Articolo metodologico

Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D

DOI:

10.3791/56832

⸱

18 gennaio 2018

 ,  , 
1Department of Dermatology, University of California Davis School of Medicine, University of California, Davis, 2Center for Biophotonics, Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

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Fabbriche di transcriptional virali sono strutture discrete che sono arricchiti con cellulare RNA polimerasi II per aumentare la trascrizione genica virale durante la riattivazione. Qui, è descritto un metodo per individuare i siti di trascrivere attivamente della cromatina virale nello spazio 3D nucleare da una combinazione di ibridazione di RNA immunofluorescenza colorazione ed in situ .

Abstract

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È noto che la regolazione spaziale e temporale dei geni è parte integrante di che regolano l'espressione genica corretto. Di conseguenza, è prezioso per comprendere dove e quando trascrizione avviene all'interno dello spazio nucleare e per visualizzare la relazione tra episomi infettata all'interno del nucleo della cellula stessa. Qui, l'immunofluorescenza (IFA) e RNA-pesce sono stati combinedto identificare attivamente trascrivere episomi herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV). Dalla macchiatura antigene nucleare associato latenza KSHV (LANA), è possibile individuare dove episomi virali esistano all'interno del nucleo. Inoltre, progettando sonde di RNA-pesce di destinazione della regione di introne di un gene virale, che è espressa solo durante l'infezione produttiva, nascente trascrizioni del RNA possono essere situate. Utilizzando questa combinazione di sonde molecolari, è possibile visualizzare l'assemblaggio di fabbriche di grande trascrizione virale e analizzare il regolamento spaziale dell'espressione genica virale durante la riattivazione di KSHV. Includendo la macchiatura dell'anticorpo di anti-RNA polimerasi II, si può anche visualizzare l'associazione fra l'aggregazione di RNA polimerasi II (RNAPII) e la trascrizione di KSHV durante la riattivazione.

Introduzione

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È diventato sempre più chiaro che l'organizzazione spazio-temporale del nucleo svolge un ruolo importante nella modulazione della espressione genica finemente sintonizzato negli eucarioti. Maggior parte dei geni specifici del tessuto sono distribuiti su molti cromosomi e devono essere disciplinati in modo sincrono al fine di rispondere a stimoli specifici in un modo coordinato1. Le cellule costruire mozzi di cromatina attiva (ACH) come un modo di riunire su un specifico spazio nucleare1geni e loro elementi cis-regolatori.

Inoltre è stato dimostrato da diversi studi che sebbene il nucleo sembra molto denso e viscoso, molecole biologicamente attive possono attraversare il nucleo piuttosto rapidamente tramite diffusione2. In conseguenza di questa struttura effimera, la maggior parte delle proteine che legano DNA 'saltare' da sito di associazione all'associazione sito, sentire loro modo intorno allo spazio nucleare, che permette per un nucleo altamente adattabile e versatile2.

Nonostante questo comportamento dinamico di biomolecole all'interno del nucleo, nucleare corpi senza membrane come (ma non limitato a) il nucleolo, i corpi di Cajal e corpi nucleari di promyelocytic leucemia (PML-NB) esistono ancora. È attraverso una varietà di meccanismi quali ripetizioni in tandem di DNA (nucleolo), rRNA (nucleolo) e proteine strutturali quali coilina (Cajal bodies) o PML proteine (PML-NB) che tengono questi costrutti insieme3,4,5 . Queste strutture e altre congregazioni come le fabbriche di trascrizione fungono da impalcature che non solo aumentano la concentrazione locale dei componenti richiesti, ma anche regolano la composizione di proteine ed acidi nucleici all'interno di essi, in definitiva, creare un sito centrale per efficienti funzioni cellulari6.

