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Articolo metodologico

Reazioni a cascata enzimatica per la sintesi di Amino alcoli chirali da L-lisina

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DOI:

10.3791/56926

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16 febbraio 2018

 ,  , 
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

In questo articolo

Sommario

Amino alcoli chirali sono molecole versatili per l'utilizzo come scaffold in sintesi organica. A partire da L-lisina, sintetizziamo amino alcoli da una reazione a cascata enzimatica combinando diastereoselettiva C-H ossidazione catalizzata da diossigenasi seguita dalla scissione della parte dell'acido carbossilico dell'amminoacido corrispondente dell'idrossile di un decarbossilasi.

Abstract

Amino alcoli sono composti versatili con una vasta gamma di applicazioni. Per esempio, essi sono stati usati come impalcature chirali in sintesi organica. Loro sintesi di chimica organica convenzionale spesso richiedono processi di noioso sintesi multi-step, con controllo difficile del risultato stereochemical. Vi presentiamo un protocollo per sintetizzare enzimaticamente amino alcoli a partire dalla L-lisina prontamente disponibile in 48 h. Questo protocollo combina due reazioni chimiche che sono molto difficili da condurre di sintesi organica convenzionali. Nel primo passaggio, il regio - e diastereoselettiva ossidazione di un legame C-H unactivated della lisina catena laterale è catalizzata da un dioxygenase; un secondo regio - e diastereoselettiva ossidazione catalizzata da un dioxygenase di regiodivergent può portare alla formazione di 1,2-dioli. Nell'ultimo passaggio, il gruppo carbossilico dell'amminoacido alfa viene scisso da una decarbossilasi del fosfato del piradossale (PLP) (DC). Questo passaggio decarboxylative riguarda solo il carbonio alfa dell'amminoacido, mantenendo il centro stereogenico idrossi-sostituiti in posizione beta/gamma. La risultante amino alcoli otticamente sono pertanto arricchiti. Il protocollo è stato applicato con successo alla sintesi semipreparative-scala di quattro amino alcoli. Monitoraggio delle reazioni è stata condotta mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) dopo derivatizzazione di 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Semplice purificazione di estrazione in fase solida (SPE) conferita la amino alcoli con ottimi rendimenti (93% di > 95%).

Introduzione

Nonostante i vantaggi offerti da biocatalisi, l'integrazione di biocatalitici passi nelle vie sintetiche o rotte biocatalitici totale rimane per lo più limitata a risoluzioni di cinetiche enzimatiche. Questi percorsi sono stati ampiamente utilizzati come un primo passo nella sintesi asimmetrica chemo-enzimatica, ma biocatalisi offre molte più possibilità nel gruppo funzionale interconversioni con elevata stereoselettività1,2,3 . Inoltre, come reazioni biocatalitici sono condotte in condizioni simili, pertanto è possibile eseguire reazioni a cascata della moda uno-pentola4,5.

Amino alcoli chirali sono molecole versatili per l'utilizzo come ausiliari o impalcature in sintesi organica6. La frazione di alcool amminico è trovata frequentemente in metaboliti secondari e ingredienti farmaceutici attivi (API). Alcoli primari β-amminici sono prontamente disponibili dagli acidi α-amminici corrispondenti di sintesi chimica convenzionale, ma l'accesso a γ-amino alcoli chirali o amminoalcoli secondari richiede spesso noiose vie sintetiche insieme sensibile controllo della stereochimica7,8,9,10. A causa della sua elevata stereoselettività, biocatalisi possono fornire un percorso sintetico superiore a questi blocchi chirali11,12,13,14.

