Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

Ayelet Di Segni; Tzipi Braun; Marina BenShoshan; Sarit Farage Barhom; Efrat Glick Saar; Karen Cesarkas; James E. Squires; Nathan Keller; Yael Haberman

doi:10.3791/56845

Articolo metodologico

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

DOI:

10.3791/56845

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19 marzo 2018

Ayelet Di Segni¹ , Tzipi Braun¹ , Marina BenShoshan¹ , Sarit Farage Barhom¹ , Efrat Glick Saar¹ , Karen Cesarkas¹ , James E. Squires² , Nathan Keller¹^,³ , Yael Haberman¹^,⁴

¹Sheba Medical Center, ²Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, ³Ariel University, ⁴Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo consente l'analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.

Abstract

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Il microbioma intestinale umano svolge un ruolo centrale nella protezione delle cellule dall'infortunio, nella trasformazione di energia e nutrienti e nel promuovere l'immunità. Deviazioni da quello che è considerato una composizione del microbiota sano (disbiosi) possono compromettere le funzioni vitali, portando a condizioni patologiche. Gli sforzi recenti e continue ricerche che sono state rivolte verso la caratterizzazione delle associazioni fra composizione microbica e la salute umana e la malattia.

Advances in tecnologie di sequenziamento ad alta velocità consente la caratterizzazione della composizione microbica dell'intestino. Questi metodi includono sequenziamento del 16S rRNA-amplicone e sequenziamento shotgun. Sequenziamento del 16S rRNA-amplicon viene utilizzata per analizzare la composizione tassonomica, mentre sequenziamento shotgun fornisce ulteriori informazioni su previsioni di gene e annotazione funzionale. Un vantaggio nell'utilizzo di un metodo di sequenziamento mirato della regione variabile del 16S rRNA gene è il suo costo notevolmente inferiore rispetto al sequenziamento shotgun. Differenze di sequenza nel gene del rRNA 16S vengono utilizzate come un'impronta digitale microbica per identificare e quantificare i diversi taxa all'interno di un singolo campione.

Principali iniziative internazionali hanno arruolato standard per sequenziamento del 16S rRNA-amplicon. Tuttavia, parecchi studi segnalano una fonte comune di variazione causato dall'effetto di batch. Per minimizzare questo effetto, in uniforme protocolli per la raccolta del campione, l'elaborazione e l'ordinamento deve essere implementato. Questo protocollo propone l'integrazione dei protocolli ampiamente utilizzati a partire dalla raccolta dei campioni fecali per analisi dei dati. Questo protocollo include un approccio diretto-PCR privo di colonna, che consente la gestione simultanea ed estrazione di DNA di un gran numero di campioni di feci, insieme con l'amplificazione di PCR della regione V4. Inoltre, il protocollo descrive la pipeline di analisi e fornisce uno script utilizzando l'ultima versione di QIIME (QIIME 2 versione 2017.7.0 e DADA2). Questo protocollo passo dopo passo si rivolge a chi è interessato a iniziare l'uso del sequenziamento del 16S rRNA-amplicone in modo robusto, riproduttivo, facile da usare e dettagliato guida.

Introduzione

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Sono concentrato sforzi per comprendere meglio microbiome diversità e abbondanza, come un altro aspetto di catturare la differenza e le somiglianze tra individui in condizioni sane e patologiche. Età²^,³, Geografia⁴, lifestyle⁵^,⁶e malattia⁵ sono stati indicati per essere associati con la composizione del microbioma intestinale, ma molte condizioni e popolazioni non sono ancora state completamente caratterizzata. Recentemente è stato segnalato che il microbioma può essere modificato per applicazioni terapeu....

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Protocollo

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Approvazione etica per lo studio è stato concesso dal comitato di etica Sheba locale ricerca e tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le direttive e i regolamenti. Il protocollo ha ricevuto un'eccezione di consenso del paziente dal locale comitato di revisione etica, poiché il materiale fecale che sono stati utilizzati sono stati già presentati al nucleo di microbiologia come parte del workup clinico e senza informazioni identificabili paziente diverso da età, genere e microbiche risultati. Scritto, il consenso informato è stato ottenuto da volontari sani e Institutional Review Board ha approvato lo studio. Alcuni di quei campioni sono già stati inclusi ....

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Risultati

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Un'illustrazione schematica del protocollo è illustrato nella Figura 1.

Prospetticamente abbiamo raccolto campioni di feci da pazienti ospedalizzati con sospetta diarrea infettiva. Tali campioni sono stati presentati al laboratorio di microbiologia clinica presso il centro medico di Sheba tra febbraio e maggio 2015, come è stato descritto in precedenza¹. Campioni di feci sono.......

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Discussione

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16S rRNA-amplicone e sequenziamento shotgun metagenomica hanno guadagnato popolarità in microbiologia clinica applicazioni²¹^,^22,23. Queste tecniche sono vantaggiose in loro una maggiore capacità di catturare taxa coltivabili e non coltivabili, fornendo dati relativi l'abbondanza relativa dell'inoculo di patogeno e la loro capacità di identificare più precisamente un polimicrobica infettiva ²⁴di impronte digitali. I progressi nel campo dell.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato in parte dal programma-CORE (concede n. 41/11), la Israel Science Foundation (concessione n. 908/15) e l'europeo di Crohn e colite organizzazione (ECCO).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)
Soluzione di estrazione	Sigma-Aldrich	E7526
Soluzione di diluizione	Sigma-Aldrich	D5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit	KAPABIOSYSTEMS	KK2601	PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsKit di reagenti DNA	Invitrogen	P7589	dsDNA quantificare il reagente
MinElute Kit di estrazione su gel	Qiagen	28606
Agarosio	Amresco	0710-250G
Acqua ultra pura Senza Dnasi e Rnasi	Biological Industries	01-866-1A
Kit di test Qubit dsDNA HS	Sonde molecolari	rilevamento del dsDNA	Q32854
Alta sensibilità D1000	Agilent Technologies	Screen Tape 5067-5582	separazione e analisi
Screen Tape Assay	Agilent Technologies	Reagenti 5067-5583	per librerie
di DNA PhiX Control v3	Illumina	15017666	libreria di controllo
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cicli)	MS-102-2003
Collezione Etidio Bromuro	Amresco	E406-10mL-TAM
2 mL tubi	SARSTEDT	72.695.400	Provette di raccolta Safe Seal
Tampone in plastica in provetta in PP	INTERNO STERILE	23117
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Equipment
Macchina	PCR Applied Biosystems	2720 Termociclatore
Macchina di sequenziamento	Illumina	Miseq
PCR workstation	Biosan	UV-cleaner
forbici
vortexer	Scientific Industries	Vortex-Genie 2

Kit di Illumina

Riferimenti

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Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088(2017).
De Filippo, C., et al.

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Ristampe e permessi

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Tag

Sequenziamento di ampliconi dell rRNA 16S Raccolta di campioni fecali Estrazione del DNA Amplificazione PCR Regione V4 QIIME 2 DADA2 Preparazione della libreria Elettroforesi su gel Analisi delle coordinate principali

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

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