Visualizzare quando e dove il modulo di strutture nucleari fornisce una ricchezza di informazioni per i ricercatori che studiano l'epigenetica. Da una prospettiva di virologia, la riattivazione del virus latente infettati, come KSHV, altera significativamente il paesaggio del nucleo e la distribuzione di enzimi nucleari per spostare la trascrizione principalmente da geni cellulari a geni virali, in ultima analisi, per produzione di progenie virale completamente funzionale7,8. Come KSHV manipolare il macchinario di espressione di gene cellulare per facilitare l'espressione genica virale? Tali informazioni potrebbero anche far luce su meccanismi di regolazione genica cellulare temporale.

Come tutti gli altri virus erpetici, KSHV ha due cicli di vita chiamati latenza e replica litica. KSHV risiede principalmente nella fase di latenza, in cui la maggior parte del relativo gene virale espressione viene messo a tacere, tranne la latenza associata geni9,10. Durante la latenza che KSHV produce latenza associata antigene nucleare (LANA), che costitutivamente lega i genomi virali e attacchi virali della cromatina del cromosoma11. A causa della relazione intima di LANA con il genoma virale, è possibile utilizzare IFA e DAPI per macchiare ed individuare dove gli episomi virali erano in relazione la cromatina di host.

Per studiare la riattivazione di KSHV a livello di singolo episome e l'associazione con altri episomi virali in una cellula infetta, è stata stabilita una strategia per individuare attivamente trascrizione virale della cromatina in situ . Di conseguenza, sono stati combinati LANA e RNAPII IFA con introne RNA-pesce, generando sonde di RNA-FISH che si legano alla regione dell'introne (sonda esatta sequenze possono essere trovate in più recente pubblicazione8 del laboratorio Izumiya) di KSHV K-Rta-la proteina virale chiave che è essenziali e sufficienti per KSHV riattivazione-era possibile identificare dove trascrizione in realtà stava prendendo posto8,11,12,13,14,15 . Questa tecnica di RNA-pesce introne consente ai ricercatori di visualizzare dove mRNA è essere trascritte immediatamente prima di essere impiombato ed esportato in citoplasma16,17.

KSHV può essere riattivato da vari stimoli chimici tra cui esteri di phorbol come 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) e inibitori delle deacetilasi istoniche quale il butirrato di sodio, inoltre KSHV possono essere indotte a riattivare dall'iperespressione di il fattore di trascrizione virale, K-Rta19. I ricercatori hanno aumentato con successo l'efficienza della riattivazione di KSHV sincronizzando cicli della cella prima di indurre la riattivazione18. Così, per questi studi particolari, le cellule sono state sincronizzate utilizzando un blocco di doppia timidina (protocollo descritto di seguito) e incubati con TPA e doxiciclina (Dox) per un breve periodo. Doxycyline è stato utilizzato perché la linea cellulare utilizzata in questi esperimenti ha una cassetta di K-Rta doxiciclina-inducibile, che è stata clonata da cDNA e non include la regione di introne di K-Rta. Anche se è possibile riattivare KSHV utilizzando solo ha indotto l'espressione di K-Rta, è stato dimostrato da altri ricercatori che a causa di una varietà di differenti fattori biochimici espressione K-Rta da solo dimostra di essere un debole riattivazione stimoli20. Combinando tutte queste e limitando le incubazioni di droga per un breve periodo di tempo, una riattivazione di KSHV robusta ma non eccessivamente artificiale è stata realizzata per l'imaging.

Dopo l'etichettatura LANA, RNAPII, K-Rta introni e DNA come descritti in questa carta, fluorescenza 3D imaging è stata eseguita utilizzando un microscopio di deconvoluzione widefield. Dopo l'elaborazione con software di imaging, la distribuzione spaziale degli episomi virali attive possa essere valutata correttamente. Utilizzando questa tecnica, le questioni centrali per quanto riguarda la natura fondamentale della formazione della cromatina attiva mozzi e altre strutture nucleari possono essere studiate. Avendo identici episomi virali in una singola cella che elabora gli stessi elementi normativi può rappresentare uno strumento di ricerca unico per approfondire la comprensione dei meccanismi di regolazione genica spatiotemporal.

