Method Article

Creazione di un modello geometrico strutturalmente realistico agli elementi finiti di un Cardiomyocyte per studiare il ruolo dell'architettura cellulare in biologia dei sistemi del Cardiomyocyte

DOI:

10.3791/56817

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April 18th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per creare un modello ad elementi finiti spazialmente dettagliate dell'architettura intracellulare dei cardiomiociti da microscopia elettronica e immagini di microscopia confocale. Il potere di questo modello spazialmente dettagliato è dimostrato mediante studi di caso nella segnalazione di calcio e bioenergetica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con l'avvento di tridimensionale (3D) tecnologie di imaging come la tomografia elettronica, serial-blocco-faccia microscopia elettronica e confocale, la comunità scientifica ha accesso senza precedenti a DataSet di grandi dimensioni alle sub-micrometriche risoluzione che caratterizzano la ristrutturazione architettonica che accompagna i cambiamenti nella funzione del cardiomyocyte nella salute e nella malattia. Tuttavia, tali set di dati sono state sotto-utilizzate per investigare il ruolo dell'architettura cellulare che ritocca in funzione dei cardiomiociti. Lo scopo del presente protocollo è illustrato come creare un modello ad elementi finiti accurata di un cardiomyocyte usando microscopia elettronica ad alta risoluzione e immagini di microscopia confocale. Un dettagliato e preciso modello di architettura cellulare ha un potenziale significativo per fornire nuove intuizioni del cardiomyocyte biologia, più di esperimenti da solo possono raccogliere. La potenza di questo metodo risiede nella sua capacità di fondere computazionalmente informazioni da due diverse modalità di imaging di cardiomyocyte ultrastruttura di sviluppare un modello unificato e dettagliato dei cardiomiociti. Questo protocollo viene descritta la procedura per integrare tomografia elettronica e immagini di microscopia confocal di adulto maschi cardiomiociti di ratto Wistar (nome per una specifica razza di ratto dell'albino) per sviluppare un modello agli elementi finiti emisarcomero del cardiomyocyte. La procedura genera un modello 3D agli elementi finiti che contiene una rappresentazione accurata, ad alta risoluzione (dell'ordine di ~ 35 nm) della distribuzione dei mitocondri, miofibrille e cluster di recettore rianodinico che rilasciano il calcio necessario per cardiomyocyte contrazione della rete reticolare sarcoplasmatico (SR) nella miofibrilla e vano citosolico. Il modello generato qui come un'illustrazione non incorporare dettagli dell'architettura tubulo trasverso o la rete reticolare sarcoplasmatica ed è quindi un modello minimo dei cardiomiociti. Tuttavia, il modello può essere applicato già nelle indagini basate su simulazione nel ruolo della struttura cellulare in bioenergetica mitocondriale e segnalazione del calcio, che è illustrato e discusso con due studi di casi che vengono presentati seguendo le protocollo dettagliato.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC) nel cuore si riferisce all'importante e intricato di accoppiamento tra eccitazione elettrica della membrana dei cardiomiociti e la successiva contrazione meccanica della cella durante ogni battito cardiaco. Modelli matematici hanno giocato un ruolo chiave nello sviluppo di una comprensione quantitativa dei processi biochimici interconnessi che regolano il potenziale d'azione1, il calcio citosolico segnalazione2, bioenergetica3e successive generazione di forza contrattile. Tali modelli hanno predetto con successo anche le modifiche per il battito cardiaco quando uno o più di questi processi biochimici subiscono alterazioni4,5. L'ultrastruttura altamente organizzato del cardiomyocyte sempre più è stato riconosciuto un ruolo critico nella funzione contrattile normale della cellula e tutto il cuore. Infatti, si verificano modifiche alla morfologia e organizzazione delle componenti della ultrastruttura cardiaca in parallelo ai cambiamenti biochimici in termini di malattia quali ipertrofia6, insufficienza cardiaca7e8di cardiomiopatia diabetica. Se questi cambiamenti strutturali sono minori, adattive o patologiche risposte al mutare le condizioni biochimiche è ancora in gran parte sconosciuto9. L'accoppiamento intrinsecamente stretto tra forma e funzione in biologia significa che gli studi sperimentali da solo non possono fornire più profonde intuizioni di correlazioni tra rimodellamento strutturale e funzione dei cardiomiociti. Una nuova generazione di modelli matematici che possono integrare l'assemblea strutturale dei componenti sub-cellulari, insieme con i processi biochimici ben studiati, sono necessari per sviluppare una comprensione completa, quantitativa del rapporto tra struttura, biochimica e forza contrattile in cardiomiociti. Questo protocollo descrive i metodi che possono essere utilizzati per generare modelli agli elementi finiti strutturalmente accurati dei cardiomiociti che possono essere utilizzati per tali indagini.