Precedentemente abbiamo segnalato la sintesi di mono - e di-idrossi-L-lisine di diastereoselettiva idrossilazione enzimatica catalizzata da diossigenasi del ferro (II) / α-chetoacido-dipendente famiglia ossigenasi (αKAO) (Figura 1)15. In particolare, a partire da L-lisina, la KDO1 dioxygenase catalizza la formazione di (3S) - derivato idrossilato (1), mentre il (4R) - derivato (2) è costituito dalla reazione con KDO2 diossigenasi. Regiodivergent successivi idrossilazioni da KDO1 e KDO2 portano alla formazione dei (3R, 4R) - diidrossi - L-lisina (3) in forma otticamente puro. Tuttavia, la gamma limitata di substrato di questi enzimi impedisce loro ampio utilizzo in sintesi chimica, soprattutto nell'idrossilazione di ammine semplici, come una molecola di acido carbossilico nella α-posizione del gruppo amminico è essenziale per attività16.

figure-introduction-1
Figura 1: biocatalitici conversioni di L-lisina. Conversione in (3S) - idrossi - L-lisina (1) catalizzata da KDO1 dioxygenase; (4R) - idrossi - L-lisina (2) catalizzata da KDO2 dioxygenase; e (3R, 4R) - diidrossi - L-lisina (3) da reazione a cascata catalizzata successivamente da KDO1 e KDO2 diossigenasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Decarbossilazione è una reazione comune nel metabolismo17. In particolare, dell'amminoacido DCs (EC 4.1.1) sono privo di cofattore (piruvoil-dipendente) o enzimi PLP-dipendenti e catalizzano la decarbossilazione degli aminoacidi nelle poliammine corrispondente in batteri e più alti organismi18,19 , 20 , 21 , 22. la mono - diidrossi composti (Figura 3) 4–7, 10-11 corrispondono ai idrossilati cadaverina, diammina ottenuta mediante decarbossilazione della L-lisina. La cadaverina è un elemento chiave per l'industria chimica, in particolare è un componente di polimeri in poliammide e poliuretano. Di conseguenza, produzione biologica di questo diammina da risorse rinnovabili ha attirato l'attenzione come un'alternativa al percorso a base di petrolio, e vari microrganismi sono stati progettati per questo scopo. In queste vie metaboliche, lisina DC (LDC) è l'enzima chiave. LDC è un enzima di PLP-dipendenti appartenenti al alanina racemasi (AR) strutturali famiglia23. I controller di dominio di PLP-dipendenti (PLP-DCs) sono noti per essere altamente substrato specifico. Tuttavia, alcuni enzimi proprio la capacità di promiscuità leggera, essendo attivo verso gli aminoacidi L-ornitina e la L-lisina, come ad esempio la LDC da Selenomonas rumirantium (LDCSrum), che ha simili costanti cinetiche per lisina e ornitina decarbossilazione24,25. Questo substrato esteso specificità rende questo enzima un buon candidato per la decarbossilazione di mono - e di-idrossi-L-lisina. Inoltre, per trovare DCs attivo verso i derivati dell'idrossile di lisina, abbiamo esaminato il contesto genomico dei geni che codificano gli enzimi αKAO. Infatti, nei genomi procariotici i geni che codificano per enzimi coinvolti nella via biosintetica del stessa generalmente sono co-localizzati in cluster genici. Il gene KDO2 (da Chitinophaga pinensis) è stato trovato co-localizzato con un gene che codifica per presunti PLP-DC (Figura 2). Al contrario, nessun gene che codifica per la DC è stato trovato quando si analizza il contesto genomico di dioxygenase del KDO1. La proteina PLP-DC da c. pinensis (DCCpin) pertanto è stata selezionata come candidato promising per catalizzare il passo di decarbossilazione della reazione cascade.

figure-introduction-2
Figura 2: contesto Genomic del gene KDO2 in c. pinensis. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Di conseguenza, abbiamo progettato reazioni cascata enzimatica che coinvolgono diossigenasi e DCs per realizzare la sintesi di alcoli alifatici chirali β e γ-amminico da amminoacidi (Figura 3). Come precedentemente segnalato, l'ossidazione di C-H catalizzata dalla αKAO introduce il centro stereogenico idrossi-sostituiti con totale diastereoselettività; la chiralità Cβ/γ verrà mantenuta nel passaggio decarboxylative, che colpisce solo il carbonio Cα della molecola dell'amminoacido16.