Una limitazione di imaging più campioni di cella fissati in diversi momenti per caratterizzare un processo intrinsecamente dinamico molecolare è che sottili o piccoli cambiamenti nella distribuzione di fluorescenza sono inosservati o ritenute insignificanti. Questo è vero a meno che nel caso raro, ogni cellula osservato Visualizza lo stesso cambiamento sottile. Così, il rapporto completo spatiotemporal di trascrizione virale attiva e altre strutture nucleari non può essere valutato criticamente usando la formazione immagine fissa. Per affrontare queste sfide tecniche, l'approccio migliore è di cellule vive di immagine che hanno segnato episomi virali e di seguire la posizione di enzimi cellulari chiave nel corso del tempo.

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Protocollo

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Attenzione: Linee cellulari utilizzati in questa procedura contengono virus infettivi, attenti e procedere solo in impianto di BSL di livello 2 o superiore.

1. preparazione e manutenzione delle cellule

  1. Coltura di cellule TREx-K-RTA BCBL-1 (o un altro KSHV infettato linee cellulari PEL) in RPMI1640 supplementato con 15% siero bovino fetale (FBS) e soluzione di 1% penicillina streptomicina glutamina.
  2. Crescere le cellule a 37 ° C con 5% di anidride carbonica (CO2), assicurandosi di crescere continuamente e per dividere le celle di un rapporto di 1:4 ogni 2 – 4 giorni.
  3. Monitorare le colture cellulari con un microscopio a luce ogni giorno per confermare la crescita delle cellule buone e morfologia, altrimenti che si consiglia di riavviare la coltura delle cellule o di regolare di conseguenza le condizioni di coltura delle cellule.

2. timidina sincronizzazione e induzione litica

  1. In un 10 cm di Petri, cellule di TREx-K-Rta BCBL-1 piastra in preparati media (1 x 106 cellule/2 mL di media)
  2. Aggiungere della timidina 200mm (concentrazione finale: 2 mM) al piatto, mescolare e incubare per 18 h.
  3. Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. lavare le cellule con sterile 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in media preparati al momento. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Risospendere in media preparati al momento.
  4. Permettono alle cellule di uscita S-fase per 8 h.
  5. Aggiungere della timidina (concentrazione finale: 2 mM), miscelare e incubare per 16 h.
  6. Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. lavare le cellule con sterile 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in media preparati al momento. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Risospendere in media preparati al momento.
  7. Per indurre la riattivazione virale, aggiungere 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, concentrazione finale 20 ng/mL) e doxiciclina (DOX, concentrazione finale 100 ng/mL) alla coltura delle cellule, miscelare e incubare per 4 h. Per linee cellulari senza una cassetta viscoelastica K-Rta, stimolare la riattivazione tramite TPA (concentrazione finale 20 ng/mL e sodio butirrato (1 mM)).
  8. Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. lavare le cellule con sterile 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in coltura completa. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Risospendere in terreni di coltura completo.
  9. Permettono alle cellule di crescere per 24 h.

3. fissazione e permeabilizzazione

Nota: Prima di procedere, verificare il fissaggio soluzione (3,7% formaldeide in PBS DEPC-trattati), dietil pirocarbonato-trattati soluzione tampone fosfato (DEPC-PBS), glicina DEPC PBS (concentrazione finale di glicina: 100 mM) e permeabilizzante soluzione (50% acetone, metanolo al 50%) sono preparati. In genere, ogni diapositiva richiederà almeno 0,5 milioni di cellule, moltiplicare se necessario e includono cellule supplementari per back up soprattutto se le cellule non sono sane.

