Un standard Western blotting protocollo è stato ottimizzato per analizzare come pochi come 500 ematopoietiche staminali o cellule progenitrici. Ottimizzazione comporta un'attenta manipolazione del campione cellulare, limitando i trasferimenti tra tubi e Lisi direttamente le cellule in tampone di Laemmli.
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Articolo metodologico
Un Western Blotting protocollo per un piccolo numero di cellule staminali ematopoietiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule rare, con il midollo osseo di topo contenente solo ~ 25.000 fenotipica lungo termine repopulating HSCs. Un protocollo macchiante occidentale è stata ottimizzata e adatta per l'analisi di un piccolo numero di HSCs (500-15.000 cellule). Fenotipica HSCs sono stati purificati, accuratamente contati e direttamente lisate nel tampone di Laemmli. Lisati contenente un numero uguale di cellule sono stati analizzati mediante elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) e la macchia è stata preparata ed elaborato seguendo standard Western blotting protocolli. Usando questo protocollo, 2.000-5.000 HSCs può essere analizzato sistematicamente, e in alcuni casi i dati possono essere ottenuti da poco più di 500 cellule, confrontate alle cellule 20.000 a 40.000 segnalate nella maggior parte delle pubblicazioni. Questo protocollo dovrebbe essere generalmente applicabile ad altre cellule ematopoietiche e consente l'analisi di routine di un piccolo numero di celle utilizzando le procedure standard di laboratorio.
Introduzione
Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule autorinnovabile che possono dare origine a tutti i lignaggi di sangue. Essi sono relativamente rare cellule nel midollo osseo, rendendo difficile analisi biochimiche. Adatto per l'analisi di cellule rare, come la citometria a flusso, gli approcci sono stati estremamente utili per quantificare la quantità relativa di marcatori di superficie delle cellule e proteine intracellulari. Tuttavia, l'analisi delle proteine intracellulari richiede l'uso di procedure di permeabilizzazione delle cellule per consentire l'accesso dell'anticorpo, e non tutte le superficie epitopi sopravvivono queste procedure1,2. Inoltre, gli anticorpi che discriminano tra prodotti di isoforme o scissione di diverse proteine non sono spesso disponibili per citometria a flusso, e quindi gli investigatori si basano ancora su Western blot per determinati tipi di analisi.
L'analisi Western blot dei lisati cellulari è una procedura di routine nella maggior parte dei laboratori. Le cellule possono essere purificate in condizioni native che conservano gli epitopi di molecole della superficie cellulare e lisati cellulari possono successivamente essere preparati ed analizzati. Tuttavia, l'analisi delle proteine nella cellula primaria rara popolazioni mediante Western blot può richiedere gran numero di animali per ottenere abbastanza cellule di eutanasia. Apportando piccole modifiche a diversi passi, un protocollo macchiante occidentale convenzionale è stato in grado di rilevare le proteine in un relativamente piccolo numero di HSCs (500-15.000, a seconda della proteina di interesse). Le regolazioni sono accuratamente contando le cellule, gestire attentamente il pellet cellulare, riducendo i trasferimenti delle cellule fra tubi per ridurre al minimo la perdita delle cellule, e un numero definito di cellule con un carico concentrato di lisi del buffer contenente proteasoma e inibitori delle fosfatasi. Molti rapporti pubblicati includono Western blot ottenuti con 20.000 o più HSCs3,4,5,6,7; Questa semplice procedura ridurrà il numero delle cellule e animali da esperimento necessari per produrre dati equivalenti di compreso tra 4 e 40 volte. Il protocollo è progettato per normalizzare i risultati su base per cella, piuttosto che ad un controllo interno. Questo consente il rilevamento di riduzioni complessive nei livelli della proteina che possono essere trascurati se i dati sono normalizzati ad un controllo interno. L'importanza della normalizzazione su base per cellula è stato descritto per l'analisi dei dati di espressione genica8, e lo stesso principio si applica a quantificare le proteine mediante Western blot. Questo protocollo ottimizzato dovrebbe essere utile per chiunque abbia bisogno di analizzare un piccolo numero di cellule.
