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Articolo metodologico

Sviluppo di un test In Vitro per quantificare progenitrici e staminali ematopoietiche cellule (HSPCs) nello sviluppo di embrioni di Zebrafish

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DOI:

10.3791/56836

⸱

30 novembre 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un metodo semplice per quantificare le cellule ematopoietiche staminali e progenitrici (HSPCs) in zebrafish embrionale. HSPCs dallo zebrafish dissociate sono placcati in metilcellulosa con fattori solidale, differenziando in sangue maturo. Questo consente il rilevamento di sangue difetti e permette lo screening per essere facilmente condotto.

Abstract

L'ematopoiesi è un processo cellulare essenziale in cui cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) si differenziano nella moltitudine degli stirpi differenti delle cellule che compongono il sangue maturo. Isolamento ed identificazione di questi HSPCs è difficile perché sono definiti ex post facto; possono essere definiti solo dopo la loro differenziazione in cellule specifiche. Negli ultimi decenni, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un organismo modello per studiare l'ematopoiesi. Embrioni di zebrafish sviluppano ex uteroe di post-fertilizzazione 48h (hpf) hanno generato definitiva HSPCs. saggi per valutare la differenziazione HSPC e sono state sviluppate capacità di proliferazione, che utilizza il trapianto e successive ricostituzione del sistema ematopoietico oltre a visualizzare linee specializzate transgenici con microscopia confocale. Tuttavia, queste analisi sono costo proibitivo, tecnicamente difficile e richiede tempo per molti laboratori. Sviluppo di un modello in vitro per valutare HSPCs sarebbe conveniente, più veloce, e presenti meno difficoltà rispetto al precedentemente descritti metodi, che permettano di laboratori valutare rapidamente le schermate di mutagenesi e droga che influiscono sulla biologia HSPC. Questo romanzo in vitro test per valutare la HSPCs viene eseguito da embrioni di zebrafish intero placcatura dissociata e aggiungendo fattori esogeni che promuovono solo HSPC differenziazione e la proliferazione. Gli embrioni sono dissociati in cellule singole e placcati con HSPC-solidale Colonia di granulociti che causano loro di generare unità formanti colonie (CFU) che derivano da una cellula progenitrice singolo. Queste analisi dovrebbero consentire un esame più attento delle vie molecolari responsabili della proliferazione, la differenziazione e il regolamento, che permetterà ai ricercatori di capire le basi della ematopoiesi vertebrato e sua disregolazione HSPC durante la malattia.

Introduzione

L'ematopoiesi è il processo di fare il gran numero di cellule ematiche mature, necessaria per la sopravvivenza di un organismo. È un processo chiave di sviluppo che coinvolge la differenziazione di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) in una varietà di tipi cellulari inerente allo sviluppo limitato che comprendono sangue maturo. Questi HSCs devono rinnovarsi affinché il sistema non è mai esaurito e si deve mantenere dal primo sviluppo embrionale fino alla morte. Nei vertebrati, costante differenziazione e la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) sono necessari per alimentare adeguatamente la maggior parte delle cellule del sangue che sono post-mitotici e viene riciclato ogni giorno. HSC generano cellule ematiche mature differenziando prima in sottoinsiemi di cellule progenitrici limitato; comuni progenitori linfoidi (CLPs)1, che alla fine producono le cellule T, B e NK e comuni dei progenitori mieloidi (CMPs)2 che generano i granulociti, eritrociti, macrofagi e megacariociti. Questi progenitori si sono impegnati a generare cellule specifiche e ulteriormente differenziano in altre cellule progenitrici inerente allo sviluppo limitato come progenitori eritroidi mieloide (MEP) che generano gli eritrociti e piastrine o granulociti progenitori del macrofago (GMP) che generano i basofili, eosinofili, neutrofili e macrofagi2. Identificare e isolare questi progenitori permette l'identificazione di importanti vie molecolari coinvolti nel differenziamento ematopoietico e molte malattie ematopoietiche come leucemia sorgono quando queste cellule progenitrici non correttamente differenziare.