L'ultimo decennio ha visto progressi significativi nella microscopia 3D10, confocale11e di microscopia di Super-risoluzione12 che forniscono approfondimenti senza precedenti, ad alta risoluzione nell'assembly su scala nano e micro-scala della componenti sub-cellulari del del cardiomyocyte. Recentemente, questi set di dati sono stati utilizzati per generare modelli computazionali di cardiomyocyte ultrastruttura13,14,15,16. Questi modelli utilizzano un metodo di simulazione ingegneria ben consolidata, chiamato il metodo agli elementi finiti17, per creare elementi finiti reticoli computazionali su cui processi biochimici e del cardiomyocyte contrazioni possono essere simulate. Tuttavia, questi modelli sono limitati dalla risoluzione e dettaglio che può fornire un metodo di microscopia in un set di dati di immagine. Ad esempio, la microscopia elettronica in grado di generare nanometro-livello dettaglio della struttura cellulare, ma è difficile identificare proteine specifiche all'interno dell'immagine che sarebbe necessario per creare un modello. D'altra parte, microscopia ottica super-risoluzione in grado di fornire immagini ad alto contrasto a risoluzioni dell'ordine di 50 nm di solo un selezionare alcuni componenti molecolari della cellula. Solo integrando le informazioni complementari da queste modalità di imaging si può realisticamente esplorare la sensibilità della funzione cambiamenti nella struttura. Correlativo luce e microscopia elettronica non è ancora una procedura di routine e ne deriverebbe ancora la limitazione che solo un numero limitato di componenti potrebbe essere macchiato nella visualizzazione immunofluorescenza e correlato con la vista di microscopia elettronica.

Questo protocollo presenta un nuovo approccio18 che utilizza metodi statistici19 per analizzare e computazionalmente fusibile microscopia chiara informazioni sulla distribuzione spaziale dei canali ionici con microscopia elettronica informazioni su altri cardiaco componenti, ultrastruttura, quali miofibrille e mitocondri. Questo produce un modello agli elementi finiti che può essere utilizzato con modelli biofisici di processi biochimici per studiare il ruolo dell'organizzazione subcellulare dei cardiomiociti sui processi biochimici che regolano la contrazione dei cardiomiociti. Ad esempio, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per creare modelli da sano e miociti cardiaci diabetici streptozotocin-indotti per studiare l'effetto di rimodellamento strutturale sulla funzione delle cellule cardiache che è osservata in animali diabetici modelli8. Un ulteriore vantaggio della natura statistica del metodo presentato è illustrato anche nel protocollo: il metodo può generare più istanze di geometrie di elementi finiti che imitano molto attentamente le variazioni sperimentalmente osservate nella struttura delle cellule.

Come una panoramica, la procedura di protocollo comprende: (i) preparazione del tessuto cardiaco per microscopia elettronica generare immagini 3D con sufficiente risoluzione e contrasto; (ii) ricostruzione e segmentazione delle serie di immagini 3D da microscopia elettronica dati utilizzando una ricostruzione 3D di microscopia elettronica e software di analisi di immagine denominato IMOD20; (iii) utilizzando iso2mesh21 per generare una mesh di elementi finiti utilizzando i dati segmentati come input; (iv) utilizzando l'algoritmo romanzo e codici per mappare la distribuzione dei canali ionici sulla maglia di elementi finiti.

La premessa dell'approccio ad ogni passaggio è descritto all'interno del protocollo e risultati rappresentativi sono previste le figure di accompagnamento. Una panoramica è delineata che specifica come i modelli spazialmente dettagliati generati possono essere utilizzati per studiare la dinamica spaziale di calcio durante ECC, nonché bioenergetiche mitocondriali. Alcune delle attuali limitazioni del protocollo sono discusse, così come nuovi sviluppi che sono in corso per superarli e promuovere una comprensione quantitativa del ruolo della struttura cellulare di biologia dei sistemi cardiaco. Si rivolge anche come questi metodi potrebbero essere generalizzati per creare modelli ad elementi finiti di altri tipi cellulari.

Gli utenti del presente protocollo possono saltare la fase 1 e la parte di ricostruzione del passaggio 2 se hanno accesso a una serie di immagini di microscopia elettronica pre-esistenti. Gli utenti che intendono acquisire i loro dati in collaborazione con più esperti microscopisti dell'elettrone potrebbero desiderare discutere e confrontare la fissazione e colorazione procedure nel passaggio 1 con l'esperto per determinare un protocollo ottimale per l'acquisizione.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dall'Università di Auckland animale comitato etico Comitato uso, dove è stato originariamente sviluppato il protocollo di tessuto e University of California San Diego istituzionali cura degli animali.

