Articolo metodologico

Misurazione quantitativa della proteina precursore dell'amiloide γ-secretasi-mediata e la fenditura di Notch in Cell-based Luciferase Reporter Assay piattaforme

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DOI:

10.3791/56795

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25 gennaio 2018

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1Laboratory of Molecular Neurobiology, Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Abbiamo generato con successo due saggi di substrato specifico γ-secretasi. Entrambi analisi cell-based qui presentate sono progettate per quantificare le attività enzimatiche γ-secretasi tramite l'uscita dei reporter luciferasi firefly.

Abstract

Abbiamo sviluppato un paio di saggi gene reporter basati su celle a misurare quantitativamente γ-secretasico di distinti substrati. Questo manoscritto descrive le procedure che possono essere utilizzate per monitorare γ-secretasi-mediata di clivaggio di APP-C99 o tacca, utilizzando un sistema di Gal4 promotore-driven firefly luciferase reporter. Queste analisi sono state stabilite da stabile co-trasfezione cellule HEK293 con il gene del reporter di luciferase Gal4-driven e frammento C-terminale Gal4/VP16-etichetta dell'APP (APP-C99; Cellule CG), o il Gal4/VP16-etichetta tacca-ΔE (NΔE; Cellule di NG). Usando questi saggi reporter in parallelo, abbiamo dimostrato che un inibitore di ErbB2, CL-387.785, preferenzialmente può sopprimere γ-secretasico di APP-C99 in cellule di CG, ma non NΔE in cellule di NG. Le risposte differenziali hanno esibite dalle cellule del CG e NG, quando trattati con CL-387.785, rappresentano una caratteristica preferita per modulatori di γ-secretasi, e queste risposte sono in netto contrasto con la pan-inibizione di γ-secretasi indotta da DAPT. I nostri studi forniscono la prova diretta che attività di γ-secretasi verso substrati differenti possono essere differenziati in un contesto cellulare. Questi nuovi test può quindi essere strumenti utili nella scoperta della droga per terapie AD migliori.

Introduzione

Forme oligomeriche di amiloide-β (Aβ) sono credute per essere la causa primaria della neurodegenerazione nel cervello dei pazienti affetti da morbo di Alzheimer (annuncio)1. Peptidi Aβ sono prodotte tramite la fenditura graduale della proteina precursore dell'amiloide (APP), in primo luogo da β-secretasi e poi da γ-secretasi2. Nell'ultimo decennio, si sono concentrati sulla prevenzione della produzione di Aβ3approcci terapeutici verso trattamento dell'annuncio. La maggior parte degli studi si è concentrati su entrambi l'aumento dell'attività α-secretasi, che può precludere γ-secretasico dell'APP e quindi diminuire la produzione di Aβ, o l'inibizione di β-e/o γ-secretasi attività4. Purtroppo, l'inibizione non selettiva di β - o γ-secretasi provoca inevitabili effetti collaterali che sono a causa di interferenze con il funzionamento di altri substrati fisiologici di β - e γ-secretasi5,6. Per quanto riguarda gli inibitori di γ-secretasi, studi recenti hanno riferito la scoperta di un numero di modulatori chimici e genetici che possono regolare la produzione di Aβ pur esercitando effetti trascurabili sul trattamento essenziale di γ-secretasi-mediata della tacca7 ,8,9,10,11,12, tuttavia, terapeutica di successo non sono state ancora sviluppate. Così, ulteriori schermi sistematici sono autorizzati a scoprire romanzo modificatori genetici e chimici che possono modulare selettivamente γ-secretasi-mediata del processamento di APP.

Γ-secretasi sono conosciuto per più di 90 diverse proteine ancorata alla membrana. Tra questi substrati è tacca, la cui attività è fondamentale per la determinazione di destino delle cellule e differenziazione durante lo sviluppo13. Selettivamente modulando APP γ-secretasi-catalizzata di elaborazione in assenza di pregiudicare la tacca elaborazione sarà essenziale per minimizzare effetti collaterali correlati al tacca di γ-secretasi inibitori, e questa selettività è pensata per essere un fattore primario che verrà dettare l'efficacia biologica di potenziali modulatori di γ-secretasi per il trattamento cronico dell'annuncio. Ci sono stati un certo numero di derivati arylsulfonamide, come GSI-953 (begacestat) e BMS-708163 (avagacestat), che sono stati trovati per esibire l'inibizione potente e selettivo di γ-secretasi14,15. Uno studio precedente ha dimostrato che l'inibizione differenziale di γ-secretasico di APP e tacca può essere osservato utilizzando un test ELISA quantitativo in combinazione con la convalida in vivo utilizzando zebrafish16. Inoltre, paradigmi di analisi basati su cellule sono state stabilite per affrontare il potenziale selettività di substrato di γ-secretasi verso APP e tacca17,18. Utilizzando protocolli simili a quelle descritte nel presente documento, abbiamo recentemente scoperto una nuova classe di (D)-leucinamides che modulano potentemente γ-secretasico di APP con tacca-con parsimonia selettività19. Insieme, questa raccolta di studi fornisce un proof-of-concept sostiene la nozione che la selettività/disponibilità del substrato di γ-secretasi possono essere soggetti a verifiche sperimentali e modulazione chimica. Tuttavia, queste piattaforme di analisi spesso si basano su letture relativamente bassa produttività e laboriosi approcci che potrebbero non soddisfare gli standard industriali per programmi di scoperta della droga.