figure-introduction-3
Figura 3: analisi retrosintetica. (A) Retrosynthesis di β e γ-amino alcoli (R) - 1,5 - diaminopentan-2-olo (4) da (5R) - idrossi - L-lisina e diaminopentan (S) - 1,5--2-ol (5) e 1,5-diaminopentan-3-ol (6) da L-lisina. (B) Retrosynthesis di β, γ e β, δ-amino dioli (2S, 3S) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diolo (10) e (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2,4-diolo (11) a partire da (5R)- idrossi-L-lisina e (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diolo (7) a partire da L-lisina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

A partire da L-lisina e i suoi (5R)-derivato idrossilato, qui segnaliamo un due/tre step, una pentola, procedura enzimatica che unisce diossigenasi e PLP-DCs per ottenere l'obiettivo amino alcoli. Prima la sintesi a scala di laboratorio delle molecole bersaglio, il metodo è stato sviluppato presso la scala analitica per regolare le condizioni di reazione, ad esempio, le concentrazioni di enzimi, necessari per consentire la conversione completa dei materiali di partenza; Presentiamo questa procedura pure.

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Protocollo

1. prodotto enzimatico

  1. Esprimere e purificare proteine come descritto in precedenza26.
    Nota: Proteine ricombinanti sono stati ottenuti con le seguenti concentrazioni finali: αKAO da Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO da c. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-DCs da S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), Estratto di cellulare gratis con enzima totale 12,44 mg/ml; PLP-DC da c. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCCpin), 2,62 mg/mL.

2. preparazione delle soluzioni

Nota: Tutte le soluzioni qui sotto vengono preparate in acqua deionizzata.

  1. Preparare 1 M di tampone HEPES, pH 7.5; regolare con 5 M di NaOH.
    Nota: Durante la fase di regolazione del pH, indossare guanti protettivi, indumenti protettivi, occhiali protettivi e protezioni per il viso (P280). In caso di contatto con gli occhi (P305, P351, P338), sciacquare accuratamente con acqua per diversi minuti rimuovere lenti a contatto se possibile. Continuare a sciacquare e contattare immediatamente un centro antiveleni o un medico (P310). Il codice di P si riferisce alla dichiarazione precauzionale (pericolo classe e categoria; Vedi, ad esempio, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
  2. Preparare 100 mM L-lisina, 100 mM (5S) - idrossi - L-lisina, acido α-chetoglutarico 150mm, ascorbato di sodio 100 mM, 10 mM ammonio ferro (II) solfato esaidrato (sale di Mohr), 100 mM 5-fosfato del piradossale (PLP) e 100 mM dithiothreitol (DTT).
  3. Preparare 1 M, 2M e 6M di acido cloridrico (HCl) da una soluzione di HCl 37% (circa 12 M soluzione), seguendo le stesse istruzioni di sicurezza come quelli descritti al punto 2.1.
    Nota: Le soluzioni di acido α-chetoglutarico, ascorbato di sodio e d'ammonio ferro (II) solfato esaidrato devono essere fatta fresche il giorno di utilizzo. La soluzione di lisina può essere conservata per diversi mesi a temperatura ambiente. La soluzione PLP può essere conservata per un mese a 4 ° C. La soluzione DTT può essere conservata per un mese a-20 ° C.

