Sviluppo di un test In Vitro per quantificare progenitrici e staminali ematopoietiche cellule (HSPCs) nello sviluppo di embrioni di Zebrafish

Sommario

Qui, presentiamo un metodo semplice per quantificare le cellule ematopoietiche staminali e progenitrici (HSPCs) in zebrafish embrionale. HSPCs dallo zebrafish dissociate sono placcati in metilcellulosa con fattori solidale, differenziando in sangue maturo. Questo consente il rilevamento di sangue difetti e permette lo screening per essere facilmente condotto.

Abstract

L'ematopoiesi è un processo cellulare essenziale in cui cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) si differenziano nella moltitudine degli stirpi differenti delle cellule che compongono il sangue maturo. Isolamento ed identificazione di questi HSPCs è difficile perché sono definiti ex post facto; possono essere definiti solo dopo la loro differenziazione in cellule specifiche. Negli ultimi decenni, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un organismo modello per studiare l'ematopoiesi. Embrioni di zebrafish sviluppano ex uteroe di post-fertilizzazione 48h (hpf) hanno generato definitiva HSPCs. saggi per valutare la differenziazione HSPC e sono state sviluppate capacità di proliferazione, che utilizza il trapianto e successive ricostituzione del sistema ematopoietico oltre a visualizzare linee specializzate transgenici con microscopia confocale. Tuttavia, queste analisi sono costo proibitivo, tecnicamente difficile e richiede tempo per molti laboratori. Sviluppo di un modello in vitro per valutare HSPCs sarebbe conveniente, più veloce, e presenti meno difficoltà rispetto al precedentemente descritti metodi, che permettano di laboratori valutare rapidamente le schermate di mutagenesi e droga che influiscono sulla biologia HSPC. Questo romanzo in vitro test per valutare la HSPCs viene eseguito da embrioni di zebrafish intero placcatura dissociata e aggiungendo fattori esogeni che promuovono solo HSPC differenziazione e la proliferazione. Gli embrioni sono dissociati in cellule singole e placcati con HSPC-solidale Colonia di granulociti che causano loro di generare unità formanti colonie (CFU) che derivano da una cellula progenitrice singolo. Queste analisi dovrebbero consentire un esame più attento delle vie molecolari responsabili della proliferazione, la differenziazione e il regolamento, che permetterà ai ricercatori di capire le basi della ematopoiesi vertebrato e sua disregolazione HSPC durante la malattia.

Introduzione

L'ematopoiesi è il processo di fare il gran numero di cellule ematiche mature, necessaria per la sopravvivenza di un organismo. È un processo chiave di sviluppo che coinvolge la differenziazione di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) in una varietà di tipi cellulari inerente allo sviluppo limitato che comprendono sangue maturo. Questi HSCs devono rinnovarsi affinché il sistema non è mai esaurito e si deve mantenere dal primo sviluppo embrionale fino alla morte. Nei vertebrati, costante differenziazione e la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) sono necessari per alimentare adeguatamente la maggior parte delle cellule del san....

Protocollo

Comitato consultivo istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) presso la California State University, Chico, ha approvato tutti i metodi descritti di seguito.

1. candeggina 48 embrioni di Zebrafish hpf

1. Con 15 centimetri (w) x 15 cm (l) x contenitori di plastica di 7 cm (h) creare 3 stazioni di lavaggio: 1) con 1 mL di candeggina al 5% in 1000 mL di terreno di embrione (E3; si veda tabella 1), 2) con sterile E3 e 3) con E3 sterile. Assicurarsi che ogni contenitore 500 mL di soluzione per sommergere gli embrioni in.
   Nota: Per ogni condizione testata, saranno necessari almeno 10 embrioni. Questa procedura ....

Risultati

Per valutare il numero HSPC in zebrafish embrionale, 48 hpf embrioni sono stati digeriti, placcati in metilcellulosa con fattori di crescita ematopoietici-solidale esogeni e incubati per 7 giorni (Figura 1A). Dopo 7 giorni, unità formanti colonie (CFU) sono stati enumerati (Figura 1B) e immagine (Figura 1C). Controllando le diverse citochine aggiunta.......

Discussione

Il sistema di modello di zebrafish è diventato un modello efficiente, efficace ed economico per studiare l'ematopoiesi vertebrato primitivo e definitiva. Generazione di saggi che sono veloci, poco costoso e presenta alcune difficoltà tecniche può essere utilizzato per test di piccole molecole, analizzando gli embrioni mutanti e delucidare i meccanismi molecolari importanti per la biologia HSPC. Placcatura in vitro di HSPCs dallo zebrafish adulto è un metodo efficace per studiare la mutagenesi e citochine ematopo.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10% di albumina sierica bovina nelle tecnologie MDM	StemCell di Iscove	9300
DPBS (10x) con calcio2+ e magnesio2+	Life Technologies	14080-055
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Life Sciences	sh30256.01
DMEM 500 mL	Corning CellGrow	10-017-CV
Ham's F12 500 mL	Corning CellGrow	10-080-CV
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HEPES 100 mL (1 M)	Gibco life technologies	15-630-080
Penicillina/streptomicina (5000 U/mL e 5000 mg/mL) con L-Glutammina (200 mM)	Corning Mediatech	30-009-CI
Gentamicina Solfato 10 mL (50 mg/mL)	Corning Mediatech	30-005-CR
Provetta MCF da 1,5 mL	FisherBrand	05-408-129
Ago per iniezione da 3 mL 23gx1 con Luer lock	BD Safety Glide	305905
Provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL con tappo del filtro	cellulare Corning Falcon	352235
Methocel MC	Sigma-Aldrich	64630
Tubo a fondo tondo in polistirene da 14 mL	Corning Falcon	352057
10 mm in polistirene easygrip Piastra di Petri	Corning Falcon	351008
Librease TM	Roche Sigma-Aldrich	5401119001	proteasi di dissociazione
Pronase	Roche Sigma-Aldrich	11459643001	proteasi di decorionazione
15 cm Piastra di Petri	Corning Falcon	351058
AB	Zebrafish International Resource Center (ZIRC)	ZL1	ceppo di pesce zebra utilizzato
Ditiolthreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	646563