La pelle umana agisce come una prima linea di difesa contro l'ambiente esterno. Presentiamo un metodo per isolare i keratinocytes umani primari da pelle adulta. Questi keratinocytes isolato sono utili in numerose configurazioni sperimentali e sono un modello altamente adatto per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.
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Articolo metodologico
Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta
In questo articolo
Sommario
Abstract
La funzione principale dei cheratinociti è per fornire l'integrità strutturale dell'epidermide, mantenendo quindi una barriera meccanica al mondo esterno. Inoltre, cheratinociti svolgono un ruolo essenziale nell'iniziazione, la manutenzione e la regolazione delle risposte immunitarie epidermiche facendo parte del sistema immunitario innato risponde agli stimoli antigenici in modo veloce, non specifico. Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento dei keratinocytes umani primari da pelle adulta e dimostrare che queste cellule rispondono a differenziazione terminale calcio-indotta, come misurato da un'aumentata espressione del involucrin indicatore di differenziazione. Inoltre, ci mostra che i keratinocytes isolati sono reattivi al-1 β-induced attivazione delle vie di segnalazione intracellulare come misurato tramite l'attivazione del pathway MAPK p38. Presi insieme, descriviamo un metodo per l'isolamento e coltura dei keratinocytes umani primari da pelle adulta. Poiché i cheratinociti sono il tipo predominante delle cellule nell'epidermide, questo metodo è utile per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.
Introduzione
La pelle è l'organo più grande del corpo umano e serve come una barriera protettiva contro l'ambiente esterno. La pelle è composta di due strati principali: il derma e l'epidermide, dove l'epidermide costituisce lo strato più esterno della pelle. Il tipo più abbondante di cellule nell'epidermide è i keratinocytes che comprende oltre il 95% delle cellule massa1,2. I cheratinociti sono tenuti nelle varie fasi di differenziazione nell'epidermide e sono organizzati in livelli basali, spinosi, granulari e cornified che corrispondono a specifiche fasi di differenziazione3. La funzione primari....
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Protocollo
La raccolta di campioni di pelle da volontari sani adulti sottoposti a chirurgia plastica richiede l'approvazione del comitato etico nelle istituzioni dell'host. Questo protocollo è stato approvato dal regionale Comitato etico della regione Midtjylland, Danimarca (M-20110027). Il metodo qui descritto è derivato dagli studi simili da Maciaq et al. 10 e Liu e Karasek11.
1. isolamento dei cheratinociti da pelle umana
- Iniziare facendo le seguenti soluzioni: 50 mL di soluzione di glucosio di tripsina e 0,1% 0,25% in DPBS. Mix e filtro sterilizzare (0,2 µm) la soluzione. Prepara....
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Risultati
Calcio-indotto differenziazione terminale
Cheratinociti umani subiscono differenziazione terminale previo trattamento con calcio14,15,16. Keratinocytes umani primari è stato isolato e coltivato come descritto nel protocollo di cui sopra. Quando circa 50-60% confluenti, le cellule sono state stimolate con calcio (1,2 mM) o veicolo e immagini delle cellule sono state scattate il giorno 0, 1 e 2.
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Discussione
Qui, descriviamo come facilmente isolare keratinocytes umani primari da pelle adulta e come loro coltura in vitro. Questo modello può avere una vasta applicazione per indagini di biologia delle cellule epidermiche e può essere utile per i ricercatori interessati a studiare le malattie cutanee.
Alcuni dei vantaggi del protocollo descritto qui è che, contrariamente ai cheratinociti isolati da prepuzio neonatale ottenuto da neonati maschi sottoposti a circoncisione, keratinocytes umani p.......
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Dichiarazioni
. L'autore non ha alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
L'autore desidera ringraziare Annette Blak Rasmussen e Kristine Moeller per il loro supporto tecnico
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Terreno di coltura cellulare |
| Integratori KSFM | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Integratori per KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS senza Calcio e Magnesio |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimetilsolfossido |
| Gentamicina | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Additivo per terreni di coltura cellulare |
| Filtro di sterilizzazione | Sartorius | 16534 | Filtro per siringa con una dimensione dei pori di 0,2 &; micro; m |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T7409 | Utilizzato per tripsinizzare le cellule |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G7528-RPMI-1640 | |
| ThermoFisher Scientific | 61870-010-FBS | ||
| ThermoFisher Scientific 16000044 | Utilizzato per inattivare la tripsina | ||
| Forcipe | - | È possibile utilizzare | |
| Forbici | - | - | È possibile utilizzare le forbici di qualsiasi azienda |
| Bisturi | Swann Morton | 0501 | I bisturi di qualsiasi azienda possono essere utilizzati |
| al 70% di etanolo | - | - | -Tamponi |
| garza | NOBAMED | 875420 | È possibile utilizzare tamponi di garza di qualsiasi fornitore |
| Pialla a pedale | Credo Solingen | 1510 | È possibile utilizzare |
| Piastre di Petri | TPP | 93100 | possibile utilizzare piastre di Petri di qualsiasi fornitore |
| Filtro metallico | - | Filtro metallico interno con foro da 1 mm | |
| 75 cm2 palloni di coltura | NUNC | 156499-150 | |
| cm2 | TTP | 90151-0,05 | |
| % Soluzione di tripsina-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Utilizzato per tripsinizzare le cellule durante il passaggio |
Riferimenti
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
- Fuchs, E., Rag....
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Ristampe e permessi
