Un Western Blotting protocollo per un piccolo numero di cellule staminali ematopoietiche

Sommario

Un standard Western blotting protocollo è stato ottimizzato per analizzare come pochi come 500 ematopoietiche staminali o cellule progenitrici. Ottimizzazione comporta un'attenta manipolazione del campione cellulare, limitando i trasferimenti tra tubi e Lisi direttamente le cellule in tampone di Laemmli.

Abstract

Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule rare, con il midollo osseo di topo contenente solo ~ 25.000 fenotipica lungo termine repopulating HSCs. Un protocollo macchiante occidentale è stata ottimizzata e adatta per l'analisi di un piccolo numero di HSCs (500-15.000 cellule). Fenotipica HSCs sono stati purificati, accuratamente contati e direttamente lisate nel tampone di Laemmli. Lisati contenente un numero uguale di cellule sono stati analizzati mediante elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) e la macchia è stata preparata ed elaborato seguendo standard Western blotting protocolli. Usando questo protocollo, 2.000-5.000 HSCs può essere analizzato sistematicamente, e in alcuni casi i dati possono essere ottenuti da poco più di 500 cellule, confrontate alle cellule 20.000 a 40.000 segnalate nella maggior parte delle pubblicazioni. Questo protocollo dovrebbe essere generalmente applicabile ad altre cellule ematopoietiche e consente l'analisi di routine di un piccolo numero di celle utilizzando le procedure standard di laboratorio.

Introduzione

Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule autorinnovabile che possono dare origine a tutti i lignaggi di sangue. Essi sono relativamente rare cellule nel midollo osseo, rendendo difficile analisi biochimiche. Adatto per l'analisi di cellule rare, come la citometria a flusso, gli approcci sono stati estremamente utili per quantificare la quantità relativa di marcatori di superficie delle cellule e proteine intracellulari. Tuttavia, l'analisi delle proteine intracellulari richiede l'uso di procedure di permeabilizzazione delle cellule per consentire l'accesso dell'anticorpo, e non tutte le superficie epitopi sopravvivono queste procedure¹

Protocollo

Tutte le procedure devono essere eseguite conformemente all'uso animale istituzionale e orientamenti di cura. La procedura è stata sviluppata per l'analisi di murine cellule ematopoietiche staminali e progenitrici (HSCs e HPs), ma può essere adattata per l'analisi di altre popolazioni cellulari.

1. flusso Cytometry isolamento di HSCs murino e HPs

1. Raccogliere le cellule del midollo osseo murino come descritto in letteratura⁶.
   Nota: Nei dati presentati in Figura 1 e Figura 2, midollo osseo è stato raccolto da topi C57BL/6J.
2. Eseguire svuo....

Risultati

Risultati rappresentativi da 500-2.000 purificata HSCs e HPs sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2. Il segnale di β-actina nella Figura 1 può essere rilevato da poco più di 500 HSCs e HPs purificate dal midollo osseo di un mouse. Si noti che i lisati di caricamento nei pozzetti di 1,5 mm prodotto un segnale molto più forte da 500 HPs di caricamento nei pozzetti di 3,0 mm. Figur.......

Discussione

Western Blotting è una tecnica comune per la rilevazione di proteine specifiche e l'attivazione di vie di segnalazione in tessuti o cellule. Con l'introduzione di piccole modifiche ad una procedura comunemente utilizzata, siamo stati in grado di rilevare ordinariamente 15 proteine diverse (Tabella materiali) a 15.000 HSCs e in alcuni casi in appena 500 HSCs. Le fasi critiche in questo protocollo sono: 1) accuratamente contando le cellule, 2) riducendo al minimo il numero di trasferimenti tra tubi e 3) le.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
sodio dodecil solfato (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrilammide Bis soluzione	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Persolfato di ammonio	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-proteiforme a 3 pettini	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Sistema di trasferimento	Bio-Rad	1704155EDU	trasferimento
PowerPac HC Alimentatore	Bio-Rad	1645052EDU	elettroforesi
Sistema di imaging	Bio-Rad	1708195	di rilevamento del segnale
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	del campione
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	Elettroforesi
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	del campione
RTA Mini PVDF Transfer Kit, per 40 blots	Bio-Rad	trasferimento 1704272
Inibitore della proteasi Cocktail	Sigma	11697498001	preparazione del campione
Inibitore della fosfatasi Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	del campione
EIF4G	Segnalazione cellulare	2469	WB anticorpo, convalidato in 1000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): Fig2
p-Rps6	Anticorpo	4858	, convalidato in 1000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): Fig2
actina (HRP coniugata)	abcam	ab49900	anticorpo WB, convalidato in 500 cellule concentrazione di anticorpi: 1:5000 riferimento (figura): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	Anticorpo WB, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento(figura): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento(figura): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	Anticorpo 4877	WB, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	Anticorpo WB, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1)
actina	Santa Cruz	sc-47778	WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:3000 riferimento (figura): ref5 (Fig4)
kit di deplezione del lignaggio (topo)	Miltenyi Biotec	130-090-858	Purificazione di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche
Colonne LS	Miltenyi Biotec	130-041-305	Purificazione di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche
SCF	PeproTech	250-03	Stimolazione della fosforilazione
APC-Cy7 c-kit anticorpo	ThermoFisher	A15423	cellulare
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	smistamento cellulare
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	smistamento cellulare
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	smistamento cellulare
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	smistamento cellulare
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	smistamento cellulare
Piastre distanziatrici con 1,0 mm Integrato Distanziatori	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	siero bloccante la membrana
	Atlanta Biologicals	A12450	contatore
di cellule	Invitrogen	AMQAF1000	emocitometro per conteggio delle cellule
	ThermoFisher	S17040	conteggio delle cellule
flim	Denville Scientific	E3012
di film medicali di rilevamento del	Konica	SRC-101A	Supersignal
West Femto Massima sensibilità Substrato	Therom Scientific	34096	rilevamento del segnale
Allegra X-15R Centrifuga (rotore SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	campione preparazione
BLUEcolora scala proteica	Gold Biotechnology	P007-500
selezionatore cellulare	per	FACSAria II	preparazione del campione
Incublock	Denville Scientific	I0510	elettroforesi