  1. Raccogliere le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
  2. Centrifugare le cellule per 2 min a 200 x g. lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS sterile DEPC. Risospendere in 1,2 mL di PBS DEPC.
  3. Inserire il numero appropriato di vetrini coprioggetti (determinati dalla configurazione sperimentale) il fondo di una piastra a 6 pozzetti.
  4. Dispensare 200 µ l della cella composto di DEPC PBS su ogni vetrino coprioggetti, affinché siano di almeno 0,5 milioni di cellule su ogni diapositiva. Permettono alle cellule di stabilirsi per 2 min e aspirare l'eccesso di PBS DEPC lasciando solo un sottile strato di cellule. È normale per le celle da rimuovere in questo processo.
    Attenzione: PFA è tossico, indossare una protezione appropriata.
  5. Con cura e aggiungere 1 mL di soluzione (3,7% formaldeide in PBS DEPC) per ogni vetrino coprioggetto di fissaggio. Permettono alle cellule di difficoltà per 10 min.
  6. Vetrini coprioggetto lavare 3 volte con PBS DEPC.
  7. Con attenzione aggiungere 1 mL di PBS di DEPC la glicina (concentrazione finale di glicina: 100 mM) per ogni vetrino coprioggetto. Permettono alle cellule di placare per 5 min.
  8. Aggiungere 1,5 mL di PBS DEPC e sia posto su un agitatore per 5 min o agitare con decisione ma delicatamente in mano per 1 min. aspirato il DEPC l'eccesso di PBS. Fare attenzione a non frantumare le cellule. Ripetere questo passaggio per un totale di 3 lavaggi.
  9. Attentamente e aggiungere 1 mL di soluzione (50% di acetone, metanolo al 50%) per ciascun vetrino coprioggetto di permeabilizing. Permettono alle cellule di permeabilize per 15 min.
    Nota: A questo punto, le lamelle possono essere memorizzate in un congelatore a-20 ° C per non più di una settimana. Evitare il congelamento o ridurre al minimo il tempo trascorso nel congelatore come qualità dell'immagine può degradare rapidamente. Assicurarsi che quando nel freezer che le cellule rimangono bagnati e coperto in metanolo/acetone e per garantire che essi reidratare correttamente con DEPC PBS dopo la rimozione dal freezer.
  10. Aggiungere 1,5 mL di PBS DEPC e sia posto su un agitatore per 5 min o scuotete con decisione ma delicatamente in mano per 1 min. aspirare il PBS DEPC in eccesso, fare attenzione a non frantumare le cellule. Ripetere questo passaggio per un totale di 3 lavaggi.

4. IFA e RNA-pesce

Nota: Per quanto riguarda etichettatura sonda RNA pesce e preparazione: per il K-Rta introne che è 959 paia di basi, 31 diverse sonde sono stati generati che 20 coppie di basi ciascuno, contenente un GC si accontentavano di circa il 50%. Soluzioni stock e funzionamento delle sonde sono stati aliquotati in 100 µM e 2,5 µM concentrazioni, rispettivamente.