3. scala analitica reazioni

  1. Lo sviluppo di metodi per la reazione di decarbossilazione (5R) - idrossi - L-lisina
    1. 11 µ l di soluzione 1 M di HEPES buffer pH 7,5 (concentrazione finale di 50 mM) ad una microprovetta da 2 mL. Quindi, 22 µ l di 100 mM (5S) - idrossi - L-lisina (concentrazione finale 10 mM), 2,2 µ l di 100 mM PLP (concentrazione finale di 1 mM) e 2,2 µ l di 100 mM DTT (concentrazione finale 1 mM).
      Nota: In caso di reazione con LDCSrum, l'aggiunta di DTT non è necessario.
    2. Aggiungere il PLP-DC purificato (concentrazione finale 0,1 mg/mL). Completare con H2O per un volume finale di 220 µ l.
    3. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 3 h.
      Nota: Agitando la miscela di reazione con un coperchio aperto aria aperta garantisce una buona ossigenazione di mezzi di reazione. Non è pertanto necessario di bolla di ossigeno nei mezzi di reazione.
    4. Raccogliere 10 µ l di miscela di reazione per essere analizzati secondo la procedura di controllo di reazione descritta nel passaggio 6. I campioni sono preferibilmente derivatizzati e analizzati direttamente dopo il campionamento.
  2. Sviluppo di metodi per la reazione di cascata enzimatica che unisce un passo di idrossilazione catalizzato da αKAO con decarbossilazione catalizzata da PLP-DC
    1. 11 µ l di 1 M di tampone a pH HEPES 7,5 (concentrazione finale di 50 mM) ad una microprovetta da 2 mL. Quindi, 22 µ l di 150 mM di acido α-chetoglutarico (concentrazione finale 15 mM), 5,5 µ l di 100 mM di ascorbato di sodio (concentrazione finale 2,5 mM), 22 sale di µ l di 10 mM di Mohr (concentrazione finale 1 mM) e 22 µ l di 100 mM di L-lisina (concentrazione finale 10 mM).
    2. Completare con H2O per un volume finale di 220 µ l, prendendo in considerazione il volume della soluzione enzimatica per essere aggiunto al punto 3.2.3.
    3. Aggiungere l'enzima richiesto αKAO purificato secondo la regioselettività mirati: KDO1 per idrossilazione in posizione C-3 o KDO2 per posizione C-4 di L-lisina. La concentrazione finale dell'enzima purificato (0.05-0.5 mg/mL) è stato determinato per consentire una completa conversione in circa 3 h.
    4. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 3 h.
    5. 2,2 µ l di 100 mM di PLP (concentrazione finale ~ 1 mM) e 2,2 µ l di 100 mM di DTT (concentrazione finale ~ 1 mM).
      Nota: In caso di reazione con LDCSrum, l'aggiunta di DTT non è necessario.
    6. Aggiungere il PLP-DC purificate ad una concentrazione che consente la completa conversione in 18 h: LDCSrum ad una concentrazione finale approssimativa di 0,1 mg/mL per la reazione di cascata con KDO1 e DCCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL per la cascata di reazione con KDO2.
    7. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto aria aperta a 300 giri/min per 18 h.
    8. Eseguire una procedura di controllo come descritto al punto 3.1.4.
  3. Sviluppo di metodi per la reazione di cascata enzimatica combinando due fasi di idrossilazione catalizzate da αKAOs con decarbossilazione catalizzata da PLP-DC
    1. Eseguire passaggi 3.2.1-3.2.2.
    2. Aggiungi KDO1 ad una concentrazione finale di 0,05 mg/mL. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 3h.
    3. Aggiungi KDO2 ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 18 h.
    4. Eseguire il punto 3.2.5.
    5. Aggiungere il PLP-DC DC purificataCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, con un coperchio aperto all'aria aperta, a 300 giri/min per 18 h.
    6. Eseguire la procedura di controllo come descritto al punto 3.1.4.

4. semi-preparatorio One-pot biocatalitici reazione

Nota: Le reazioni enzimatiche avvengono su 0,1 mmol di L-lisina in un vetro all'aperto 250 mL flacone erlenmeyer per un volume totale di 10 mL.