Recentemente abbiamo generato le analisi di gene reporter luciferasi basati su cellule che possono determinare quantitativamente l'attività catalitica di γ-secretasi verso due distinti substrati, il frammento C-terminale acido 99-amminico dell'APP (APP-C99) ed extracellulare dominio-eliminato peptide tacca (NΔE). Sia APP-C99 e NΔE sono stati ampiamente utilizzati come substrati diretti di γ-secretasi in vari saggi. Per generare analisi di gene reporter luciferasi omogenea e coerente per il γ-secretasico di APP-C99 o NΔE, abbiamo generato una linea cellulare stabile HEK-derivata (CG) che esprime costitutivamente un Gal4 promotore-driven firefly luciferase reporter ( Gal4-Luc) e proteina di fusione Gal4/VP16-taggati APP-C99 (C99-GV). Inoltre, abbiamo generato un'altra linea cellulare stabile HEK-derivata (NG) che esprime costitutivamente Gal4-Luc e Gal4/VP16-etichetta NΔE (NΔE-GV). Utilizzando queste analisi romanzo substrato specifico γ-secretasi, ora forniamo un metodo per quantificare e distinguere l'attività catalitica di γ-secretasi verso distinti substrati (APP-C99 in cellule di CG), o NΔE in cellule di NG. Inoltre, i saggi di substrato specifico γ-secretasi sono stati progettati per essere favorevole alla piattaforme di screening ad alto contenuto. Queste analisi appena generato γ-secretasi potrebbero spianare la strada per la scoperta dei modulatori di romanzo γ-secretasi che potrebbe migliorare la funzione conoscitiva sopprimendo la produzione di Aβ senza provocare indesiderato inibizione di tacca per il trattamento di nuova generazione dell'annuncio.

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Protocollo

1. misura di segnali di Reporter luciferasi, che corrispondono a γ-secretasico di APP-C99 o NΔE

Nota: Consultare le pubblicazioni precedenti per le descrizioni dettagliate della generazione di CG e NG cellule20,21.

  1. NG o CG celle di semi (20, 000 cellule per pozzetto) a 96 pozzetti in un volume finale di 200 μL/pozzetto in mezzo di crescita che è composto per volta Eagle Medium (DMEM) maggiorato del 10% siero bovino fetale di Dulbecco (FBS), 5 μg/mL Consciousness, 250 antibiotico μg/mL (ad es. zeocina) e 200 μg/mL igromicina B.
    1. Contare le celle con un emocitometro.
    2. Trasferire un incubatore di CO2 micropiastre e incubare a 37 ° C durante la notte.
  2. Rimuovere 100 μL di coltura da ogni pozzetto.
  3. Aggiungere 100 μL/pozzetto di crescita media contenente 2 tetraciclina μg/mL con entrambi 0,2% dimetilsolfossido (DMSO), 2 μM CL-387.785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) o altri correlati ErbB1/ErbB2 inibitori.
  4. Incubare le cellule trattate di CG o NG in micropiastre a 37 ° C per 24 h.
  5. Rimuovere 150 μL/pozzetto crescita medio da micropiastre.
  6. Aggiungere 50 μL/pozzetto luciferase assay reagente (Vedi Tabella materiali).
  7. Trasferire le micropiastre a un lettore di micropiastre di luminescenza.
    1. Mantenere le micropiastre a temperatura ambiente per 5 minuti con agitazione delicata.
  8. Determinare il Firefly luciferase (FL)-emessa luminescenza utilizzando un programma pre-definito memorizzati nel lettore di micropiastre di luminescenza.
    1. Aprire il software di controllo dello strumento (Vedi Tabella materiali per dettagli sullo strumento).
    2. Dal menu 'Strumenti', selezionare 'Parametri'.
      1. Sotto le impostazioni 'Parametri', non scegli 'Nessun filtro' per filtro di emissione, tick 'normale' per apertura di emissione, invio '1' per tempo di conteggio e fare clic su 'OK' per impostare la lettura di luminescenza.
    3. Sotto la scheda 'Strumento controllo', scorrere l'elenco dei protocolli attivi e selezionare il protocollo pre-memorizzato per la lettura di luminescenza.
    4. Sotto la scheda 'Visualizzazione Live', definire la scala dall'elenco a discesa e selezionare 'Logaritmo' o 'Lineare' per il tipo.
    5. Sotto la scheda 'Temperatura', selezionare 'Off' per riscaldamento della piastra.
    6. Fare clic sul pulsante 'Start' per eseguire la lettura di luminescenza.
    7. Se necessario, è possibile esportare i risultati in un formato di foglio di calcolo usando il 'Explorer' incorporato all'interno del software di controllo.