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Protocollo
Tutte le procedure devono essere eseguite conformemente all'uso animale istituzionale e orientamenti di cura. La procedura è stata sviluppata per l'analisi di murine cellule ematopoietiche staminali e progenitrici (HSCs e HPs), ma può essere adattata per l'analisi di altre popolazioni cellulari.
1. flusso Cytometry isolamento di HSCs murino e HPs
- Raccogliere le cellule del midollo osseo murino come descritto in letteratura6.
Nota: Nei dati presentati in Figura 1 e Figura 2, midollo osseo è stato raccolto da topi C57BL/6J. - Eseguire svuotamento di stirpe delle cellule di midollo osseo utilizzando un kit di svuotamento lignaggio di mouse, seguendo le istruzioni del produttore.
- Incubare le cellule con gli anticorpi contro i marcatori di superficie delle cellule di interesse come descritto7. Negli esperimenti illustrati nella Figura 1 e Figura 2, sono utilizzati anticorpi Sca-1, Kit, Flt3, e dei marcatori di lignaggio (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 e Ter119.
- Ordinare le 2.000-20.000 Lin– Sca1+Kit+ Flt3– le cellule (HSCs) o Lin–Sca1–cellule Kit+ (HPs) in una provetta Eppendorf da 1,5 mL contenente 0,1 mL di fosfato tampone salino (PBS) con 2% fetale bovino siero (FBS).
Nota: Per i dati mostrati nella Figura 1 e Figura 2, le cellule erano ordinate utilizzando un citometro a flusso con un ugello di 70 µM. Il volume massimo collezione è 1,4 mL.
2. preparazione del campione
Nota: Questo passaggio è fondamentale. Elaborare il campione molto attentamente. Quando si rimuove il supernatante, essere molto attenti a non disturbare il pellet cellulare.
- Il 1.5 mL provette contenenti cellule ordinate in un rotore oscillante a 4 ° C, 500 x g, per 5 min. Rimuovi tutti, ma circa 100 µ l del surnatante dalla cella a pellet molto delicatamente utilizzando una pipetta e una punta di dispensare 20 µ l. Non disturbare il pellet.
- Se il campione contiene meno di 5000 cellule e il volume totale del campione ordinato è inferiore a 0,2 mL, trasferire le cellule prima di provette per PCR 0,2 mL obbligatoria bassa prima centrifugazione.
- Se il campione contiene meno di 5000 cellule e il volume è superiore a 0,2 mL, rallentare le cellule con una centrifuga a 4 ° C, 500 x g, per 5 min e rimuovete tutti ma 200 µ l del surnatante. Risospendere le cellule pellettate nei restanti 200 µ l di supernatante, poi trasferire le cellule per le provette per PCR 0,2 mL e girare di nuovo verso il basso. Rimuovere tutti i ma 20-30 µ l dal pellet dopo il secondo giro e risospendere le cellule.
- Risospendere le cellule in surnatante a sinistra nel tubo. Se necessario, aggiungere ulteriori PBS nel 2% FBS/PBS (è anche possibile utilizzare 2% albumina di siero bovino (BSA) / PBS, o PBS da solo) per ottenere una concentrazione 5 x104 a 5 x 105 cellule/mL.
Nota: Utilizzare la cella conta raccolti mediante citometria a stimare il volume utilizzato per sospendere le cellule. - Utilizzare 2-5 µ l delle cellule ri-sospensione per determinare una concentrazione di cellule accurato utilizzando un contatore di cellule automatizzato (seguendo le istruzioni del produttore) o un emocitometro9.
- Trasferire un volume di ri-sospensione celle contenenti il numero desiderato di cellule in nuove provette da 1,5 mL. Per l'esperimento in Figura 1, 500, 1.000 o 2.000 HSCs o HPs sono stati trasferiti. Il numero di celle desiderato dipende dalla forza del segnale ottenuto mediante Western blot e viene determinato empiricamente. Eseguire il trasferimento utilizzando un 20 µ l o 100 µ l Eppendorf pipetta.
