Articolo metodologico

DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

DOI:

10.3791/56815

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9 novembre 2017

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive la sintesi delle particelle magnetiche e valutazione delle loro proprietà di legame al DNA tramite dispersione della luce dinamica ed elettroforetica. Questo metodo si concentra sul monitoraggio dei cambiamenti nella dimensione delle particelle, loro polidispersità e potenziale zeta della superficie delle particelle che svolgono importanti ruolo nell'associazione di materiali come il DNA.

Abstract

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Isolamento di DNA usando particelle magnetiche è un campo di grande importanza nella ricerca di biologia molecolare e biotecnologia. Questo protocollo descrive la valutazione del DNA-magnetoscopico vincolante tramite diffusione dinamica della luce (DLS) e dispersione della luce elettroforetica (ELS). Analisi di DLS fornisce preziose informazioni sulle proprietà fisico-chimiche delle particelle tra cui la dimensione delle particelle, polidispersità e potenziale zeta. Quest'ultimo descrive la carica superficiale della particella che svolge un ruolo importante nell'associazione elettrostatica di materiali come il DNA. Qui, un'analisi comparativa sfrutta tre modifiche chimiche di nanoparticelle e microparticelle e loro effetti sul legame del DNA e di eluizione. Modificazioni chimiche di ramificata polyethylenimine, tetraetile ortosilicato e (3-amminopropil) trietossisilano sono studiati. Poiché DNA esibisce una carica negativa, si prevede che il potenziale zeta della superficie della particella diminuirà legandosi di DNA. Formando dei cluster dovrebbe essere estesa anche dimensione delle particelle. Al fine di indagare l'efficacia di queste particelle in isolamento ed eluizione del DNA, le particelle sono mescolate con DNA a basso pH (~ 6), alta forza ionica e ambiente di disidratazione. Le particelle vengono lavate il magnete e quindi il DNA è eluito dal tampone Tris-HCl (pH = 8). Numero di copie di DNA è stimato usando reazione a catena quantitativa della polimerasi (PCR). Potenziale Zeta, dimensione delle particelle, polidispersità e dati quantitativi di PCR sono valutati e confrontati. DLS è un perspicace e sostenere il metodo di analisi che aggiunge una nuova prospettiva al processo di proiezione di particelle per isolamento del DNA.

Introduzione

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Isolamento del DNA è uno dei passi più importanti nella biologia molecolare. Lo sviluppo di metodi di estrazione dell'acido nucleico ha grande impatto sui campi emergenti della genomica, metagenomica, epigenetica e trascrittomica. C'è una vasta gamma di applicazioni biotecnologiche per isolamento del DNA compreso medico (strumenti forensi/diagnostica e biomarcatori prognostici) e applicazioni ambientali (biodiversità metagenomica, la prevalenza del patogeno e sorveglianza). C'è stata la crescente domanda di purificare e isolare il DNA da materiali diversi e in diverse scale come sangue, urina, terra, legno e altri tipi di campioni. 1 ,

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Protocollo

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1. sintesi di nanoparticelle magnetiche

  1. sintesi di nanoparticelle magnetiche stabilizzato con citrato (MNPs)
    1. aggiungere 20 mmol di FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5,406 g) e 10 mmol di FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1,988 g) in 20 mL di acqua distillata doppia deossigenata (ddd acqua). Mescolare ottenuti soluzione vigorosamente in Becher sotto atmosfera di 2 N tramite agitatore meccanico fino ad ottenuta una soluzione trasparente.
    2. Sotto agitazione meccanica rapida, aggiungere 150 mL di 1m NH 4 OH, goccia a goccia utilizzando imbuto (prendere 1 ora o più se necessario). Do....

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Risultati

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Mediante il protocollo descritto qui per sintesi chimica e la modifica delle particelle magnetiche, sei particelle magnetiche sono state sintetizzate e analizzate per il grippaggio del DNA. Una sintesi dell'analisi è mostrata nella tabella 1. Confrontando le dimensioni delle particelle in acqua e in soluzione di rilegatura, è chiaro che tutte le particelle aggregate in associazione soluzione da pieghe 2-22. Alcune particelle aggregate ulteriormente a più pieghe in presenz.......

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Discussione

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In questo protocollo, i principi teorici che spiegano il legame al DNA di particelle magnetiche via potenziale zeta erano sotto la domanda. Il protocollo descrive la sintesi e la modifica di nanoparticelle magnetiche e microparticelle. Metodo per la preparazione della soluzione di controllo e l'associazione del DNA inoltre sono descritti. Due strategie sono mostrate qui per lo screening delle interazioni DNA-particella: PCR quantitativa e liste di distribuzione si avvicina. DLS fornisce tre indicatori di cambiamenti fisi.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Il sostegno finanziario dalla ceca Science Foundation (progetto GA CR 17-12816S) e CEITEC 2020 (LQ1601) notevolmente è riconosciuto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cloruro di ferro (III) esaidratoSigma-Aldrich207926Sintesi di particelle magnetiche
Cloruro di ferro (II) tetraidratoSigma-Aldrich380024Sintesi di particelle magnetiche
Solfato di ferro (II) eptaidratoSigma-AldrichF8263Sintesi di particelle magnetiche
AcetonePenta10060-11000Sintesi di particelle magnetiche
Citrato di sodio diidratoSigma-AldrichW302600Sintesi di particelle magnetiche
Ortosilicato tetraetileSigma-Aldrich131903Sintesi di particelle magnetiche
(3-amminopropil)trietossisilanoSigma-Aldrich440140Sintesi di particelle magnetiche
Polietilenimmina, ramificata, media Mw ~25.000Sigma-Aldrich408727Sintesi di particelle magnetiche
Soluzione di idrossido di ammonioSigma-Aldrich221228-M Sintesi di particelle magnetiche
EtanoloPenta71250-11000Sintesi di particelle magnetiche
Nitrato di potassioSigma-AldrichP6083Sintesi di particelle magnetiche
Idrossido di potassioSigma-Aldrich1.05012Sintesi di particelle magnetiche
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)Spectrum labsG235063Sintesi
di particelle magneticheAgitatore ad astawiteg Labortechnik GmbHDH. WOS01035Sintesi di particelle magnetiche
WaterbathMemmert GmbH + Co.84198998Sintetizzatore di particelle magnetiche
SonicatoreBandelin795Sintesi di particelle magnetiche
MARCA Cuvetta UV microSigma-AldrichBR759200-100EACuvetta per la misurazione delle dimensioni
MARCA tappo per cuvetta UV microSigma-AldrichBR759240-100EATappi per cuvette per la misurazione delle dimensioni
Piegato Capillare Zeta CellMalvernDTS1070Cuvetta per la misurazione del potenziale zeta
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600Dispositivo per la misurazione delle dimensioni e del potenziale zeta
Infinite 200 PRO
Strumento NanoQuant		Tecan396 227 V1.0, 04-2010dispositivo per la misurazione della concentrazione di DNA
SYBR Green Kit RT-PCR quantitativoSigma-AldrichQR0100Kit PCR
Mastercycler pro S strumentoEppendorf6325 000.013Termociclatore
Kit MinEluteQiagen28004Kit di purificazione del DNA
Acetato di sodioSigma-AldrichS7670Legame del DNA

Riferimenti

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  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al.

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Tag

Dynamic Light ScatteringZeta Potential AnalysisParticle Size MeasurementPolydispersity IndexDNA Isolation ProtocolMagnetic Particle SeparationQuantitative PCR AnalysisNanoparticle Surface Modification

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