  1. Vetrini da microscopio etichetta con informazioni sperimentali necessarie o una sorta di etichetta distinguibile.
  2. Linea di fondo di un contenitore di plastica sigillabile con un tovagliolo di carta umida.
  3. Preparare la soluzione di anticorpo primario (1,5 µ l di anticorpo di LANA, 0,75 µ l di anticorpo RNA Pol II, 3 µ l di baker lievito tRNA, PBS DEPC fino a 30 µ l) e moltiplicare la ricetta per ogni vetrino coprioggetti presenti. Posto 30 µ l di soluzione di anticorpo primario su ogni vetrino da microscopio con etichetta.
    1. Titolo l'anticorpo primario di interesse prima e utilizzare la quantità ottimale. Assicurarsi di utilizzare IgG purificata, come siero (liquido ascitico) può contenere grandi quantità di RNAsi.
  4. Posizionare il vetrino coprioggetti (cellule rivolto verso la soluzione) sui vetrini al microscopio con etichetta e spostare le diapositive nel contenitore con il tovagliolo di carta umida. Fare attenzione a non introdurre bolle. Coprire l'esterno del contenitore con involucro di plastica. Spostare il contenitore in un incubatore impostato a 37 ° C per 1 h.
  5. Preparare un tampone di lavaggio di pesce (2 x salina sodio citrato buffer (SSC) (finale), 10% formammide, 90% DEPC dH2O).
  6. Preparare il tampone di ibridazione: 2x (4 x SSC, 20% solfato di destrano).
  7. Preparare il pesce introne sonda buffer e un anticorpo secondario (20 µ l di tampone di ibridazione (finale 1 x Hyb Buffer): 2x, 4 µ l di lievito tRNA (finale 10%), 4 µ l di formamide (finale 10%), sonda introne K-Rta (finale 125 nM), 0,8 µ g di anticorpo secondario, DEPC dH2 O fino a 40 µ l). Moltiplicare la ricetta per ogni diapositiva necessario.
  8. Dopo l'incubazione, lavare le cellule 3 volte con PBS DEPC in un piatto ben 6 per 5 minuti ciascuno.
  9. Lavare con tampone di lavaggio di pesce 3 volte per 5 minuti ciascuno. Tenere vetrino coprioggetti in pesce-wash buffer sino a fine preparazione miscela in secondo luogo anticorpo e introne sonda (punto 4.7).
  10. Diapositive di vetro pulito usati per incubazione dell'anticorpo primario per l'ibridazione.
  11. Posto 40 µ l dell'anticorpo secondario e pesce introne sonda contenente soluzione su ogni lastra di vetro.
  12. Collocare i coprioggetti con le cellule sui vetrini con il lato di cella rivolto verso il basso in cima il buffer, fare attenzione a non introdurre bolle.
  13. Porre i vetrini in un contenitore di plastica con un fazzoletto di carta umido sul fondo. Avvolgere il contenitore di plastica in involucro di plastica prima e poi il foglio di alluminio.
  14. Incubare il contenitore con le diapositive a 37 ° C per 16-24 h.
  15. Dopo l'incubazione, estrarre delicatamente il vetrino coprioggetto dal bordo del vetrino e rimettere in 6 piastre a pozzetti rivolto verso l'alto e lavare le cellule con tampone di pesce-lavaggio 3 volte in un piatto ben 6 per 5 minuti ciascuno.
  16. Lavare le cellule 2 volte con 2 x SSC.
  17. Aggiungere DAPI (1:1, 000) nei 2 x SSC e lasciar per riposare per 5 min a temperatura ambiente.
  18. Lavare le cellule 2 volte con 2 x SSC.
  19. Pulire le diapositive di vetro usate per l'ibridazione e aggiungere 10 µ l di soluzione sui vetrini di montaggio.
  20. Posizionare il coprioggetti capovolto sulla soluzione di montaggio. Fare attenzione a non introdurre bolle.
  21. Con un tessuto di laboratorio, rimuovere delicatamente la soluzione di montaggio in eccesso, facendo attenzione a non schiacciare le cellule.
  22. Utilizzare smalto per unghie, applicare uno strato abbondante intorno al bordo delle lamelle e lasciare per asciugare.
  23. Procedere per eseguire microscopia di fluorescenza.

5. microscopia a fluorescenza 3D

Nota: Mentre protocolli variano con il tipo di sistema di microscopio di fluorescenza utilizzato, la procedura seguente contribuirà a garantire l'acquisizione di dati di immagine ottimale per l'analisi quantitativa.

  1. Pretrattare i campioni fissati e montare in media anti-dissolvenza per ritardare la fluorescenza photobleaching durante la formazione immagine.
  2. Utilizzare un obiettivo di alta qualità (ad esempio una lente immersione in olio di 60 X 1,42 Nardi), che può catturare una cella intera (o nucleo) del campo di vista.
  3. Impostare i parametri di esposizione (ad es., il potere di eccitazione, tempo di esposizione) per ciascun canale di colore di fluorescenza, utilizzando campioni di controllo positivi e negativi. Acquisire immagini di fluorescenza.
    Nota: I campioni di controllo positivi che contengono solo un'etichetta fluorescente dovrebbero essere utilizzati anche per determinare il livello di "diafonia" tra i canali di colore. Per campioni di imaging cellulare fisso, il potere di eccitazione fluorescenza può essere ridotto (con tempi leggermente più lunghi di esposizione) per ridurre al minimo photobleaching.
  4. Una volta stabilito il protocollo di formazione immagine, mantenere gli stessi parametri di esposizione coerente per tutti i campioni in uno studio — affinché i dati di immagine possono essere accuratamente analizzati e confrontati.
  5. Eseguire l'elaborazione post-acquisizione immagine e ricostruzione 3D. Identificare le trascrizioni di K-Rta da segnale di RNA-pesce (rosso), molecole di LANA dall'immunofluorescenza (verde) e la cromatina nucleare (ove applicabile) macchiato con DAPI (blu).
    Nota: Regioni del nucleo della cellula, in cui K-Rta e LANA sono co-cluster, così sono credute per essere associato con fabbriche di trascrizione virale e replica complessa.