1. preparazione sperimentale

  1. Preparare soluzioni di riserva di sodio 0,15 M e 0,3 M cacodylate buffer a pH 7.4 secondo la tabella 1.
  2. Preparare il fissativo di glutaraldeide (glutaraldeide 2,5% + 2% paraformaldeide (PFA) + acido tannico 0,2% in tampone di cacodilato di sodio 0,15 M a pH 7.4) utilizzando componenti elencati nella tabella 1.
    1. Sciogliere 2 g di polvere PFA in 20 mL di acqua distillata a 60 ° C su una piastra riscaldante con agitazione costante.
    2. Aggiungere la soluzione di NaOH 1 M fino a quando la soluzione è limpida.
    3. Attendere che la temperatura della soluzione è inferiore a 40 ° C, quindi aggiungere 10 mL di glutaraldeide e 20 mL di 0,3 M sodio cacodilato.
    4. Aggiungere 0,2 g di acido tannico e scioglierlo nella soluzione.
    5. Aggiungere 50 mL di 0.15 M sodio cacodilato.
    6. Negozio tre o quattro flaconcini di scintillazione 20 mL di fissativo in frigorifero a 4 ° C, o il ghiaccio se utilizzati nello stesso giorno.
  3. Preparare la soluzione di Tyrode con 20 mM 2,3-butanedione monoxime (BDM), secondo la ricetta in tabella 1.
  4. Costruire un apparato di Langendorff all'interno di una cappa.
    1. Fissare due provette di siringa in plastica 100 mL a due differenti storta stand, circa 70 cm di altezza dalla base del supporto.
    2. Collegare i tubi di plastica siringa e un tubo connettore utilizzando 3 mm di diametro interno della tubazione e un rubinetto a tre vie come illustrato nella Figura 1.
    3. Inserire una cannula di diametro esterno di 3 mm verso il basso del connettore della tubazione, dove il cuore sarà legato per la fissazione di aspersione.
  5. Riempire i tubi siringa con soluzione di Tyrode e fissativi soluzioni a 37 ° C.
    1. Rimuovere le bolle d'aria all'interno della tubazione passando le soluzioni siringa attraverso di loro.

2. acquisire dati di microscopia elettronica dell'ultrastruttura dei cardiomiociti