Negli ultimi decenni, il sistema di modello di zebrafish (Danio rerio) è diventato uno strumento chiave della ricerca per gli studi emopoietici embrionali ed adulti. Zebrafish sono suscettibile di analisi genetica e le specie di vertebrati modello filogeneticamente più basse che hanno un simile sistema vascolare e sistema ematopoietico agli esseri umani. Embrioni di zebrafish sviluppano ex utero, ed entro 48 ore post fertilizzazione (hpf) generare HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafish sono altamente fertile, anche con le femmine posa oltre 100 uova in un singolo frizione, permettendo per campioni di grandi dimensioni e replica sperimentale. Embrioni di zebrafish sono otticamente trasparenti, consentendo per visualizzazione microscopica del sistema ematopoietico. Parecchie linee transgeniche fluorescente di zebrafish marcatura HSCs come runx1: EGFP pesce9, cd41: EGFP pesce10, e kdrl:mCherry; cMyb: animali GFP3 double-positivo, consentire per la visualizzazione in tempo reale di HSC emersione ed espansione in vivo3,4,7,8, 9. Generazione veloce tempo e sviluppo ex utero di zebrafish ha condotto al relativo uso in droga e mutagenesi studi11,12,13,14,15 16,17,18,19,20 per composti che contengono promessa terapeutica per malattie del sangue umano di screening. Nel complesso, conservazione del sistema ematopoietico, la presenza e il facile sviluppo di linee transgeniche e il tempo di rigenerazione rapida ha reso zebrafish un modello economico, veloce, flessibile e ideale per studi ematopoietici.

Sono stati sviluppati numerosi metodi di isolamento e test HSCs nei sistemi mammiferi ematopoietici. Gli investigatori possono utilizzare una combinazione di recettori di superficie per Marco HSCs21,22,23,24, nonché di sfruttare la capacità di HSCs di efflusso tintura25,26. Dopo sono etichettati, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) consente loro separazione fisica. Dimostrare che una cella è un HSC richiede irradiando un animale ospite per distruggere HSPCs endogena, trapianto di HSC putativo e osservando la ricostituzione a lungo termine, multi-lignaggio di tutto maturo tipi di cellule del sangue. Questi test funzionano bene in topi, come ci sono numerosi cellula-superficie anticorpi contro le cellule ematopoietiche e ceppi inbred del mouse che facilitano immuni per il trapianto. Tuttavia, pochi anticorpi di superficie delle cellule ematopoietiche zebrafish sono stati generati27, ostacolando l'identificazione e l'isolamento di HSCs. Il modo più comune per contrassegnare e isolare HSCs zebrafish è con animali transgenici, per cui una sequenza di cellula-specifico promotore sta guidando la espressione di una proteina fluorescente. Studi hanno visualizzato ed enumerato HSCs nella parete ventrale dell'aorta dorsale con microscopia che utilizzano questa tecnica3,4,8,9. Altri laboratori hanno generato ceppi clonali di zebrafish28,29 e sono effettuati trapianti di successo negli animali MHC-abbinato30. Tuttavia, queste tecniche sono costi proibitivi per molti laboratori, sono tecnicamente difficili e richiedono molto tempo. Per risolvere questi problemi, laboratori hanno generato diversi saggi in vitro per verificare la presenza, i tassi di proliferazione e la capacità di differenziazione di HSPCs31,32,33, 34,35,36. Queste analisi mostrano la proliferazione e la differenziazione di HSPCs in vitro31,32,33,34,35,36, il salvataggio di ematopoietiche difetti36e un metodo efficiente per l'individuazione e sperimentazione di citochine33,34,35. Essi sono stati utilizzati anche per identificare i geni responsabili HSPC biologia31,32. In questo studio, prendiamo queste analisi un passo avanti, consentendo la quantificazione di HSPCs in un embrione di zebrafish sviluppo. Queste analisi possono essere utilizzate anche per quantificare il numero di HSPCs in animali mutanti e gli animali trattati con farmaci emopoietici dirompente. In sostanza, queste analisi sono veloce, presenti alcune sfide tecniche e sono modi economici per quantificare i numeri HSPC, esaminare la loro proliferazione e indagare blocchi nella differenziazione.

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Protocollo

Comitato consultivo istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) presso la California State University, Chico, ha approvato tutti i metodi descritti di seguito.

1. candeggina 48 embrioni di Zebrafish hpf

  1. Con 15 centimetri (w) x 15 cm (l) x contenitori di plastica di 7 cm (h) creare 3 stazioni di lavaggio: 1) con 1 mL di candeggina al 5% in 1000 mL di terreno di embrione (E3; si veda tabella 1), 2) con sterile E3 e 3) con E3 sterile. Assicurarsi che ogni contenitore 500 mL di soluzione per sommergere gli embrioni in.
    Nota: Per ogni condizione testata, saranno necessari almeno 10 embrioni. Questa procedura di lavaggio può ospitare fino a 200 embrioni.
  2. Con una pipetta di trasferimento, posizionare gli embrioni in un colino da tè e immergere le uova nella stazione di lavaggio #1 per 5 minuti rimuovere il colino da tè (con embrioni all'interno) e inserire nella stazione di lavaggio #2 per 5 min; Ripetere per stazione di lavaggio #3 per un finale 5 min.
  3. Dopo l'ultimo lavaggio, risciacquo embrioni da colino da tè ruotandola testa in giù sopra un pulito 10 cm di Petri e risciacquo delicatamente gli embrioni fuori il colino da tè con E3 sterile e una pipetta di trasferimento.