2. quantificazione delle attività γ-secretasi

  1. Definire un segnale di luminescenza emessa da CG o NG cellule trattate con 0,1% DMSO in terreno di coltura contenente 1 tetraciclina μg/mL da solo come attività relativa γ-secretasi di 100%.
    1. Stima sfondo luminescenza da CG o NG celle trattando le cellule con il mezzo di crescita che non include tetraciclina.
  2. Normalizzare la luciferasi segnali dalle cellule CG o NG che sono coltivate con terreno di coltura contenente 1 tetraciclina μg/mL ed entrambi 1 μM CL-387.785 o 1 μM di DAPT con il segnale di luciferasi emessa dal CG DMSO-trattati o NG cellule (attività relativa γ-secretasi di 100%, come definito al punto 2.1).

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Risultati

Inibizione di ErbB2 da CL-387.785 differenzialmente può promuovere l'elaborazione di APP-C99 di Γ -secretasi senza intaccare il clivaggio di Notch
Per stabilire un'analisi basata sulle celle che possono misurare quantitativamente il clivaggio proteolitico di un substrato particolare γ-secretasi, abbiamo generato la linea cellulare derivata da HEK293 CG di co-trasfezione stabile di una tetraciclina-inducible C-terminale Gal4/VP16-etiche...

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Discussione

I promettenti risultati da uno studio di fase 1b di immunoterapia aducanumab per annuncio hanno stabilito saldamente il ruolo critico di Aβ nella patogenesi dell'AD22 e suggeriscono che gli approcci anti-Aβ sono ancora una valida strategia per lo sviluppo di farmaci anti-annuncio. Qui, descriviamo analisi cell-based per quantificare γ-secretasi-catalizzata di proteolisi di APP-C99 e NΔE utilizzando sistemi di firefly luciferase reporter. APP-C99 e NΔE sono i due substrati di γ-secretasi più ben st...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano la struttura di nucleo del Istituto del cellulare e biologia organismica, Academia Sinica, per il supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dal Ministero della scienza e tecnologia, Taiwan (più 103-2320-B-001-016-MY3 Y.-f. L.), il programma per l'innovazione traslazionale di sviluppo biofarmaceutico – tecnologia che supporta la piattaforma asse regime (NP7 a Y.-F.L.) e Academia Sinica (a Y.-F.L.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lettore di piastre a luminescenza VictorLightPerkinElmer2030-0010
Classe II, Tipo 2 Cabina di sicurezza biologicaThermo Scientific1300 Serie A2
CL-387,785EMD Calbiochem233100-1MG
DAPTMerck565770
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher12100046componente principale del terreno di crescita
Siero fetale bovino (FBS)Thermo Fisher16000044
BlasticidinThermo FisherA1113903
ZeocinThermo FisherR25005
Hygromycin BGibco10687010
HemocytomerSigma-AldrichAldrich
a 96 pozzettiNunc156545
TetraciclinaSigmaT7660
Dimetil solfossido (DMSO)SigmaD2650
Reagente per il dosaggio della luciferasi Steady-GloPromegaE2510
Incubatore umidificato CO2RevcoUltima II
Linea cellulare T-REx293InvitrogenR71007
Wallac 1420 versione software 3.0PerkinElmerdel lettore di micropiastre a luminescenza
BR717805 Micropiastra Software di controllo dello strumento

Riferimenti

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
  3. Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
  4. Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
  5. Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
  6. Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
  7. Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
  8. Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
  9. Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
  10. Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
  11. Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
  12. He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
  13. Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
  14. Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
  15. Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
  16. Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15(2008).
  17. McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
  18. Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).
  19. Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
  20. Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
  21. Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
  22. Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
  23. Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
  24. Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
  25. Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
  26. Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).

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