  1. Preparare l'animale per l'asportazione e la fissazione chimica del cuore.
    Nota: Questo protocollo descritti i passaggi per elaborare adulto maschio tessuto cardiaco di Wistar (nome per una specifica razza di ratto dell'albino) del ratto. Il protocollo può richiedere modifiche quando il tessuto cardiaco è di provenienza da altre specie.
    1. Anestetizzare l'animale trattando il ratto (200-250 g di peso corporeo) con 0,5 mL di eparina di U/mL 250 tramite l'iniezione intraperitoneale. Attendere 10 minuti, poi trattare il topo con l'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (210 mg/kg di peso corporeo).
    2. Confermare un adeguato grado di anestesia testando il riflesso di pizzico di punta.
    3. Eutanasia animale di dislocazione cervicale.
    4. Raccolto il cuore utilizzando procedure di dissezione simili agli articoli precedentemente pubblicati di Giove22,23, poi metterlo in soluzione salina ghiacciata.
    5. Isolare l'aorta ascendente e incannulare. Assicurarsi che la punta della cannula si trova appena sopra la valvola semilunare, dove si diramano le arterie coronarie. Legare un filo strettamente intorno all'aorta ascendente.
    6. Collegare la cannula per l'apparato di Langendorff gravità operato a ~ 70 cm sopra la base del sistema (Figura 1).
    7. Ruotare il rubinetto sul sistema Langendorff per irrorare il cuore con soluzione di Tyrode, tra cui 20 mM BDM (un inibitore di miosina) per 2-3 min.
    8. Ruotare il rubinetto per iniziare l'aspersione con fissativo del paraformaldeide al 2%, 2,5% glutaraldeide e acido tannico 0,2% a 0,15 M sodio cacodilato a 37 ° C per 10 min. In caso di successo, il cuore sarà girare il colore marrone chiaro e diventano duri e gommosi.
    9. Utilizzando una lama di rasoio, sezionare i blocchi di tessuto da parete libera (laterale) ventricolare sinistra e ottenere tessuto blocca circa 1 mm3 dimensioni.
    10. Conservare i campioni in flaconi di scintillazione pre-raffreddata 20 mL di fissativo stesso sul ghiaccio per 2 h. conservare i campioni come molti possibili nelle fiale e assicurano che i campioni sono immersa nella soluzione.
      Attenzione: È importante mantenere i campioni freddo fino a dopo il passaggio di disidratazione 100% qui sotto.
  2. Ulteriore la fissazione e colorazione dei campioni per microscopia elettronica.
    1. Versare 100 mL di tampone di cacodilato di sodio 0,15 M in un becher di vetro e raffreddarlo sul ghiaccio.
    2. Preparare volumi uguali di 4% tetrossido di osmio e 0,3 M sodio cacodilato, seguita dall'aggiunta di 0,08 g di ferrocianuro di potassio per ottenere una soluzione di macchia di metalli pesanti che contiene ferrocianuro di potassio 2% a 2% tetrossido di osmio e 0,15 M sodio cacodilato. Raffreddare la soluzione sul ghiaccio.
    3. Pipettare il fissativo fuori e sostituirlo con abbastanza freddo buffer di cacodilato di sodio 0,15 M per immergere i campioni nelle fiale. Posizionare le fiale in ghiaccio per 5 min.
    4. Ripetere il passaggio 2.2.3 altre quattro volte con 0,15 M sodio cacodilato per rimuovere l'eccesso fissativo.
      Attenzione: Non utilizzare pipette in vetro perché minuscoli frammenti possono entrare nel campione e possono rovinare coltelli diamante durante il sezionamento blocco di tessuto. È importante per pre-raffreddare tutte le soluzioni sul ghiaccio prima di aggiungerli al campione. È anche importante che il campione rimane coperto dalla soluzione di tutti i tempi (molto brevi periodi di parziale copertura dura non più di pochi secondi possono essere tollerati brevemente durante gli scambi di soluzione). Quando la pulizia o la sostituzione di soluzioni, aggiunge la nuova soluzione rapidamente dopo la rimozione della soluzione precedente. Conservare i flaconcini di scintillazione su ghiaccio tra i lavaggi. Si noti che questo passaggio non è il momento sensibile, i blocchi di tessuto possono essere lavati leggermente più lunghi, se necessario.
    5. Sostituire il tampone cacodilato di sodio con soluzione macchia ghiacciata heavy metal e memorizzarlo sul ghiaccio durante la notte. Assicurarsi che il ferrocianuro è mescolato accuratamente agitando il flacone a mano; la soluzione deve essere nera.
      Attenzione: Lavorare nella cappa quando si esegue questo passaggio perché osmio è tossico.
    6. Diluire la soluzione stock acetato (UA) uranile acquosa al 4% (tabella 1) al 2% con volumi uguali di Stock in soluzione UA e doppia acqua distillata e raffreddarlo sul ghiaccio.
    7. Sostituire il metallo pesante macchia con raffreddato a ghiaccio tampone cacodilato di sodio 0,15 M e lasciare che il campione Incubare per 5 minuti sul ghiaccio.
    8. Ripetere il passaggio 2.2.7 quattro volte di più sul ghiaccio per togliersi qualsiasi soluzione di macchia di metalli pesanti in eccesso.
    9. Sciacquare i campioni quattro volte, con un periodo di attesa di 2 min in mezzo in acqua purificata (bidistillata è sufficiente).
    10. Sostituire l'acqua purificata con gelido 2% UA e lasciare che il campione Incubare per 60-120 min sul ghiaccio.
    11. Raffreddare con cinque flaconi di scintillazione 20 mL di etanolo (abbastanza per sommergere campioni) sul ghiaccio che verrà utilizzato nella fase di disidratazione. Sei flaconi hanno percentuali crescenti di etanolo in acqua distillata: 20%, 50%, 70%, 90% e 100%.
    12. Versare acetone puro in un altro flaconcino da 20 mL scintillazione e fresco su ghiaccio con le fiale di etanolo.
    13. Sciacquare i campioni in acqua purificata quattro volte con periodi di attesa di 2 minuti sul ghiaccio per lavare UA in eccesso.
  3. Disidratare i campioni in etanolo.
    1. Disidratare in serie di etanolo freddo sostituendo successivamente soluzione entro la fiala del campione come segue, sul ghiaccio: etanolo al 20% per 10 min; etanolo al 50% per 10 min; etanolo al 70% per 10 min; etanolo al 90% per 10 min; poi due volte in etanolo 100% per 10 min.
    2. Campione alla temperatura di transizione sostituendo l'etanolo 100% finale con acetone puro raffreddato e posizionare la fiala del campione su un banco di laboratorio di temperatura ambiente per 10 min.
    3. Eseguire un lavaggio più di 10 min in acetone puro a temperatura ambiente per rimuovere la condensa che è osservabile all'interno le fiale. Durante l'incubazione, costituiscono le soluzioni di acetone/resina.
    4. Sostituire l'acetone puro nelle fiale con acetone e resina epossidica resina pura 50: 50 (con proporzioni per componenti di resina epossidica come dichiarato dal costruttore). Utilizzare tutti i componenti dello stesso lotto. Lasciare i flaconi riempiti di resina campione durante la notte su un rotore.
  4. Incorporare i campioni in resina.
    1. Sostituire il 50: 50 resina con resina 75% (25% di acetone) e incubare per 3 ore, seguita da ulteriore incubazione/infiltrazione in resina 100% per 4 h a temperatura ambiente.
    2. Sostituire la resina 100% con resina 100% fresca e lasciare le fiale del campione durante la notte per la più profonda penetrazione della resina in campioni di tessuto.
    3. Prendere campioni fuori le fiale e metterli in contenitori che sono forno-friendly e hanno una base piatta; alluminio o stagnola d'argento pirottini può essere utilizzata per questo scopo, ad esempio.
    4. Versare delicatamente (per evitare lo spostamento dei campioni) fresco resina sopra i campioni (campioni così l'incorporamento in resina) e polimerizzare la resina e gli esempi in un forno a 60 ° C per 48 h.
  5. Ri-orientare blocchi in resina per celle di immagine in sezione trasversale.
    1. Ottenere 1 µm spessore prova sezioni dai blocchi di resina utilizzando un ultramicrotomo con un coltello di vetro per valutare la cella orientamento24.
    2. Macchia le sezioni spesse prova per 20 s con 1% toluene blu e 1% borace.
    3. Esaminare l'orientamento delle cellule muscolari con un microscopio a campo chiaro.
    4. Base all'orientamento dedotto dalle immagini delle sezioni macchiate prova, ri-orientare longitudinalmente o obliquamente orientato (simile alla Figura 2A) blocchi per garantire che le cellule sono esposte per il coltello di vetro affinché essi sarà tagliati in sezione trasversale (in resina simile a Figura 2B).
  6. Sezioni di tessuto di immagine usando la tomografia dell'elettrone.
    1. Ottenere sezioni semi-sottile (~ 300 nm) del tessuto riorientato blocchi usando un diamante coltello e trasferire le sezioni sul rame griglie25.
    2. Macchia le sezioni spesse con 2% UA e Sato piombo25.
    3. Applicare particelle di oro colloidale su entrambi i lati delle sezioni25.
    4. Ottenere il set di singolo o doppio asse inclinazione serie delle immagini proiettate da-70 ° a + 70 °25.
  7. Utilizzare IMOD20 per ricostruire la serie di immagini 3D (una serie di immagini 2D che forniscono le informazioni 3D di una sezione di tomografia del singolo elettrone) della cella. Questo stack ricostruito verrà segmentato nel passaggio successivo.

