Abbiamo generato con successo due saggi di substrato specifico γ-secretasi. Entrambi analisi cell-based qui presentate sono progettate per quantificare le attività enzimatiche γ-secretasi tramite l'uscita dei reporter luciferasi firefly.
Articolo metodologico
* These authors contributed equally
Abbiamo generato con successo due saggi di substrato specifico γ-secretasi. Entrambi analisi cell-based qui presentate sono progettate per quantificare le attività enzimatiche γ-secretasi tramite l'uscita dei reporter luciferasi firefly.
Abbiamo sviluppato un paio di saggi gene reporter basati su celle a misurare quantitativamente γ-secretasico di distinti substrati. Questo manoscritto descrive le procedure che possono essere utilizzate per monitorare γ-secretasi-mediata di clivaggio di APP-C99 o tacca, utilizzando un sistema di Gal4 promotore-driven firefly luciferase reporter. Queste analisi sono state stabilite da stabile co-trasfezione cellule HEK293 con il gene del reporter di luciferase Gal4-driven e frammento C-terminale Gal4/VP16-etichetta dell'APP (APP-C99; Cellule CG), o il Gal4/VP16-etichetta tacca-ΔE (NΔE; Cellule di NG). Usando questi saggi reporter in parallelo, abbiamo dimostrato che un inibitore di ErbB2, CL-387.785, preferenzialmente può sopprimere γ-secretasico di APP-C99 in cellule di CG, ma non NΔE in cellule di NG. Le risposte differenziali hanno esibite dalle cellule del CG e NG, quando trattati con CL-387.785, rappresentano una caratteristica preferita per modulatori di γ-secretasi, e queste risposte sono in netto contrasto con la pan-inibizione di γ-secretasi indotta da DAPT. I nostri studi forniscono la prova diretta che attività di γ-secretasi verso substrati differenti possono essere differenziati in un contesto cellulare. Questi nuovi test può quindi essere strumenti utili nella scoperta della droga per terapie AD migliori.
Forme oligomeriche di amiloide-β (Aβ) sono credute per essere la causa primaria della neurodegenerazione nel cervello dei pazienti affetti da morbo di Alzheimer (annuncio)1. Peptidi Aβ sono prodotte tramite la fenditura graduale della proteina precursore dell'amiloide (APP), in primo luogo da β-secretasi e poi da γ-secretasi2. Nell'ultimo decennio, si sono concentrati sulla prevenzione della produzione di Aβ3approcci terapeutici verso trattamento dell'annuncio. La maggior parte degli studi si è concentrati su entrambi l'aumento dell'attività α-secretasi, che può precludere γ-secretasico dell'APP e....
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1. misura di segnali di Reporter luciferasi, che corrispondono a γ-secretasico di APP-C99 o NΔE
Nota: Consultare le pubblicazioni precedenti per le descrizioni dettagliate della generazione di CG e NG cellule20,21.
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Inibizione di ErbB2 da CL-387.785 differenzialmente può promuovere l'elaborazione di APP-C99 di Γ -secretasi senza intaccare il clivaggio di Notch
Per stabilire un'analisi basata sulle celle che possono misurare quantitativamente il clivaggio proteolitico di un substrato particolare γ-secretasi, abbiamo generato la linea cellulare derivata da HEK293 CG di co-trasfezione stabile di una tetraciclina-inducible C-terminale Gal4/VP16-etiche.......
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I promettenti risultati da uno studio di fase 1b di immunoterapia aducanumab per annuncio hanno stabilito saldamente il ruolo critico di Aβ nella patogenesi dell'AD22 e suggeriscono che gli approcci anti-Aβ sono ancora una valida strategia per lo sviluppo di farmaci anti-annuncio. Qui, descriviamo analisi cell-based per quantificare γ-secretasi-catalizzata di proteolisi di APP-C99 e NΔE utilizzando sistemi di firefly luciferase reporter. APP-C99 e NΔE sono i due substrati di γ-secretasi più ben st.......
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Gli autori ringraziano la struttura di nucleo del Istituto del cellulare e biologia organismica, Academia Sinica, per il supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dal Ministero della scienza e tecnologia, Taiwan (più 103-2320-B-001-016-MY3 Y.-f. L.), il programma per l'innovazione traslazionale di sviluppo biofarmaceutico – tecnologia che supporta la piattaforma asse regime (NP7 a Y.-F.L.) e Academia Sinica (a Y.-F.L.).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lettore di piastre a luminescenza VictorLight | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Classe II, Tipo 2 Cabina di sicurezza biologica | Thermo Scientific | 1300 Serie A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | componente principale del terreno di crescita |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | Aldrich | |
| a 96 pozzetti | Nunc | 156545 | |
| Tetraciclina | Sigma | T7660 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Reagente per il dosaggio della luciferasi Steady-Glo | Promega | E2510 | |
| Incubatore umidificato CO2 | Revco | Ultima II | |
| Linea cellulare T-REx293 | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 versione software 3.0 | PerkinElmer | del lettore di micropiastre a luminescenza |
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