  1. Sintesi dei derivati monoidrossilati
    1. Aggiungere 0,5 mL di tampone HEPES di 1 M, pH 7.5 (concentrazione finale di 50 mM) al pallone. Quindi, aggiungere 1 mL di 100 mM L-lisina (concentrazione finale 10 mM), 1 mL di acido α-chetoglutarico 150 mM (concentrazione finale 15 mM), 0,25 mL di ascorbato di sodio 100 mM (concentrazione finale 2,5 mM), e sale di 1 mL di 10mm Mohr (concentrazione finale 1 mM).
    2. Completare con H2O per un volume finale di 10 mL, prendendo in considerazione il volume della soluzione enzimatica per essere aggiunto al punto 4.1.3.
    3. Aggiungere l'enzima richiesto αKAO purificato secondo la regioselettività mirati: KDO1 ad una concentrazione finale di 0,075 mg/mL per idrossilazione in posizione C-3 o KDO2 ad una concentrazione finale di 0,5 mg/mL per posizione C-4 di L-lisina. La concentrazione finale dell'enzima purificato è stata determinata per consentire una completa conversione in circa 3 h.
    4. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per la durata appropriata. Quando il monitoraggio di reazione indica una reazione di idrossilazione completato (eseguita tutti i passaggi dettagliati nel passaggio 6 per il protocollo di monitoraggio della reazione), passare al punto 4.1.5. Un tempo di reazione tipico è 3h.
    5. Aggiungere 100 µ l di 100 mM PLP per la miscela di reazione αKAO (concentrazione finale ~ 1 mM). Quindi, aggiungere 100 µ l di 100 mM DTT (concentrazione finale ~ 1 mM), tranne quando si utilizza LDCSrum.
    6. Aggiungere purificata PLP-DC: LDCSrum ad una concentrazione finale approssimativa di 0,05 mg/mL per la reazione di cascata con KDO1 o DCCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL per la reazione di cascata con KDO2.
    7. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente, 300 giri/min, per 18 h e continuare direttamente per le operazioni descritte al punto 4.3.
  2. Sintesi del derivato dihydroxylated
    1. Aggiungere 0,5 mL di tampone HEPES di 1 M, pH 7.5 (concentrazione finale 50 mM), 1 mL di 100 mM L-lisina (concentrazione finale 10 mM), 1 mL di acido α-chetoglutarico 150 mM (concentrazione finale 15 mM), 0,25 mL di ascorbato di sodio 100 mM (concentrazione finale 2,5 mM) , e sale di 1 mL di 10mm Mohr (concentrazione finale di 1 mM). Completare con H2O per un volume finale di 10 mL, prendendo in considerazione il volume della soluzione enzimatica per essere aggiunto al punto 4.2.2.
    2. Aggiungere KDO1 a una concentrazione finale di 0,075 mg/mL. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per la durata appropriata.
    3. Quando il monitoraggio di reazione indica una reazione di idrossilazione completata (vedere il passaggio 6 per il protocollo di monitoraggio della reazione), passare al punto 4.2.5. Un tempo di reazione tipico è 3h.
    4. Aggiungere 1 mL di acido α-chetoglutarico 150 mM (concentrazione finale 15 mM), 0,25 mL di ascorbato di sodio 100 mM (concentrazione finale 2,5 mM), e sale di 1 mL di 10mm Mohr (concentrazione finale di 1 mM).
    5. Aggiungi KDO2 a una concentrazione finale approssimativo di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per 18 h.
    6. Quando il monitoraggio di reazione indica una reazione diidrossilazione completata (vedere il passaggio 6 per il protocollo di monitoraggio della reazione), procedere con il passo 4.2.7. Un tempo di reazione tipico è 18 h.
    7. Aggiungere 100 µ l di 100 mM di DTT (concentrazione finale ~ 1 mM), tranne quando si utilizza la LDCSrum.
    8. Aggiungere la DC purificataCpin ad una concentrazione finale approssimativa di 0,5 mg/mL, calcolato utilizzando il volume di reazione iniziale.
    9. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente a 300 giri/min per 18 h.
  3. Tempra
    1. Raffreddare la miscela di reazione posizionando il vetro 250 mL flacone erlenmeyer in un bagno di ghiaccio.
    2. Aggiungere con cautela, sopra circa 1 min, 0,25 mL di 6 M HCl agitando manualmente delicatamente la miscela di reazione raffreddata. Seguire le stesse istruzioni di sicurezza come quelli descritti al punto 2.1.
    3. Trasferimento la miscela acida in una centrifuga di fondo conico 50ml tubo usando un vetro pipetta Pasteur equipaggiato con una lampadina, quindi centrifugare a 1.680 x g e a 4 ° C per 15 min.
    4. Prelevare il supernatante e tenere da parte in un pallone da 250 mL.
    5. Aggiungere 10 mL di acqua deionizzata alla centrifuga a fondo conico contenente il pellet. Vortice per risospendere il pellet.
    6. Centrifuga a 1.680 x g, 4 ° C, per 15 min.
    7. Prelevare il supernatante e aggiungerlo il pallone a sfondo sferico 250 mL contenente il surnatante primo (punto 4.3.4).
    8. Congelare i surnatanti raccolti mediante immersione del pallone nell'azoto liquido con mano costante vorticoso e trasferire immediatamente il pallone ad un collettore di benchtop liofilizzatore per impedire al materiale di scongelamento.
    9. Al termine il processo di liofilizzazione (una notte), togliere il matraccio dal liofilizzatore.