3. segmento miofibrille e mitocondri regioni del DataSet di immagini 3D di EM

  1. Eseguire il programma IMOD "3dmod".
  2. All'interno dell'interfaccia di utente grafica 3dmod, immettere l'indirizzo dei. "REC" o ".mrc" file che contiene il 3D ricostruito immagine dataset della cella (generato nel passaggio 2.7) nella casella di immissione con l'etichetta "file di immagine:", quindi premere "OK".
  3. Sotto il menu "File", selezionare il nuovo modello, quindi salvare il file con un nome appropriato utilizzando il "Salva modello"... voce di menu "File".
    Nota: Un oggetto in IMOD può contenere un insieme di componenti segmentati che costituiscono il "oggetto". Per impostazione predefinita, un nuovo modello contiene un nuovo oggetto con l'id "#1".
  4. Sotto il menu "Speciale", selezionare "Strumenti di disegno". Verrà aperta una nuova barra degli strumenti simile a quella mostrata in Figura 3A.
    Nota: Esistono diversi strumenti che possono essere utilizzati per creare contorni intorno i confini di diversi organelli. Ulteriori informazioni sui modi di utilizzare questi strumenti si trovano nella documentazione IMOD20 .
  5. Scegliere l'opzione "Sculpt" nel menu "Strumenti di disegno" e spostare il mouse sopra alla finestra immagine; apparirà un contorno circolare centrato sul puntatore del mouse.
  6. Tenendo premuto il pulsante centrale del mouse sopra un mitocondrio (le regioni più scure dei file immagine, come illustrato da delimitazioni con linee di contorno verde nella Figura 3A), trascinare il perimetro del contorno cerchio la forma dei suoi limiti.
  7. Una volta completata la contornatura del confine mitocondrio, rilasciare il pulsante centrale e ripetere i passaggi 3.6 per ogni mitocondrio nei dati. Ogni contorno sarà automaticamente riconosciuto da IMOD come un nuovo profilo all'interno dell'oggetto stesso.
  8. Sotto il "Edit | Oggetto "dal menu, selezionare"Nuovo"per creare un nuovo oggetto. Verrà automaticamente aumentare il numero totale di oggetti da uno e assegnare questo numero al nuovo oggetto.
  9. Ripetere i passaggi da 3.6 e 3.7 per segmentare e salvare miofibrilla contorni.
  10. Ripetere il punto 3.8, seguita da passo 3.6, per segmentare il bordo della cella.
  11. Salvare il file di modello sotto il menu "File".
  12. Eseguire i seguenti comandi in una finestra della riga di comando per convertire ogni oggetto in una maschera di binaria di raggruppamento come illustrato nella Figura 4A-C.
    1. Estrarre un oggetto specifico dal modello "imodextract oggetto modelfile outputmodelfile" dove "oggetto" è il numero dell'oggetto da estrarre.
    2. Creare una maschera per quell'oggetto: imodmop-maschera 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. Convertire il file in una pila di tif: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. creare una Mesh di elementi finiti dai componenti segmentati

