ZIKV) Zika usando un microarray ad alta densità del peptide. Un campione di siero umano convalidato per infezione ZIKV è stato incubato con un microarray ad alta densità del peptide contenente l'intera proteina ZIKV tradotta in 3.423 unico 15 lineare dell'aminoacido (aa) residui con una sovrapposizione di 14-aa residuo stampato in duplice copia. Colorazione con anticorpi secondari diversi all'interno della matrice stessa, abbiamo rilevato peptidi che legano alla immunoglobulina M (IgM) e gli anticorpi dell'immunoglobulina G (IgG) sono presenti nel siero. Questi peptidi sono stati selezionati per ulteriori esperimenti di convalida. In questo protocollo, descriviamo la strategia seguita per progettare, elaborare e analizzare un microarray ad alta densità del peptide.
Introduzione
Zika diagnosi del virus (ZIKV) basata sui sintomi clinici è impegnativo, perché condivide con Dengue e Chikungunya virus infezione1vettori, distribuzione geografica e sintomi. Dato il rischio di esiti avversi della gravidanza in donne infettate con ZIKV durante la gravidanza, è importante distinguere tra i 3 virus. Anche se l'attuale test diagnostici molecolari sono specifici, sono solo utili nel sangue o saliva durante il periodo relativamente breve di infezione acuta2,3. I test sierologici sono essenziali per la diagnosi fuori di questo periodo iniziale di infezione4....
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Protocollo
Questi dati sono una parte di uno studio di ricerca condotto presso la New York University College of Dentistry e sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale della New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Campioni clinici utilizzati in questo studio sono stati de-identificati campioni precedentemente utilizzati per la diagnosi e con permesso da Wadsworth Center di New York State Department di salute, Albany, NY.
1. installazione di ZIKV ad alta densità Peptide Microarray fare scorrere in un determinato cassetto incubazione
- Gestire il vetrino per i bordi con guanti senza polvere. Le dimensioni di di....
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Risultati
I risultati ottenuti mediante il protocollo descritto sono mostrati nella Figura 2 e nella figura 3. Nessuna interazione di sfondo sono stata notata quando pre-macchiando il microarray con secondario anti-human IgM (dati non mostrati). Colorazione con un'anti-IgM umane coniugato ha provocato parecchie zone sopra intensità di fluorescenza verde di sfondo, che indica l'associazione di questi peptidi con IgM nel ca.......
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Discussione
Abbiamo progettato un protocollo che utilizza un microarray ad alta densità del peptide contenente l'intera sequenza di proteina di Zika virus (ceppo polinesiano francese). Il microarray è stato fabbricato da peptidi lineari sovrapposti differenti 3.423 stampa. Ogni peptide era 15 aminoacidi e varia da un solo residuo dal suo vicino più prossimo nella sequenza (cioè, sovrapposizione di 14 residui). Anche se più breve sovrapposizioni possono essere stampati, mapping di epitopo è più preciso con più sovrapposizion.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Il supporto corrente è fornito da una sovvenzione di supplemento amministrativo SBIR (Small Business Innovation Research) da NIDCRR44 DE024456. Concessione di NIDCR HIV che l'evoluzione di NIDCR concedere U01 DE017855 per lo sviluppo di una conferma diagnostica point-of-care per l'HIV. Noi riconosciamo con gratitudine Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) per la sua assistenza tecnica e supporto. Ringraziamo anche NYU Langone Medical Center per la LI-COR Odyssey Imaging System.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: il nostro microarray contiene l'intera sequenza proteica del virus Zika |
| PEPperCHIP vassoio di incubazione 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, marcatura DyLight) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14 giorni di licenza gratuita per Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-umano IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-umano IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Dispositivo agitatore orbitale | IKA | MTS 2/4 agitatore digitale per microtitolazione | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
Riferimenti
- Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al.
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Ristampe e permessi
