Protocollo sperimentale per il rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti esposti ai pesticidi organoclorina

Summary

Comprendere l'influenza dei pesticidi organoclori ambientali (OC) sulla funzione mitocondriale negli epariti è importante per esplorare il meccanismo degli OC Che causano disturbi metabolici. Questo documento presenta metodi dettagliati per rilevare la funzione mitocondriale epatico.

Abstract

Questo documento presenta metodi dettagliati per rilevare la funzione mitocondriale epatico per comprendere meglio la causa dei disturbi metabolici causati dai pesticidi organoclori ambientali (OOC) negli epatociti. Le cellule di HepG2 sono state esposte β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) per 24 h ad una dose equivalente di esposizione interna nella popolazione generale. L'ultrastruttura negli eparociti è stata esaminata dalla microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per mostrare il danno dei mitocondri. La funzione mitocondriale è stata ulteriormente valutata dall'intensità della fluorescenza mitocondriale, dai livelli di adenosina 5'-triphosphate (ATP), dal tasso di consumo di ossigeno (OCR) e dal potenziale della membrana mitocondriale (MMP) nelle cellule HepG2 incubate con β-HCH. L'intensità della fluorescenza dei mitocondri dopo essere stata osservata con una microscopia a fluorescenza verde mitocondriale è stata osservata con una microscopia a fluorescenza. La reazione luciferina-luciferasi è stata utilizzata per determinare i livelli ATP. L'MMP è stato rilevato dal colorante cationico JC-1 e analizzato sotto la citometria di flusso. L'OCR è stato misurato con un analizzatore di flusso extracellulare. In sintesi, questi protocolli sono stati utilizzati nel rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti con per indagare sui danni dei mitocondri.

Introduction

Gli effetti dei pesticidi organoclori (OC) sulla salute, ad esempio l'interferenza riproduttiva, la tossicità immunologica, i cambiamenti metabolici sono stati precedentemente^{studiati 1,2,3}. I metodi per rilevare il metabolismo cellulare e scoprire la disfunzione mitocondriale hanno permesso agli scienziati di comprendere il ruolo della funzionemitocondriale (cioè., livelli di STAT3 mitocondriale, lattato, piruvato, rapporto lattato-piruvate, coenzime Q10, perdita di protono mitocondriale, bioenergetica, biogenesi e dinamica) in aree come l'invecchiamento, l....

Protocol

Tutti gli esperimenti e i protocolli dell'esperimento sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti e approvati dal Comitato Etico locale dell'Università di Medicina di Nanjing.

1. Ultrastruttura mitocondriale di TEM

1. Raccolta di celle HepG2
   1. Seme Cellule HepG2 in piatti da 100 mm. Conservare a 37 gradi centigradi e 5% CO₂.
   2. Digerire le cellule con 0,25% EDTA in tubo 1,5 mLEP.
   3. Centrifuga a 1000 x g per 3 min a temperatura ambiente (RT). Scarta il supernatant.
   4. Raccogli 4-6 x 10⁵ cellule HepG2.
2. Aggiungere 1 m....

Results

I mitocondri di cellule HepG2 esposte a β-HCH sono stati notevolmente danneggiati. I mitocondri sparsi erano leggermente espansi, di forma irregolare, e la cresta mitocondriale scomparve con un'architettura mitocondriale relativamente anormale (Figura 1).

Intensità media di fluorescenza verde mitocondriale, che rappresenta i mitocondri, diminuita nelle cellule HepG2 esposte a β-HCH (

Discussion

Fondamentale per il successo del protocollo di rilevamento è l'uso di una varietà di metodi sperimentali che sono stati trattati lo studio dal fenotipo al meccanismo. In questo studio, le cellule Dicale sono state colturate in DMEM con penicillina e streptomicina e siero bovino fetale al 10%. Quando le cellule hanno raggiunto il 40-50% di confluenza, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) sono stati aggiunti e incubati per 24 h. In primo luogo abbiamo usato TEM che ha mostrato i cambiamenti ultrastrutturali nell'eparitocita causati da.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio elettronico a trasmissione	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Imaging ad alto contrasto e ad alta risoluzione, Osservazione e imaging a basse dosi, Osservazione a bassa temperatura, Prestazioni analitiche eccezionali, Automazione per comodità e prestazioni
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green è una sonda fluorescente verde mitocondriale che può essere utilizzata per la colorazione fluorescente mitocondriale specifica per cellule vive.
Microscopio confocale a scansione laser	Zeiss	700B	Il design è compatto, stabile, il percorso della luce è il più breve, l'alta precisione della luce, la tecnologia creativa e la sofisticata tecnologia di scansione insieme per produrre un'immagine perfetta del campione tridimensionale.
Kit per il dosaggio dell'ATP potenziato	Beyotime	S0027	kit per il dosaggio dell'ATP potenziato può essere utilizzato per rilevare i livelli di ATP (adenosina 5'-trifosfato) in soluzioni, cellule o tessuti comuni. Le cellule e i campioni di tessuto possono essere divisi per completare la preparazione del campione, la sensibilità di rilevamento fino a 0,1 nmol / L, la chemiluminescenza può essere sostenuta per 30 minuti.
Luminometro	Berthold	Centro LB 960	Il luminometro è un rivelatore di chemiluminescenza, il campione di prova stesso può essere leggero, non ha bisogno di stimolare. Il luminometro è lo strumento che rileva la chemiluminescenza.
Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Beyotime	P0012	kit per il dosaggio delle proteine BCA è uno dei metodi più comunemente usati per rilevare le concentrazioni proteiche.
Lettore multimodale	TECAN	InfiniteM200	Il lettore multimodale può essere utilizzato per rilevare l'autorizzazione delle proteine.