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Risultati

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Un protocollo leggermente abbreviato è stato eseguito dove sono state utilizzate cellule BCBL-1 e solo LANA e K-Rta RNA erano macchiate (Figura 1). Questo esperimento ci permette di esaminare dove sono attivamente trascrizione episomi virali e l'eterogeneità della risposta a stimoli di riattivazione di KSHV in una popolazione delle cellule. Nella cella indicata dalla freccia nella Figura 1, la fluorescenza di K-Rta distinta nelle...

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Discussione

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Ci sono alcuni aspetti del protocollo che può essere modificato per accogliere le circostanze insolite. La scelta di fissazione e permeabilization buffer può anche essere alterata. Per i buffer di fissazione, è efficace anche paraformaldeide ed etanolo può essere utilizzato per la permeabilizzazione.

Tempra la formaldeide con glicina che PBS è raccomandato in quanto impedisce formaldeide disabilitando gli anticorpi in assenza di albumina di siero bovino (BSA), ma se le lamelle vengono lavate a...

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Dichiarazioni

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Gli autori di questa carta non hanno legami finanziari o concorrenti conflitti di interessi.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata sostenuta da grant National Institutes of Health (R01-DE025985) e da un American Cancer Society ricerca Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Questo lavoro è stato anche supportato da concessioni dal US Department of Agriculture (2015-67015-23268 e 2014-67015-21787) e nuova concessione di iniziativa di ricerca presso University of California, Davis.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMI medium 1650 GlutaMAXGibco di Life Technologies61870-036Deve essere riscaldato a 37 gradi C
Siero fetale bovinoOmega Scientific Inc.FB-11
Penna Strep Glutammina (100x)Gibco di Life Technologies10378-016
Timidina Sigma AldrichT9250
Dulbecco' s Soluzione tamponata con fosfatoGibco di Life Technologies14190-144
TPASigma AldrichP1585
Butirrato di sodio Sigma AldrichB5887
Soluzione di formaldeide Sigma Aldrich252549Corrosivo, tossico, pericoloso per la salute
DietilpirocarbonatoSigma AldrichD-5758Tossicità acuta 
GlycineSigma Aldrich410225
AcetoneSigma Aldrich179124Infiammabile, tossico
MetanoloFisher Chemical 67-56-1Infiammabile, tossico, pericoloso per la salute
Anticorpo monoclonale di ratto contro KSHV/HHV-8 ORF73Advanced Biotechnologies13-210-100
Anti-RNA polimerasi II Clone di anticorpi CTD4H8EMD Milipore05-623
Acido ribonucleico, trasferimento dal fornaio' s lievito (S. cerevisiae) Sigma Aldrich9014-25-9
Soluzione salina sodio citrato tampone 20x (SSC)Thermo Fisher Scientific 
formammide Sigma Aldrich295876
Omnipur destrano solfato, soluzione al 50%EMD Milipore1916C093
DAPI (4',6-diamindino-2-fenilidolo, dicloridrato)Thermo Fisher Scientific D1306
reagente antisbiadimento slowFade GoldLife TechnologiesS36936
Micro vetro di copertura 22x22MatsunamiC022221
Softwaredi imaging 3D VoloCITY
Microscopio DeltaVision Vetrini
per microscopio Superfrost/PlusFisher Scientific12-550-15
15557044

Riferimenti

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