2. Dechorionate embrioni

  1. Con una pipetta di trasferimento, rimuovere e scartare tanto E3 come possibile da di Petri e aggiungere 500 μL di dechorionation proteasi (10 mg/mL) agli embrioni. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Picchiettare delicatamente il lato di Petri per rimuovere completamente chorions.
  2. Con una pipetta sierologica, aggiungere 20 mL di sterile E3 per diluire proteasi. Embrioni di stabilirsi ed eliminarne l'E3 con una pipetta di trasferimento. Ripetere questo passaggio di lavaggio 3 volte per rimuovere tutte le tracce della proteasi dechorionation.

3. preparazione dei campioni di embrione

  1. Utilizzando una pipetta P1000, inserire 10 embrioni in un tubo del microcentrifuge singole sterili da 1,5 mL.
  2. Rimuovere E3 con una pipetta e scartare.
    Attenzione: Pipetta con cura come embrioni possono essere facilmente spostati e scartati durante le seguenti fasi di lavaggio.

4. preparare gli embrioni per dissociazione

  1. Trasferire campioni cappa a flusso laminare e lavare gli embrioni aggiungendo 1 mL sterile E3. Consentire gli embrioni si depositano sul fondo della provetta e rimuovere il surnatante con una pipetta P1000. Ripetere per un totale di 3 lavaggi.
  2. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere E3 ed eliminare. Aggiungere 1 mL di 10 mM dithiothreitol (DTT) in E3 per rimuovere il rivestimento di muco (e spore, lievito o batteri che possono essere intrappolati in esso) che circondano il zebrafish embrionale. Posare il tubo del microcentrifuge orizzontalmente e incubare a temperatura ambiente in cappa a flusso laminare per 25 min.

5. embrione dissociazione

  1. Lavare il campione 3 volte con 1 mL di DPBS sterile (con Ca2 + e Mg2 +). Dopo l'ultimo lavaggio aggiungere 500 μL di DPBS (con Ca2 + e Mg2 +) e aggiungere 5 μL di proteasi di dissociazione di 5 mg/mL (26 U/mL).
    Attenzione: Questo enzima ha bisogno di Ca2 + e Mg2 +, in modo da garantire che il DPBS contiene questi ioni.
  2. Incubare i campioni a 37 ° C in un agitatore orbitale orizzontale a 180 giri/min per 60 min. campioni di posto nella cappa a flusso laminare e triturare gli embrioni con un P1000 fino a quando i campioni sono completamente dissociati.
    Attenzione: Controllare gli embrioni periodicamente per determinare quando essi diventano dissociate. La soluzione di embrione dovrebbe avere certa quantità di tessuto presente; non dovrebbe essere completamente omogeneo. È possibile sovra-digest, che distruggerà la HSPCs (Vedi Supplemental figura 1).

6. preparazione degli embrioni dissociati

  1. Embrioni di pipetta il 10 dissociato sul serbatoio superiore di un polistirolo da 5 mL tubo rotondo basso con un tappo di filtro cella 35 μm.
  2. Con una pipetta, sciacquare il tubo di Petri con PBS sterile (con nessun Ca2 + o Mg2 +) e soluzione di trasferimento a 5 mL provetta polistirolo filtrati celle dal punto 6.1. Ripetere fino a 4 mL di liquido è presente nella provetta polistirolo da 5 mL.
    Nota: PBS, DPBS o altre soluzioni isotoniche tampone possono essere utilizzati in questa fase, purché non contengono Ca2 + o Mg2 +
  3. Centrifugare le provette a 4 ° C e 300 x g per 5 min a pellet campione omogeneizzato cellulare. Con una pipetta, rimuovere e scartare il surnatante dal tubo fondo tondo. Fare attenzione a non frantumare le cellule pellettate nella parte inferiore del tubo. Risospendere le cellule in 100 μL di PBS.