- Centrifugare le cellule in un rotore oscillante a 4 ° C, 500 x g, per 5 min.
- Per generare soluzioni di riserva: 100x, sciogliere gli inibitori del proteasoma e fosfatasi in DMSO secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare 2 x Laemmli tampone diluendo la 4 x Laemmli sample buffer fornito dal produttore con una quantità equivalente di acqua distillata. Aggiungere una quantità appropriata di stock 100x di inibitori del proteasoma e fosfatasi per ottenere una concentrazione finale di 2 inibitori di x nel 2 buffer del campione di x Laemmli.
Nota: Il tampone del campione x Laemmli 2 può essere fatta in anticipo, ma gli inibitori del proteasoma e fosfatasi devono essere aggiunto immediatamente prima di aggiungere il 2 x Laemmli tampone (più inibitori) per il pellet cellulare per lisare le cellule, come descritto nel passaggio seguente. - Con attenzione rimuovere una porzione del supernatante dal pellet e al supernatante restanti nel tubo con il pellet cellulare, aggiungere un volume equivalente di tampone del campione x Laemmli 2 più inibitori del proteasoma e fosfatasi per ottenere una concentrazione finale di 500 cellule / µ l in 1 tampone del campione x Laemmli.
Nota: ad esempio, se si trasferiscono 2.000 cellule in un volume totale di 20 µ l per un tubo nel punto 2.5, dopo centrifugazione le cellule (passo 2.6) si dovrebbe rimuovere 18 µ l del supernatante dal pellet e per i 2 µ l di supernatante che rimane aggiungere un volume uguale (2 µ l) di 2 x Laemmli buffer del campione per ottenere una concentrazione finale di 500 cellule / µ l in 1 tampone del campione x Laemmli. - Risospendere il pellet per generare il lisato appena possibile. A questo punto, i campioni possono essere immediatamente electrophoresed attraverso i gel di SDS-PAGE, oppure può essere snap congelato nel liquido N2 e conservati a-80 ° C per un uso futuro.
3. elettroforesi
- Riscaldare i lisati in un blocco di calore a 95 ° C o in acqua bollente per 5 min.
- Electrophorese 1-40 µ l dei lisati (contenente da 500 a 20.000 equivalenti di cella) attraverso gel SDS-PAGE, a 100V, utilizzando protocolli standard10.
Nota: Il volume di lisato caricati nel gel è determinato dal numero di cellule necessarie per generare il segnale desiderabile e dipenderà l'abbondanza della proteina di interesse e la qualità dell'anticorpo. I dati nella Figura 1 sono stati ottenuti con 2.000, 1.000 e 500 equivalenti di cella di lisato. La larghezza del pozzo dovrebbe essere nella gamma di 3 mm a 1,5 mm. 1,5 mm denti possono essere tagliata da un pettine di commercialmente disponibile con denti più ampia con le forbici.
4. trasferimento e bloccare
Nota: Eseguire un Western blot seguendo protocolli standard11. I passaggi sono brevemente descritte qui:
- Pretrattare una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) con metanolo per 10 s, quindi lavare la membrana brevemente con acqua distillata.
- Trasferire le proteine dal gel SDS-PAGE alla membrana seguendo le istruzioni riportate nel manuale fornito dal costruttore dell'apparato di trasferimento.
- Dopo il trasferimento, bloccare la membrana con 2 mL di 5% di albumina di siero bovino (BSA) in PBST (PBS con 0,1% Tween) overnight a 4 ° C, seguendo protocolli standard11.
5. anticorpo etichettatura
- Incubare la membrana con anticorpi su un agitatore durante la notte a 4 ° C, utilizzando diluizioni di anticorpo consigliati dal fornitore.
Nota: Nella tabella materiali, gli anticorpi, che abbiamo convalidato per HSCs e HPs e le diluizioni di anticorpo corrispondente, sono indicati. Eseguire l'anticorpo etichettatura utilizzando le procedure standard8.
6. rilevazione
- Lavare la membrana 3 volte, 5 min per ogni lavaggio in PBST a temperatura ambiente.
