Method Article

Legatura del dotto biliare parziale nel topo: un modello radiocomandato di colestasi ostruttiva localizzata

DOI:

10.3791/56930

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Jichi Medical University, 2Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Pathology, University of Pittsburgh School of Medicine, 5Pittsburgh Liver Research Center, University of Pittsburgh, 6McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo la legatura dei dotti biliari parziale come un modello chirurgico della lesione del fegato e la rigenerazione in roditori.

Abstract

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Nei roditori, la legatura del dotto biliare completa (cBDL) del dotto biliare comune è una tecnica chirurgica consolidata per lo studio della proliferazione del dotto biliare e colestasi ostruttiva. Tuttavia, esperimenti a lungo termine possono portare a un aumento della morbilità e la mortalità. In ceppi di selezione del mouse con affezione epatica di fondo, confronti significativi possono avvenire anche con la legatura di un singolo lobo del fegato, che può ridurre le spese e le perdite degli animali. Qui, descriviamo la legatura parziale dei dotti biliari (pBDL) nel topo, in cui solo il sinistra dei dotti biliari epatici è legato, causando ostruzione biliare nel lobo di sinistra ma non i lobi rimanenti. Con un'attenta tecnica microchirurgica, esperimenti di pBDL possono essere convenienti, poiché il lobo deossiHb serve come controllo interno ai lobi legati, quando sottoposti alle stesse condizioni dello stesso animale. A differenza di cBDL, un gruppo di controllo sham-operated separato non è necessario. pBDL è altamente utile direttamente confronta localizzato contro effetti sistemici di colestasi e altri componenti di bile mantenuto. pBDL può essere riproposto anche come un nuovo metodo per studiare i meccanismi legati ai farmaci e migrazione cellulare.

Introduction

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Modelli chirurgici di lesioni epatiche acute e riparazione, ad esempio hepatectomy parziale o legatura del dotto biliare comune (cBDL), sono stati utilizzati per decenni in roditori per studiare la rigenerazione del fegato e patobiologia1,2. In cBDL, il dotto biliare comune (che drena tutta bile prodotta nel fegato) è legato, con conseguente colestasi ostruttiva, infiammazione e fibrosi nelle prime 2-3 settimane dopo la chirurgia, con eventuale progressione verso la cirrosi3. Proliferazione dei dotti biliari, transdifferenziazione e induzione di cellule staminali e progenitori residenti del fegato sono anche caratteristiche di cBDL4,5. Anche se cBDL delucida meccanismi specifici di colangiopatia ostruttiva, che sono ben caratterizzati con risultati riproducibili nei topi wild-type e in quegli sforzi con fegati normali6,7,8, la procedura può essere tecnicamente impegnativo in alcuni modelli di topi transgenici di malattie del fegato, che richiedono gli animali più del previsto a causa di più alta morbilità e mortalità dell'ostruzione biliare nel corso del tempo. Questa tecnica è anche utile per lo studio della malattia di topi transgenici con sottostanti del fegato, che altrimenti non potrebbe tollerare lo stress degli esperimenti di corso di tempo prolungato dopo cBDL.

pBDL può fornire un'alternativa ragionevole per aiutare a superare alcune di queste sfide. PBDL iniziale studi nei topi wild-type volti a distinguere localmente recitazione e sistemici di mediatori di infiammazione9. In pBDL, la confluenza biliare principale dei dotti biliari epatici destro e sinistro sopra il dotto biliare comune è attentamente fruita al hilum, e solo il sinistra dei dotti biliari epatici è legato per generare una colestasi ostruttiva localizzata. pBDL offre diversi vantaggi ai cBDL. In pBDL, il lobo di destra deossiHb serve come controllo interno identicamente abbinato per il lobo di sinistra legato, sottoposto agli stessi effetti sistemici, quali lo stato nutrizionale o fattori di circolazione. Anche se mediatori pro-infiammatori sistemici erano presenti, Osawa et al osservati meno fibrosi e necrosi nei lobi deossiHb, ma aumentato di cellule infiammatorie e l'espressione di fattore di crescita-β trasformante nel lobo dei9.

