Acido ftalico Ester-associazione DNA aptamero selezione, caratterizzazione e applicazione di un Aptasensor elettrochimica

Summary

Un protocollo per la selezione in vitro e caratterizzazione di aptameri di DNA specifico del gruppo acido ftalico estere-associazione è presentato. È inclusa anche l'applicazione dell'aptamero selezionato in un aptasensor elettrochimico.

Abstract

Acido ftalico esteri (PAEs) sonouno dei principali gruppi di inquinanti organici persistenti. La rilevazione di gruppo-specifica del PAEs altamente è voluta a causa la rapida crescita dei congeneri. Aptameri di DNA sono state applicate sempre più come elementi di riconoscimento su piattaforme di biosensore, ma selezionando aptameri verso obiettivi altamente idrofobo piccola molecola, come PAEs, sono segnalata raramente. Questo lavoro descrive un metodo basato su tallone progettato per selezionare aptameri di DNA specifico del gruppo di PAEs. Il gruppo amminico funzionalizzati ftalato di dibutile (DBP-NH₂) come la destinazione di ancoraggio è stata sintetizzata e immobilizzata le perline di agarosio epossi-attivato, consentendo la visualizzazione del gruppo estere ftalico alla superficie della matrice immobilizzazione, e pertanto la selezione dei leganti specifici del gruppo. Abbiamo determinato le costanti di dissociazione dei candidati aptamero da reazione a catena quantitativa polimerizzazione accoppiato con separazione magnetica. La relativa affinità e selettività di aptameri per altri PAEs sono stati determinati mediante le analisi competitive, dove i candidati aptamero pre-sono stati limitati al DBP-NH₂ allegata biglie magnetiche e rilasciato al supernatante sopra incubazione con il PAEs testata o altri potenziali sostanze interferenti. Prova competitiva è stata applicata perché esso fornito un confronto facile affinità tra PAEs che non aveva nessun gruppi funzionali per immobilizzazione superficiale. Infine, abbiamo dimostrato la realizzazione di un aptasensor elettrochimico e usato per rilevazione ultrasensibile e selettivo di 2-etilesilftalato. Questo protocollo fornisce intuizioni per la scoperta di aptamero di altre piccole molecole idrofobiche.

Introduction

Insieme a rapido sviluppo economico, accelerazione di industrializzazione e costruzione urbana, l'inquinamento ambientale è più grave che mai. Inquinanti ambientali tipici includono ioni di metalli pesanti, tossine, antibiotici, pesticidi, endocrini e inquinanti organici persistenti (pop). Oltre a ioni metallici e le tossine, altri inquinanti sono piccole molecole che molto spesso consistono in una varietà di congeneri. Ad esempio, il pop più tossici includono i policlorobifenili (PCB), idrocarburi policiclici aromatici (IPA), eteri di difenile polibromurati (PBDE), policloro dibenzo-p-diossine (PCDD), difenili policlorodibenzofurani (PCDF) e ftalico esteri dell'acido....

Protocol

1. biblioteca e disegno dell'iniettore e sintesi

1. Progettare la Biblioteca iniziale e primer.
   Biblioteca (piscina₀): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
   Forward primer (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
   Fosforilato reverse primer (PO₄- RP): 5'-PO₄- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
2. Sintetizzare piscina₀, FP e PO₄- RP utilizzando standard phosphoramidite chimica^18,19,20e purificare tutti i DNAs da standard ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)^21....

Results

Abbiamo progettato e sintetizzato il gruppo amminico funzionalizzato dibutilftalato (DBP-NH₂) come la destinazione di ancoraggio (Figura 1F). Abbiamo quindi effettuato la selezione aptamero del DNA di PAEs utilizzando DBP-NH₂ come destinazione ancoraggio e seguendo il metodo di immobilizzazione-base classica destinazione (Figura 2). In ogni round, un pilota PCR è stata effettuata utilizzando la pagina denatu.......

Discussion

Uno dei vantaggi eccezionale di aptameri è che vengono identificati tramite il metodo in vitro SELEX, mentre gli anticorpi sono generati tramite immunoreactions in vivo . Pertanto, è possono selezionare aptameri con specificità di destinazione desiderata in condizioni sperimentali ben progettate, considerando che gli anticorpi sono limitati a condizioni fisiologiche.

Per facilitare la separazione delle sequenze associati da sequenze gratuiti, diversi SELEX modificate recentem.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV-2550	Shimadzu, protocollo giapponese		, sezione 3.8.2
Termociclatore DNA Engnine, PTC0200	BIO-RAD		sezione 3.5.1.2 e 3.5.2
C1000 Touch	BIO-RAD		sezione 5.3.6 e 6.3
VMP3 potenziostato multicanale	Bio-Logic Science, Claix, Francia		sezione 7.4, 7.8 e 7.11
Sefarosio 6B	attivato dalla resina epossidicaGE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	10220020	perle di argarosio, sezione 2.3 e 3.3
Dynabeads M-270 perle magnetiche di acido carbossilico	Invitrogen, USA	420420	perline magnetiche, sezione 5.2. e 5.3
Premix Taq Hot Start Versione	Takara, Dalian, Cina	R028A	polimerasi, sezione 3.5.1.1
PARAFILM Membrana di tenuta	Bemis, USA	PM-996	sezione 3.6.5
Lambda Exonuclease	Invitrogen, USA	EN0561	sezione3.7.1.2.Il tampone di reazione 10 × è fornito insieme all'esonucleasi λ dal fornitore.
Dr. GenTLE Precipitation Carrier	Takara, Dalian, China	9094	sezione 3.6.2 e 3.8.1
UNIQ-10 PAGE Kit di recupero del DNA	Sangon Biotech (Shanghai)	B511135	sezione 4.2
SYBR Gold colorante in gel di acido nucleico	Invitrogen, USA	1811838	colorante per acido nucelico, sezione 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II	Takara, Dalian, Cina	RR820A	miscela di polimerasi contenente polimerasi e dNTP, sezione 5.3.5
2-(N-morfolino)acido etansolfonico (MES)	Sigma-Aldrich	CAS: 1132-61-2	sezione 5.2.1
1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC)	Invitrogen, USA	CAS: 25952-53-8	sezione 5.2.2
N-idrossisuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	6066-82-6	sezione 5.2.3
mercaptoesanolo (MCH)	Sigma-Aldrich	CAS: 1633-78-9	sezione 7.7
Elettrodo d'oro	Shanghai Chenhua	CHI101	sezione 7.4. - 7.11
tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP)	Sigma-Aldrich	CAS: 51805-45-9	sezione 7.5
O-(2-Mercaptoetil)-O'-metil-esa-(glicole etilenico)	Sigma-Aldrich	CAS: 651042-82-9	sezione 7.7
dietilexil ftalato (DEHP)	National Institute of Metrology, Cina	CAS: 117-81-7	sezione 7.11
Tween 20	Sigma-Aldrich	CAS: 9005-64-5	poliossieti-lene(20) monolaurato di sorbaitan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	CAS: 9002-93-1	tensioattivo non ionico
PBS	Sigma-Aldrich	P5368	tampone fosfato da 10 mM contenente 1 M di NaCl, pH 7,4