  1. Iso2mesh è un programma MATLAB liberamente disponibile per convertire pile di immagine TIFF in mesh di elementi finiti tetraedrici volumetrica. Scaricare e aggiungere iso2mesh al percorso MATLAB da iso2mesh.sourceforge.net.
  2. Scaricare i codici sorgente e dati per simulare i cluster di RyR sulla mesh dal https://github.com/CellSMB/RyR-simulator sito Web github.
  3. Avviare l'applicazione CardiacCellMeshGenerator MATLAB (Figura 5).
  4. Caricare le maschere di componente di diversi organelli in MATLAB tramite i tre pulsanti sul lato superiore sinistro della GUI.
  5. Creare un altro stack di immagine binaria che delimita le lacune tra le miofibrille e mitocondri come mostrato in Figura 6A.
    1. Aprire ImageJ.
    2. Utilizzando il File | Aprire la finestra di dialogo, caricare le pile tiff miofibrille e mitocondri nel programma.
    3. Avviare il plugin di aggiunta immagine selezionando "processo | Calculator Plus ".
    4. Selezionare la serie di immagini di miofibrilla come i1, i mitocondri immagine stack come i2 e scegliere l'operatore "Add". Fare clic su "OK".
    5. Dopo un nuovo stack di immagine che rappresenta il risultato di 4.5.4 viene visualizzata, selezionare "Edit | Inverti"per produrre una serie di immagini simile alla Figura 6A.
  6. Caricare il file contenente lo stack di immagine binaria dei divari tra le miofibrille e mitocondri premendo il pulsante "RyRGapsFile" sul programma CardiacCellMeshGenerator.
  7. Spingere "Generare Mesh" sulla GUI. Ciò attiverà il v2m di comando iso2mesh con l'opzione 'cgalmesh' per generare una mesh tetraedrica simile a Figura 4E. Tre file sarà emesso alla fine di questo passaggio: un file di .ele, un file 48x48 e un file .node che conterrà l'elenco di nodi che costituiscono gli elementi, i nodi che compongono i volti e le coordinate dei nodi , rispettivamente.

5. matematicamente mappa la densità spazialmente variabile dei canali ionici di interesse sulla maglia di elementi finiti.

