Un standard Western blotting protocollo è stato ottimizzato per analizzare come pochi come 500 ematopoietiche staminali o cellule progenitrici. Ottimizzazione comporta un'attenta manipolazione del campione cellulare, limitando i trasferimenti tra tubi e Lisi direttamente le cellule in tampone di Laemmli.
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Articolo metodologico
Un Western Blotting protocollo per un piccolo numero di cellule staminali ematopoietiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule rare, con il midollo osseo di topo contenente solo ~ 25.000 fenotipica lungo termine repopulating HSCs. Un protocollo macchiante occidentale è stata ottimizzata e adatta per l'analisi di un piccolo numero di HSCs (500-15.000 cellule). Fenotipica HSCs sono stati purificati, accuratamente contati e direttamente lisate nel tampone di Laemmli. Lisati contenente un numero uguale di cellule sono stati analizzati mediante elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) e la macchia è stata preparata ed elaborato seguendo standard Western blotting protocolli. Usando questo protocollo, 2.000-5.000 HSCs può essere analizzato sistematicamente, e in alcuni casi i dati possono essere ottenuti da poco più di 500 cellule, confrontate alle cellule 20.000 a 40.000 segnalate nella maggior parte delle pubblicazioni. Questo protocollo dovrebbe essere generalmente applicabile ad altre cellule ematopoietiche e consente l'analisi di routine di un piccolo numero di celle utilizzando le procedure standard di laboratorio.
Introduzione
Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule autorinnovabile che possono dare origine a tutti i lignaggi di sangue. Essi sono relativamente rare cellule nel midollo osseo, rendendo difficile analisi biochimiche. Adatto per l'analisi di cellule rare, come la citometria a flusso, gli approcci sono stati estremamente utili per quantificare la quantità relativa di marcatori di superficie delle cellule e proteine intracellulari. Tuttavia, l'analisi delle proteine intracellulari richiede l'uso di procedure di permeabilizzazione delle cellule per consentire l'accesso dell'anticorpo, e non tutte le superficie epitopi sopravvivono queste procedure1
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Protocollo
Tutte le procedure devono essere eseguite conformemente all'uso animale istituzionale e orientamenti di cura. La procedura è stata sviluppata per l'analisi di murine cellule ematopoietiche staminali e progenitrici (HSCs e HPs), ma può essere adattata per l'analisi di altre popolazioni cellulari.
1. flusso Cytometry isolamento di HSCs murino e HPs
- Raccogliere le cellule del midollo osseo murino come descritto in letteratura6.
Nota: Nei dati presentati in Figura 1 e Figura 2, midollo osseo è stato raccolto da topi C57BL/6J. - Eseguire svuo....
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Risultati
Risultati rappresentativi da 500-2.000 purificata HSCs e HPs sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2. Il segnale di β-actina nella Figura 1 può essere rilevato da poco più di 500 HSCs e HPs purificate dal midollo osseo di un mouse. Si noti che i lisati di caricamento nei pozzetti di 1,5 mm prodotto un segnale molto più forte da 500 HPs di caricamento nei pozzetti di 3,0 mm. Figur.......
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Discussione
Western Blotting è una tecnica comune per la rilevazione di proteine specifiche e l'attivazione di vie di segnalazione in tessuti o cellule. Con l'introduzione di piccole modifiche ad una procedura comunemente utilizzata, siamo stati in grado di rilevare ordinariamente 15 proteine diverse (Tabella materiali) a 15.000 HSCs e in alcuni casi in appena 500 HSCs. Le fasi critiche in questo protocollo sono: 1) accuratamente contando le cellule, 2) riducendo al minimo il numero di trasferimenti tra tubi e 3) le.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare.
Ringraziamenti
National Institutes of Health concedere R01 CA149976 (ale) sostenuto questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| sodio dodecil solfato (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrilammide Bis soluzione | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Persolfato di ammonio | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-proteiforme a 3 pettini | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Sistema di trasferimento | Bio-Rad | 1704155EDU | trasferimento |
| PowerPac HC Alimentatore | Bio-Rad | 1645052EDU | elettroforesi |
| Sistema di imaging | Bio-Rad | 1708195 | di rilevamento del segnale |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | del campione |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | Elettroforesi |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | del campione |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, per 40 blots | Bio-Rad | trasferimento 1704272 | |
| Inibitore della proteasi Cocktail | Sigma | 11697498001 | preparazione del campione |
| Inibitore della fosfatasi Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | del campione |
| EIF4G | Segnalazione cellulare | 2469 | WB anticorpo, convalidato in 1000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): Fig2 |
| p-Rps6 | Anticorpo | 4858 | , convalidato in 1000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): Fig2 |
| actina (HRP coniugata) | abcam | ab49900 | anticorpo WB, convalidato in 500 cellule concentrazione di anticorpi: 1:5000 riferimento (figura): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | Anticorpo WB, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento(figura): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento(figura): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | Anticorpo 4877 | WB, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | Anticorpo WB, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule Concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:1000 riferimento (figura): ref5 (FigS1) |
| actina | Santa Cruz | sc-47778 | WB anticorpo, convalidato in 15000 cellule concentrazione di anticorpi: 1:3000 riferimento (figura): ref5 (Fig4) |
| kit di deplezione del lignaggio (topo) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Purificazione di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche |
| Colonne LS | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | Purificazione di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche |
| SCF | PeproTech | 250-03 | Stimolazione della fosforilazione |
| APC-Cy7 c-kit anticorpo | ThermoFisher | A15423 | cellulare |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | smistamento cellulare |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | smistamento cellulare |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | smistamento cellulare |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | smistamento cellulare |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | smistamento cellulare |
| Piastre distanziatrici con 1,0 mm Integrato Distanziatori | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | siero bloccante la membrana |
| Atlanta Biologicals | A12450 | contatore | |
| di cellule | Invitrogen | AMQAF1000 | emocitometro per conteggio delle cellule |
| ThermoFisher | S17040 | conteggio delle cellule | |
| flim | Denville Scientific | E3012 | |
| di film medicali di rilevamento del | Konica | SRC-101A | Supersignal |
| West Femto Massima sensibilità Substrato | Therom Scientific | 34096 | rilevamento del segnale |
| Allegra X-15R Centrifuga (rotore SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | campione preparazione |
| BLUEcolora scala proteica | Gold Biotechnology | P007-500 | |
| selezionatore cellulare | per | FACSAria II | preparazione del campione |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | elettroforesi |
Riferimenti
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al.
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Ristampe e permessi