Più recentemente, pBDL è stato ridefinito per studiare gli effetti sul fegato parenchimatici di bile mantenuto10. Utilizzando lo stesso animale per il controllo interno (deossiHb "falsità") e nei gruppi sperimentali, pBDL in modo efficace dimezza il numero di animali necessari per esperimento, che a sua volta è più conveniente. I topi tollerano gli effetti di pBDL molto meglio, in modo che il momento ideale corso sperimentare (≥ 2 settimane) possono essere raggiunto nel lobo legato. La cosa più importante, pBDL in grado di distinguere gli effetti diretti intraepatici di colestasi ostruttiva e mantenuto componenti della bile nel lobo legato, rispetto al lobo deossiHb controllo. Nel complesso, pBDL è un interessante metodo per studiare gli effetti specifici del lobo di colestasi localizzata nel fegato.

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Protocol

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Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida etiche del Comitato uso dell'Università di Pittsburgh e istituzionali Animal Care.

1. basi tecniche e procedure comuni

  1. Autoclave microsurgical tutte le apparecchiature prima dell'uso.
  2. Per evitare di uccidere il mouse dall'anestesia, controllare attentamente il suo modello di respirazione.
  3. Toccare gli organi e il meno possibile per evitare di danneggiare gli organi e causando sanguinamento dell'intestino. Premere punti di spurgo con tamponi di cotone bagnato o spugne garza.
  4. Utilizzare tamponi di cotone bagnato per la delicata manipolazione degli organi. Spugne garza bagnata, non-tessuto sono utilizzati in due dimensioni, 3,5 × 3,5 cm e 6.0 × 6,0 cm. utilizzare quella più piccola per ritrarre l'intero fegato. Utilizzare quello più grande per avvolgere i piccoli e grandi intestini.

2. prechirurgica preparazione

  1. Utilizzare topi c57/b6 maschi, 8-12 settimane di età (quando il peso corporeo è circa 20-35 g) per legatura parziale dei dotti biliari.
  2. Consentire il libero accesso all'acqua e cibo i topi fino ad induzione dell'anestesia.