7. preparazione di metilcellulosa

  1. Generare la soluzione di riserva completa metilcellulosa (tabella 1): 1x e aggiungere 2,5 mL in provette sterili round-fondo 14 mL con 16 G aghi e siringhe da 3 mL. Utilizzare un tubo per ogni condizione testata.
  2. Aggiungere citochine, molecole piccole o altri agenti per essere studiato per ogni campione.
    1. Per differenziazione mieloide, aggiungere 1% carpa del siero e 0,3 mg/mL ricombinante zebrafish stimolante le colonie granulocitarie fattore (Gcsf)34 per mezzo di metilcellulosa. Vedi Svoboda et al. 37 per la descrizione completa su come generare carpa citochine del siero e ricombinante.
    2. Per differenziazione eritroide, aggiungere 1% carpa del siero e 0,1 mg/mL zebrafish ricombinante dell'eritropoietina (Epo)38 a mezzo di metilcellulosa.
    3. Per esaminare i progenitori multilineare, aggiungere Epo e Gcsf.
      Attenzione: Citochine e additivi non dovrebbero totale più del 10% del volume totale, come il mezzo non sarà abbastanza viscoso a discernere le diverse colonie.

8. aggiunta di embrioni dissociati di metilcellulosa

  1. Utilizzando una pipetta, aggiungere 100 μL di dissociata 10 embrioni alla superficie della metilcellulosa preparata con ricombinante del siero di citochine e la carpa. Coperchio tappo e agitare delicatamente per omogeneizzare completamente campione. Ogni tubo deve contenere il tessuto dissociato di 10 embrioni.
  2. Utilizzando 3 mL siringhe ed aghi di 16 G, aliquotare 1 mL di campione in 2 capsule di Petri separata 35 mm. Assicurarsi che il campione è completamente dispersa in tutto il piatto di Petri. Ripetere per ogni campione.
  3. Consente di inserire un 15cm di Petri 35mm di Petri con cellule in metilcellulosa. Ad ogni piatto di 15 cm, aggiungere una piastra di Petri di 35 mm con 5 mL di acqua sterile per umidificare i campioni. Incubare a 32 ° C e 5% CO2 per 7-10 giorni.

9. visualizzazione dei derivati HSPC Colony Forming Units (CFU)

  1. Dopo 7 giorni di incubazione, posizionare il campione sul microscopio invertito a 40-100 X per visualizzazione ed enumerazione. A questo punto, diverse colonie possono essere isolate con una pipetta e sottoposti ad analisi di colorazione e/o gene.

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Risultati

Per valutare il numero HSPC in zebrafish embrionale, 48 hpf embrioni sono stati digeriti, placcati in metilcellulosa con fattori di crescita ematopoietici-solidale esogeni e incubati per 7 giorni (Figura 1A). Dopo 7 giorni, unità formanti colonie (CFU) sono stati enumerati (Figura 1B) e immagine (Figura 1C). Controllando le diverse citochine aggiunta...

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Discussione

Il sistema di modello di zebrafish è diventato un modello efficiente, efficace ed economico per studiare l'ematopoiesi vertebrato primitivo e definitiva. Generazione di saggi che sono veloci, poco costoso e presenta alcune difficoltà tecniche può essere utilizzato per test di piccole molecole, analizzando gli embrioni mutanti e delucidare i meccanismi molecolari importanti per la biologia HSPC. Placcatura in vitro di HSPCs dallo zebrafish adulto è un metodo efficace per studiare la mutagenesi e citochine ematopo...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 a D.L.S.), il California State University Program per formazione & ricerca in biotecnologia (CSUPERB: controllo molecolare della nicchia emopoietica vertebrati a D.L.S.) e dall'ufficio studi universitari presso la California State University di Chico (a A.C.B.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10% di albumina sierica bovina nelle tecnologie MDMStemCell di Iscove9300
DPBS (10x) con calcio2+ e magnesio2+Life Technologies14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
  DMEM 500 mLCorning CellGrow10-017-CV
  Ham's F12 500 mLCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HEPES 100 mL (1 M)Gibco life technologies15-630-080
Penicillina/streptomicina (5000 U/mL
e 5000 mg/mL) con L-Glutammina (200 mM)		Corning Mediatech30-009-CI
Gentamicina Solfato 10 mL (50 mg/mL)Corning Mediatech30-005-CR
Provetta MCF da 1,5 mLFisherBrand05-408-129
Ago per iniezione da 3 mL 23gx1 con Luer lockBD Safety Glide305905
Provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL con tappo del filtrocellulare Corning Falcon352235
Methocel MCSigma-Aldrich64630
Tubo a fondo tondo in polistirene da 14 mLCorning Falcon352057
10 mm in polistirene easygrip Piastra di PetriCorning Falcon351008
Librease TMRoche Sigma-Aldrich5401119001proteasi di dissociazione
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001proteasi di decorionazione
15 cm Piastra di PetriCorning Falcon351058
ABZebrafish International Resource Center (ZIRC)ZL1ceppo di pesce zebra utilizzato
Ditiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich646563

Riferimenti

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