5. purificazione di Amino alcoli dalla miscela di reazione enzimatica grezzo

  1. Resina a scambio ionico
    1. Sciogliere il prodotto liofilizzato nella quantità minima di acquosa 0,1 M di HCl (circa 4 mL) fino a quando le particelle solide non sono visibili a occhio nudo.
    2. Condizione di una resina a scambio cationico gruppo funzionale acido solfonico, 200-400 mesh, in una colonna di vetro (20 x 250 mm) di eluizione a pressione atmosferica 1M HCl (volumi di colonna 4) seguita da 0.1 M HCl (4 volumi di colonna; colonna volume = 10 mL).
    3. Caricare l'esempio con attenzione nella parte superiore della resina sulle pareti della colonna vetro utilizzando una micropipetta di 1.000 µ l. Poi, risciacquare la provetta da centrifuga a fondo conico che conteneva il prodotto grezzo tre volte con 1 mL 0,1 M di soluzione acquosa di HCl per lavare e caricare i volumi di risciacquo risultante sulla colonna nello stesso modo.
    4. Eluire con un non-lineare gradiente: 4 volumi di colonna di 0.1 M HCl, 4 volumi di colonna d'acqua, 4 volumi di colonna di 5% NH4OH, 4 volumi di colonna di 10% NH4OH, 4 volumi di colonna di 15% NH4OH, 4 volumi di colonna di 20% NH4OH , 4 volumi di colonna di 25% NH4OH e infine 4 colonna volumi del 28% NH4OH.
    5. Monitorare la purificazione mediante HPLC (Vedi punto 6).
    6. Piscina le frazioni contenenti il composto (NH4OH 20-28%) e liofilizzare come descritto nella procedura 4.3.8-4.3.9.
      Nota: La colonna di scambio ionico può essere riutilizzata dopo eluizione con acqua deionizzata alla neutralizzazione delle acque di eluizione (approssimativamente. 50 mL) seguita da ricondizionamento di eluizione con 50 mL di 1 M di HCl.
  2. SPE
    1. Solubilizzare il composto liofilizzato in circa 2 mL di H3PO4/acqua (20 µ l/mL).
    2. Posto una modalità mista scambio cationico SPE 6 mL-cartuccia su un collettore di aspirazione collegata ad una pompa di acqua. Condizione della cartuccia di disegno attraverso 4 mL di metanolo sotto pressione ridotta collegata al collettore. Equilibrare la cartuccia disegnando attraverso 4 mL di H3/4acqua PO (20 µ l/mL).
    3. Caricare l'esempio sulla cartuccia utilizzando una micropipetta di 1.000 µ l nella parte superiore della resina sulle pareti della colonna di vetro e risciacquare la fiala contenente il prodotto tre volte con 0,75 mL di H3PO4/acqua (20 µ l/mL) a lavaggio. Caricare il relativo volume di risciacquo sulla colonna nello stesso modo.
    4. Lavare la cartuccia di eluizione sotto pressione ridotta, collegata al collettore, 4 mL di 2% HCOOH in acqua, poi con 4 mL di acqua. Eluire con una sfumatura di NH4OH in acqua (4 mL per ogni eluizione, a partire da 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% e 28%).
    5. Monitorare la purificazione mediante HPLC analizzando ciascuna frazione secondo il protocollo descritto nel passaggio 6 di monitoraggio della reazione. Tenere tutte le frazioni contenenti puro derivato desiderato secondo cromatogramma di raggi ultravioletto (UV) e procedere con il passo 5.2.6.
    6. Pallone a piscina le frazioni contenenti il desiderato composto in un pallone da 100 mL, sciacquare le provette contenenti le frazioni con acqua e aggiungere il volume di risciacquo a 100 mL.
    7. Rimuovere il solvente sotto pressione ridotta mediante un evaporatore rotante dotata di un bollitore di bagno termostato acqua a 40 ° C e collegato ad una pompa di vuoto impostato a 10 mbar.
    8. Solubilizzare il solido in un volume minimo di acqua e trasferire la soluzione in un pallone da pesato 25 mL. Risciacquare la beuta con un volume minimo di acqua, aggiungere il volume di risciacquare il matraccio da 25 mL e procedere con il passo 5.2.9.
    9. Pesare il prodotto purificato e calcolare il rendimento.
    10. Sciogliere il prodotto purificato del volume minimo di 2M di HCl fino a particelle solide non sono visibili a occhio nudo e liofilizzare come descritto nella procedura 4.3.8-4.3.9.
      Nota: La amino alcoli sono composti sensibili e sono tenute come loro sali cloridrato.