  1. Generare gli input necessari per il simulatore di RyR premendo il pulsante etichettato ingressi di generare RyR-simulatore sulla GUI.
    Nota: Il pulsante si innescherà una funzione generateRyRsimulatorInputs.m, che utilizza le seguenti informazioni dal passaggio 4 per generare gli ingressi:
    (1) outDir: il percorso al file di output che sono necessari per la simulazione di cluster di RyR.
    (2) imres: la risoluzione in pixel nelle tre direzioni degli stack di immagine.
    (3) myofibril_file: il file contenente lo stack di immagine binaria come quella mostrata nella Figura 4B.
    (4) sarcolemma_file: il file contenente lo stack di immagine binaria come quella mostrata nella Figura 4A.
    (5) ryrgaps_file: il file contenente lo stack di immagine binaria come quella mostrata nella Figura 5A.
    1. Dopo questa funzione viene eseguita, controllare che i seguenti file sono stati creati all'interno della directory specificata come percorso outDir:
    • d_axial_micron.txt, che rappresenta la distanza assiale tra la posizione del z-disco e il resto dei pixel nello stack di immagine.
    • d_radial_micron.txt, che rappresenta la distanza euclidea (escluse la componente assiale) da ciascun pixel nell'insieme delle possibili sedi di cluster di RyR ai pixel sul piano z-disco.
    • W_micron.txt, che rappresenta l'elenco delle coordinate spaziali di tutte le posizioni disponibili per cluster di RyR per essere presenti.
    • I restanti 3 file nella cartella contengono il suffisso "_pixel" piuttosto che "_micron" per indicare che i valori all'interno di questi file sono stati scritti in forma coordinata di pixel.
  2. Simulare distribuzioni di cluster di RyR nello stack di immagine binaria di miofibrille.
    1. Premere il pulsante etichettato "Open RyR-simulator in R" per avviare il programma di R.
    2. Sulla R-gui, selezionare "File | Open"e trovare il file"impostazioni. R"all'interno del pacchetto di RyR-Simulator (RyR-simulatore/origine/impostazioni. R).
    3. Anche aprire il file ryr-simulatore-parallelo. R (che si trova in RyR-simulatore/origine/ryr-simulatore-parallelo. R). ambienti come Rstudio (https://www.rstudio.com) o una semplice interfaccia a riga di comando può essere utilizzata, ad esempio utilizzando il comando R64 in una finestra di shell o di comando.
    4. Modificare i parametri nelle impostazioni. File R come dettagliato qui sotto:
      1. Impostare l'indirizzo della cartella che contiene i file elencati in 5.1.2 per una serie di immagini confocal sperimentalmente acquisito dei cluster di RyR e miofibrille Path2.
        Nota: Il github repository cartella input-file/master cella / contiene già i file che sono stati generati per una serie di immagini raccolte in precedenza.
      2. Impostare Path4 su un indirizzo della cartella dove vengono memorizzati i file che sono stati generati nel passaggio 5.1.2.
      3. Impostare punto di Path3 in una cartella dove l'utente vuole che le posizioni di cluster di RyR simulate per essere salvati.
      4. Insieme N per il numero di cluster di RyR per essere simulate nel modello (in genere nell'intervallo di 200-300).
      5. Impostare etol, una tolleranza che fissa, per la differenza tra la distribuzione spaziale misurata sperimentalmente di RyR cluster e la distribuzione spaziale del modello simulato di cluster di RyR.
      6. Impostare numIter per limitare il numero di tentativi che il simulatore di RyR dovrebbe prendere per trovare un modello di cluster di RyR simulato che soddisfa il valore etol.
        Nota: I valori per etol e numIter impostati ai valori tipici all'interno delle impostazioni. File R.
      7. Impostare numPatterns sul numero di diversi modelli di cluster di RyR che l'utente vuole simulare (in genere, è utile pratica simulando 99 pattern per confidenza statistica).
      8. Impostare numCores per consentire l'utilizzo di più thread della CPU (Core) per l'elaborazione con R per simulare i modelli punto parallela più veloce.
    5. Verificare che i seguenti pacchetti sono installati utilizzando il pacchetto di installazione gui in r: neve, doSNOW, doparallel, foreach, iteratori e rgl.
    6. Eseguire il simulatore inserendo il seguente comando nella finestra di comando R: origine (' percorso di ryr-simulatore-parallelo. R', chdir = TRUE)
      Nota: L'output del programma RyR-Simulator è un elenco di file. txt (verrà generato un file di numPatterns) che contengono gli elenchi delle coordinate in N righe e 3 colonne, che rappresentano la x, y e le coordinate z della N simulato cluster di RyR.
  3. Mappa luoghi come densità spaziale su un modello computazionale utilizzando il CardiacCellMeshGenerator.
    1. Selezionando il pulsante etichettato "Selezionare RyR punti file", scegliere un file di testo di RyR cluster distribuzione simulato da quelli che sono stati di uscita dal RyR-simulatore.
    2. Eseguire "RyR densità Mapper" sulla GUI in MATLAB. Questo mapperà le posizioni spaziali dei glomeruli di RyR simulati nel file txt nel passaggio 5.3.1 sulla maglia di elementi finiti che è stata generata nel passaggio 4.8 utilizzando un metodo chiamato un kernel sferica intensità stimatore metodo26.
