Un protocollo per la selezione in vitro e caratterizzazione di aptameri di DNA specifico del gruppo acido ftalico estere-associazione è presentato. È inclusa anche l'applicazione dell'aptamero selezionato in un aptasensor elettrochimico.
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Articolo metodologico
Acido ftalico Ester-associazione DNA aptamero selezione, caratterizzazione e applicazione di un Aptasensor elettrochimica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Acido ftalico esteri (PAEs) sonouno dei principali gruppi di inquinanti organici persistenti. La rilevazione di gruppo-specifica del PAEs altamente è voluta a causa la rapida crescita dei congeneri. Aptameri di DNA sono state applicate sempre più come elementi di riconoscimento su piattaforme di biosensore, ma selezionando aptameri verso obiettivi altamente idrofobo piccola molecola, come PAEs, sono segnalata raramente. Questo lavoro descrive un metodo basato su tallone progettato per selezionare aptameri di DNA specifico del gruppo di PAEs. Il gruppo amminico funzionalizzati ftalato di dibutile (DBP-NH2) come la destinazione di ancoraggio è stata sintetizzata e immobilizzata le perline di agarosio epossi-attivato, consentendo la visualizzazione del gruppo estere ftalico alla superficie della matrice immobilizzazione, e pertanto la selezione dei leganti specifici del gruppo. Abbiamo determinato le costanti di dissociazione dei candidati aptamero da reazione a catena quantitativa polimerizzazione accoppiato con separazione magnetica. La relativa affinità e selettività di aptameri per altri PAEs sono stati determinati mediante le analisi competitive, dove i candidati aptamero pre-sono stati limitati al DBP-NH2 allegata biglie magnetiche e rilasciato al supernatante sopra incubazione con il PAEs testata o altri potenziali sostanze interferenti. Prova competitiva è stata applicata perché esso fornito un confronto facile affinità tra PAEs che non aveva nessun gruppi funzionali per immobilizzazione superficiale. Infine, abbiamo dimostrato la realizzazione di un aptasensor elettrochimico e usato per rilevazione ultrasensibile e selettivo di 2-etilesilftalato. Questo protocollo fornisce intuizioni per la scoperta di aptamero di altre piccole molecole idrofobiche.
Introduzione
Insieme a rapido sviluppo economico, accelerazione di industrializzazione e costruzione urbana, l'inquinamento ambientale è più grave che mai. Inquinanti ambientali tipici includono ioni di metalli pesanti, tossine, antibiotici, pesticidi, endocrini e inquinanti organici persistenti (pop). Oltre a ioni metallici e le tossine, altri inquinanti sono piccole molecole che molto spesso consistono in una varietà di congeneri. Ad esempio, il pop più tossici includono i policlorobifenili (PCB), idrocarburi policiclici aromatici (IPA), eteri di difenile polibromurati (PBDE), policloro dibenzo-p-diossine (PCDD), difenili policlorodibenzofurani (PCDF) e ftalico esteri dell'acido....
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Protocollo
1. biblioteca e disegno dell'iniettore e sintesi
-
Progettare la Biblioteca iniziale e primer.
Biblioteca (piscina0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
Forward primer (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
Fosforilato reverse primer (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3' - Sintetizzare piscina0, FP e PO4- RP utilizzando standard phosphoramidite chimica18,19,20e purificare tutti i DNAs da standard ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)21....
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Risultati
Abbiamo progettato e sintetizzato il gruppo amminico funzionalizzato dibutilftalato (DBP-NH2) come la destinazione di ancoraggio (Figura 1F). Abbiamo quindi effettuato la selezione aptamero del DNA di PAEs utilizzando DBP-NH2 come destinazione ancoraggio e seguendo il metodo di immobilizzazione-base classica destinazione (Figura 2). In ogni round, un pilota PCR è stata effettuata utilizzando la pagina denatu.......
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Discussione
Uno dei vantaggi eccezionale di aptameri è che vengono identificati tramite il metodo in vitro SELEX, mentre gli anticorpi sono generati tramite immunoreactions in vivo . Pertanto, è possono selezionare aptameri con specificità di destinazione desiderata in condizioni sperimentali ben progettate, considerando che gli anticorpi sono limitati a condizioni fisiologiche.
Per facilitare la separazione delle sequenze associati da sequenze gratuiti, diversi SELEX modificate recentem.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrenti.
Ringraziamenti
Siamo grati per il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation (21675112), progetto di chiave del piano di scienza e tecnologia di Pechino Education Commission (KZ201710028027) e programma di Yanjing giovane studioso di Capital Normal University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| UV-2550 | Shimadzu, protocollo giapponese | , sezione 3.8.2 | |
| Termociclatore DNA Engnine, PTC0200 | BIO-RAD | sezione 3.5.1.2 e 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | sezione 5.3.6 e 6.3 | |
| VMP3 potenziostato multicanale | Bio-Logic Science, Claix, Francia | sezione 7.4, 7.8 e 7.11 | |
| Sefarosio 6B | attivato dalla resina epossidicaGE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | perle di argarosio, sezione 2.3 e 3.3 |
| Dynabeads M-270 perle magnetiche di acido carbossilico | Invitrogen, USA | 420420 | perline magnetiche, sezione 5.2. e 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Versione | Takara, Dalian, Cina | R028A | polimerasi, sezione 3.5.1.1 |
| PARAFILM Membrana di tenuta | Bemis, USA | PM-996 | sezione 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | sezione3.7.1.2.Il tampone di reazione 10 × è fornito insieme all'esonucleasi λ dal fornitore. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier | Takara, Dalian, China | 9094 | sezione 3.6.2 e 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE Kit di recupero del DNA | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | sezione 4.2 |
| SYBR Gold colorante in gel di acido nucleico | Invitrogen, USA | 1811838 | colorante per acido nucelico, sezione 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara, Dalian, Cina | RR820A | miscela di polimerasi contenente polimerasi e dNTP, sezione 5.3.5 |
| 2-(N-morfolino)acido etansolfonico (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | sezione 5.2.1 |
| 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | sezione 5.2.2 |
| N-idrossisuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | sezione 5.2.3 |
| mercaptoesanolo (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | sezione 7.7 |
| Elettrodo d'oro | Shanghai Chenhua | CHI101 | sezione 7.4. - 7.11 |
| tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | sezione 7.5 |
| O-(2-Mercaptoetil)-O'-metil-esa-(glicole etilenico) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | sezione 7.7 |
| dietilexil ftalato (DEHP) | National Institute of Metrology, Cina | CAS: 117-81-7 | sezione 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | poliossieti-lene(20) monolaurato di sorbaitan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | tensioattivo non ionico |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | tampone fosfato da 10 mM contenente 1 M di NaCl, pH 7,4 |
Riferimenti
- Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
- Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B.
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Ristampe e permessi