6. reazione di monitoraggio e analisi del prodotto

  1. Derivatizzazione di substrati e prodotti prima dell'analisi HPLC
    Nota: I substrati e i prodotti devono essere derivatizzati come derivati aromatici per aumentare la loro detectivity cromatografica di UV. Abbiamo usato 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB). Ogni campione è stato iniettato in HPLC immediatamente dopo derivatizzazione.
    1. Prendere 10 µ l della reazione enzimatica e il trasferimento ad una microprovetta 1,5 mL. Aggiungere 10 µ l di 0,25 M di NaHCO3 soluzione acquosa, 100 µ l di etanolo e 30 µ l di 2,5 mg/mL di soluzione DNFB in etanolo.
    2. Chiudere la provetta e agitare la soluzione risultante per 1 h a 65 ° C, a 1000 giri/min. Dissetare con 10 µ l 1 M di HCl.
    3. Filtrare su un filtro di siringa non sterile di diametro 4 mm con una membrana da 0,22 µm poro dimensione idrofila polivinilidene fluoruro (PVDF) utilizzando una siringa da 1 mL Luer.
  2. Esegue il monitoraggio della reazione diossigenasi utilizzando qualsiasi sistema in grado di separare gli amminoacidi derivatizzati. Questo protocollo comprende rilevazione UV di amminoacidi derivatizzati dai gruppo cromoforo del dinitrobenzene (DNB)27.
    1. Montare l'HPLC con C18 con una colonna a fase inversa endcapping Silile trimetil (5 µm, 3 x 150 mm).
    2. Equilibrare la colonna C18 con l'eluente (30: 70) B (MeCN + 0,1% TFA) di eluente A (H2O + 0,1% TFA) ad un flusso di 1 mL/min e 35 ° C per 15 min (corrispondenti a circa 20 volumi di colonna).
    3. Iniettare 10 µ l della miscela di reazione derivatizzata (vedere punto 6.1) sulla colonna HPLC C18. Utilizzare una miscela di MeCN, 0,1% TFA/H2O e 0,1% TFA come eluente con una sfumatura lineare (rapporto 30: 70 a 70: 30 a 9 min, temperatura 35 ° C, portata 1 mL/min).
    4. Utilizzare la rilevazione UV fissato a 400 nm di analizzare i prodotti eluiti sulla colonna cromatografica. DNB-lisina eluisce in genere circa 6,5 min, idrossilato DNB-lisina circa 5,5 min, dihydroxylated DNB-lisina circa 4,2 min e DNB-aminodiol circa 5,3 min.

7. NMR Analysis di purificato Amino alcoli

  1. Sciogliere purificate amminoalcoli in D2O (700 µ l) e trasferire la soluzione in un tubo di risonanza magnetica nucleare (NMR).
  2. Acquisire 1H e spettri NMR C 13secondo appropriato NMR struttura protocolli28.

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Risultati

Precedentemente abbiamo segnalato la sintesi di mono - e di-idrossi-L-lisine di diastereoselettiva idrossilazione enzimatica catalizzata da diossigenasi del ferro (II) / αKAO famiglia (Figura 1)16. Per ottimizzare il protocollo delle cascate intere qui presentato, che combinano uno o due passaggi di idrossilazione catalizzate da una αKAO seguita da una fase di decarbossilazione catalizzata da un PLP-DC, le condizioni di reazione sono s...