      Nota: L'output di questo passaggio è un file con estensione txt che contiene un elenco di valori per la densità numerica del canale ionico per unità di volume sferico a ciascuno dei nodi della mesh computazionale.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figura 2 e Figura 7 fornire risultati rappresentativi di diversi passaggi chiave in questo protocollo: (i) visualizzare e riorientare i blocchi di tessuto per le viste di sezione trasversale di microscopia elettronica; (ii) generando una serie di immagini di microscopia 3D; (iii) segmentazione ultrastruttura sub-cellulare per organelli di interesse; (iv) generazione di una mesh di elementi finiti utilizzando iso2mesh; (v) che sim...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo di cui sopra illustra passaggi chiave per generare un modello geometrico del romanzo agli elementi finiti di ultrastruttura dei cardiomiociti. Il metodo consente modalità di fusione computazionale di microscopia diversa (o, in linea di principio, altri dati) sviluppare un modello computazionale più completo della dinamica dei cardiomiociti che include dettagli di architettura spaziale delle cellule. Non esiste attualmente nessun altro protocollo disponibile per creare un modello di un cardiomyocyte.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dalla Royal Society della Nuova Zelanda Marsden veloce avviare Grant 11-UOA-184, il Human Frontiers Science programma Research grant RGP0027/2013 e australiano di ricerca Consiglio Discovery Project Grant DP170101358.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiali
Cloruro di sodioSigma-Aldrich746398
Cloruro di calcioSigma-AldrichC8106
Cloruro di magnesioSigma-AldrichM2393
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761
Cloruro dipotassioSigma-AldrichP5405
DestrosioSigma-AldrichD9434
Idrossido di sodioSigma-AldrichS8045
ProbenecidSigma-AldrichP8761
2,3-butandione monoximeSigma-AldrichB0753
25% Glutaraldeide EM Grade (flacone da 500 ml)Merck354400-500ML
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148
Acido tannicoSigma-Aldrich403040-500G100g
Cacodilato di sodioSigma-AldrichC0250
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4593
Tetrossido di osmioSigma-Aldrich75632-10ML4% in acqua, flacone da 5 ml (o flacone da 10 ml
Acetato di uranileEM Sciences22400Flacone da 25 g
Ferrocianuro di potassioMerck Millipore104973
blu di tolueneSigma-AldrichT3260
BoraceSigma-AldrichS9640chiamato anche borato di sodio
EtanoloSigma-Aldrich792780Diluito a diverse percentuali con acqua pura
AcetoneEM SciencesRT10017
Kit di resinaEM Sciences14040ACM Durcupan funziona bene
Acido cloridricoSigma-AldrichH98921Soluzione normale
Attrezzatura
UltramicrotomoLeicaEM UC7
Elettrone di trasmissione microscopioThermoFisher ScientificTecnai F30http://www.leica-microsystems.com/
Supporto per stortaProscitechT752
TuboBioStrategy75831-346per apparecchio di perfusione di Langendorff, diametro di 3 mm è consigliato ma non indispensabile
RubinettiSDRQP13813per tubi di Langendorff; il prodotto è solo un esempio, l'utente può selezionare qualsiasi
per stortaProscitechT715
Siringhe in plasticaSDRQPC1108per soluzioni su apparecchio langendorff
Incannulamento sutura in seta, 7-0TeleFlex15B051000per legare il cuore su apparecchio langedorff
CannulaRealizzato con ago in acciaio di diametro esterno di 3 mm Tappetino
piastre di Petri in gommaProscitechH068per l'uso come tagliere durante la dissezione a cuore fisso
Lame di rasoioProscitechL056per il taglio di prodotti a cuore fisso in piccoli blocchi per la lavorazione EM
Bottiglie di vetroBioStrategy89000-236per la conservazione di soluzioni durante la fissazione e la lavorazione dei tessuti per
becherBioStrategy213-0477per la conservazione temporanea e durante la perfusione
di soluzioniFiale a scintillazioneBioStrategy548-2170per campioni di tessuto durante l'elaborazione EM
Kit di dissezioneProscitechT161per la dissezione animale
Filtri per siringheProscitechWS3-02225Sper la purificazione dell'acetato di uranile
forno in alluminio/foglio d'argentoDa qualsiasi negozio di prodotti da forno
Coltellodiamantato DupontLa versione con102680-780produce le sezioni migliori.
Oro colloidaleBBI SolutionsEM. GC1515 nm oro colloidale
EM griglie a reteProscitechGCU150è possibile testare una varietà di dimensioni: GCU150h, GCU200h per esempio
Pippettes per lo smaltimento della plasticaProscitechLCH20è il migliore per utilizzare materiali monouso in plastica, soprattutto quando si lavora con la resina
Software
SerialEMUniversità di Boulderacquisizione della tomografia
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMODUniversity of Boulderimage alignment and segmentation
iso2meshdisponibile presso http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji o software di elaborazione delle immagini simileImageJFiji is Just Image Jdisponibile presso https://fiji.sc per la manipolazione di immagini binarie stack
RyR-Simulator codici/datiCellSMBdisponibile all'indirizzo
https://github.com/CellSMB/RyR-simulator CardiacCellMeshGeneratorIl gruppoviene fornito con RyR-Simulator nella cartella "gui-version"Software
di statisticaR R-projectScarica da https://www.r-project.org
spatstatR-projectinstallare tramite il programma R
rglR-projectinstallare tramite il programma R
doparallelR-projectinstallare tramite il programma R
foreachR-projectinstallare tramite il programma
R doSNOWR-projectinstallare tramite
gli iteratoriprogettoR tramite il programma R
di grado EM morsetti per EM Tazze da angolo di 35 gradi BioStrategy Gruppo CellSMB del programma R Installare il

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