- Incubare la membrana con 2 mL di tampone di chemiluminescenza per 1 min a temperatura ambiente. Rilevare i segnali utilizzando un sistema di imaging seguendo le istruzioni, o pellicola di autoradiografia e sviluppatrice pellicola del fabbricante.
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Risultati
Risultati rappresentativi da 500-2.000 purificata HSCs e HPs sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2. Il segnale di β-actina nella Figura 1 può essere rilevato da poco più di 500 HSCs e HPs purificate dal midollo osseo di un mouse. Si noti che i lisati di caricamento nei pozzetti di 1,5 mm prodotto un segnale molto più forte da 500 HPs di caricamento nei pozzetti di 3,0 mm. Figur...
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Discussione
Western Blotting è una tecnica comune per la rilevazione di proteine specifiche e l'attivazione di vie di segnalazione in tessuti o cellule. Con l'introduzione di piccole modifiche ad una procedura comunemente utilizzata, siamo stati in grado di rilevare ordinariamente 15 proteine diverse (Tabella materiali) a 15.000 HSCs e in alcuni casi in appena 500 HSCs. Le fasi critiche in questo protocollo sono: 1) accuratamente contando le cellule, 2) riducendo al minimo il numero di trasferimenti tra tubi e 3) le...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare.
Ringraziamenti
National Institutes of Health concedere R01 CA149976 (ale) sostenuto questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| sodio dodecil solfato (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrilammide Bis soluzione | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Persolfato di ammonio | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-proteiforme a 3 pettini | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Sistema di trasferimento | Bio-Rad | 1704155EDU | trasferimento |
| PowerPac HC Alimentatore | Bio-Rad | 1645052EDU | elettroforesi |
| Sistema di imaging | Bio-Rad | 1708195 | di rilevamento del segnale |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | del campione |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | Elettroforesi |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | del campione |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, per 40 blots | Bio-Rad | trasferimento 1704272 | |
| Inibitore della proteasi Cocktail | Sigma | 11697498001 | preparazione del campione |
| Inibitore della fosfatasi Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | del campione |
| EIF4G | Segnalazione cellulare | 2469 | WB anticorpo, convalidato in 1000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): Fig2 |
| p-Rps6 | Anticorpo | 4858 | , convalidato in 1000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): Fig2 |
| actina (HRP coniugata) | abcam | ab49900 | anticorpo WB, convalidato in 500 cellule concentrazione di anticorpi: 1:5000 riferimento (figura): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | Anticorpo WB, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento(figura): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento(figura): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | Anticorpo 4877 | WB, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | Anticorpo WB, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1) |
| actina | Santa Cruz | sc-47778 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:3000 riferimento (figura): ref5 (Fig4) |
| kit di deplezione del lignaggio (topo) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Purificazione di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche |
| Colonne LS | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | Purificazione di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche |
| SCF | PeproTech | 250-03 | Stimolazione della fosforilazione |
| APC-Cy7 c-kit anticorpo | ThermoFisher | A15423 | cellulare |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | smistamento cellulare |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | smistamento cellulare |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | smistamento cellulare |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | smistamento cellulare |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | smistamento cellulare |
| Piastre distanziatrici con 1,0 mm Integrato Distanziatori | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | siero bloccante la membrana |
| Atlanta Biologicals | A12450 | contatore | |
| di cellule | Invitrogen | AMQAF1000 | emocitometro per conteggio delle cellule |
| ThermoFisher | S17040 | conteggio delle cellule | |
| flim | Denville Scientific | E3012 | |
| di film medicali di rilevamento del | Konica | SRC-101A | Supersignal |
| West Femto Massima sensibilità Substrato | Therom Scientific | 34096 | rilevamento del segnale |
| Allegra X-15R Centrifuga (rotore SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | campione preparazione |
| BLUEcolora scala proteica | Gold Biotechnology | P007-500 | |
| selezionatore cellulare | per | FACSAria II | preparazione del campione |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | elettroforesi |
Riferimenti
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- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
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- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
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Ristampe e permessi