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Discussione

Derivati e amino alcoli chirali hanno una vasta gamma di applicazioni, da ausiliari chirali per la sintesi organica di terapia farmaceutica. Multistep sintesi per la produzione di alcoli aminoacidi di sintesi organica convenzionali sono numerose, ma potrebbe non essere sempre efficiente a causa di passaggi noioso protezione/deprotezione insieme con un sensibile controllo della stereochimica16. Un approccio biocatalitico che eroga con le operazioni di protezione/deprotezione ed è solitamente altame...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Véronique de Berardinis per la proficua discussione e Alain Perret, Christine Pellé e Peggy Sirvain per il supporto tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
HEPESSigma AldrichH3375
L-lisina cloridratoSigma AldrichL5626
(5S)-idrossi-L-lisinaSigma AldrichGPS NONHOut sourcing
α-acido chetoglutaricoSigma Aldrich75892
Ascorbato di sodioSigma AldrichA7631
Ammonio Ferro (II) solfato esaidratoAcros201370250
Piridossale fosfato (PLP)Sigma Aldrich82870
3,4-dimercaptobutano-1,2-diolo (DTT)Sigma AldrichD0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)Sigma AldrichD1529
EtanoloVWR20825.290
Sodio carbonato acidoSigma Aldrich71631
HCl 37%Sigma Aldrich435570
HCl 0.1MFluka35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM per LC-MSVWR83640.320
2,2,2-trifluoroaceticoVWR153112E
Ammoniaca 28%VWR21182.294
Metanolo HiPerSolv CHROMANORM per LC-MSVWR 83638.32
Acido formicoAcros270480010
Acido fosforico 85%Acros201145000
Ossido di deuterioAcros320,710,075
NaOHSigma AldrichS5881
C18 Colonna HPLCPhenomenex00F-4601-Y0
Sistema UHPLC AccelaThermoFisher Scientific
Rivelatore PDAAccela ThermoFisher Scientific
Filtri per siringa da 4 mm - 0,22µ m - PVDFMerckSLGVR04NL
Siringa monouso per tubercolina con graduazione in ml, punta LuerVWRHSWA5010.200V0
Resina a scambio cationico 100-200  meshSigma Aldrich217506
Cartuccia di estrazione in fase solida a scambio cationico in modalità mista 6 mLWaters186000776
Collettore di estrazioneWatersWAT200609
Evaporatore rotanteBü chi531-0103
Liofilizzatore alfa 1-2 LDplusCristoL083302
Micropipetta 20 µ LEppendorf3121000031
Micropipette 100 &; LEppendorf3121000074
Micropipetta 500 &; LEppendorf3121000112
Micropipette 1000 µ LEppendorf3121000120
Spettrometro 300 MHzBruker
Microprovetta da 2 mLCLEARLineCL20.002.0500
Provetta da centrifuga a fondo conico da 50 mLFischer Scientific05-539-8
Pallone a fondo tondo da 25 mL 14/23Fischer Scientific10353331
Pallone a fondo tondo da 100 mL 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL pallone a fondo tondo 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL pallone di erlenmeyerFischerbrand15496143
acido .

Riferimenti

  1. Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
  2. Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  3. Turner, N. J., O'Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
  4. Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
  5. Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
  6. Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
  7. Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
  8. McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
  9. Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
  10. Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
  11. Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
  12. Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
  13. Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
  14. Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114 (0), 65-71 (2015).
  15. Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
  16. Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
  17. Suzuki, H., Kurihara, S. Ch. 4. Polyamines. Kusano, T., Suzuki, H. 4, Springer Japan. 47-59 (2015).
  18. Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
  19. Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
  20. Qian, Z. -G., Xia, X. -X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
  21. Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
  22. Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211(2015).
  23. Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
  24. Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
  25. Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
  26. Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
  27. Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
  28. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017).
  29. Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
  30. Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
  31. Kourist, R., Guterl, J. -K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
  32. Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
  33. Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).

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