3. operazione di legatura dei dotti biliari parziale

  1. Anestetizzare il mouse mettendo l'animale in un'aula di induzione con un mix di 1.5-2.0% isoflurane e 1 L/min di ossigeno. Monitorare con attenzione l'animale osservando il tasso di respirazione. Quando il tasso di respirazione dell'animale è un fiato al secondo, il mouse è ben anestetizzato. Dal momento che il riflesso di ritiro arto anteriore scomparirà più rapidamente, pizzicare il piede dell'arto anche per confermare la completa assenza del riflesso del ritiro. Gli occhi devono essere lubrificati con un agente oftalmico lubrificante per prevenire le ulcere corneale. Nota che la prima dose di analgesico può essere dato pre-operatively per prevenire la stimolazione dei recettori del dolore.
  2. Rasatura della parete addominale con tosatrici e posizionare il mouse sul tavolo operatorio al microscopio chirurgico. Fissare tutte le membra al tavolo con del nastro. Uso inalatorio isoflurano per mantenere il mouse in anestesia generale.
    1. Regolare il vaporizzatore di isoflurano e utilizzare isoflurano 2.0-3.0% per induzione.
  3. Utilizzando tamponi sterili, disinfettare la parete addominale prima con 0.3-0.5 mL povidone-iodio applicato topicamente, seguita da etanolo al 70%. Animale dovrebbe essere coperto con un telo sterile.
  4. Praticare un'incisione addominale lunga linea mediana al xifoideo al pube usando le forbici e pinzette Adson. Dopo aver effettuato l'incisione addominale, ridurre isoflurano a 0,8-1,0% per la manutenzione.
  5. Esporre la cavità addominale utilizzando una Micro-divaricatore. Tenere il xifoideo con pinza mosquito e ritrarre verso la testa del mouse. Fissare la pinza mosquito mediante argilla morbida.
  6. Instillare 1-2 mL di caldo (37 ° C) sterilizzato tampone fosfato salino (PBS) nella cavità addominale per evitare di ferire gli organi addominali. Tenere il piccolo intestino con tamponi di cotone bagnato e li retrarre delicatamente verso la testa del mouse. Tagliare i legamenti tra l'intestino tenue e il retroperitoneum per evitare di ferire il piccolo intestino (Figura 1A).
  7. Avvolgere i piccoli e grandi intestini con una spugna bagnata, non-tessuto garza. Metterli sul lato caudale della cavità addominale. Intestini avvolti in garza sterile possono essere posizionati su campo drappeggiato sterile per evitare la contaminazione.
  8. Ritirare delicatamente l'intero fegato verso il xifoideo utilizzando una spugna piccola garza umida di tessuto non tessuto per esporre l'ILO epatico e legamento epato-duodenale (Figura 1B).
  9. Verifica per confermare l'anatomia dell'ILO epatico. Il dotto biliare comune è situato sul lato ventrale della vena portale. Confermare le posizioni della destra e il sinistra dei dotti biliari epatici, che vuotano nella confluenza biliare principale all'ilo epatico.
  10. Identificare il sinistra dei dotti biliari epatici che drena il lobo di sinistra e circondano con una sutura in nylon 10-0 con la parte smussata di un ago per sutura (Figura 2A). Evitare di ferire la vena porta, arteria epatica e superficie del fegato.
  11. Legare il dotto biliare di sinistro con nylon 10-0. (Figura 2B).
  12. Posizionare i piccoli e grandi intestini nella stessa posizione come prima dell'operazione utilizzando tamponi di cotone bagnato.
  13. Confermare che non c'è nessuna torsione intestinale e spurgo intra-addominale, quindi chiudere il muscolo e la pelle in due strati con vicryl 4-0. Sutura intrecciata (Vicryl) è stato utilizzato per la chiusura della pelle, ma monofilamento è preferito per ridurre la probabilità di infezione.
    Nota: Chiudere fascia da sutura continua da xifoideo al pube e chiudere la pelle da sutura continua dal pube al xifoideo.
  14. Interrompere l'anestesia dopo l'incisione di chiusura.

4. follow-up e trattamento postoperatorio

  1. Appena dopo l'intervento chirurgico, pizzicare la pelle dorsale del mouse e iniettare Buprenex (0,1 mg/kg) e cefazolina (100 mg/kg) per via sottocutanea, seguita da Buprenex iniezione ogni 12 h per 3 giorni e cefazolina ogni 24 h per 3 giorni rispettivamente11,12 ,13. Nota che la prima dose di analgesico può essere dato pre-operatively per prevenire la stimolazione dei recettori del dolore. Cefazolina e altri antibiotici peri-operatorio sono necessarie solo per animali immunosoppressi, come quelli usati negli studi di trapianto.
    Nota: Se l'ambulatorio è stato effettuato con successo, il mouse di solito recupera entro 30 min. attività dei topi sarà quasi lo stesso come la condizione preoperatoria.
  2. Controllare i topi al giorno per tutti i segni di afflizione.
    1. Sacrificare i topi dalla dislocazione cervicale in anestesia generale per procurarsi il fegato e altri campioni di tessuto (cioè, 7, 14, 21 giorni) a intervalli di tempo definiti previa pBDL.

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Results

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Per questo esperimento tipico, pBDL è stato effettuato in triplice copia PiZ di topi transgenici, che ricapitolano la malattia del fegato umana trovata in alfa-1 antitripsina (A1AT). Il mouse di PiZ overexpresses un transgene composta da più frammenti genomic del DNA che contengono le regioni codificanti del gene A1AT umano mutante e promotore, insieme con gli introni e ~ 2 kilobasi di upstream e downstream che fiancheggiano le regioni14,

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Discussion

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Anche se cBDL è la più comune tecnica sperimentale per colestasi ostruttiva, può presentare molteplici sfide in roditori. A seconda del numero di giorni post-operatori necessaria per ottenere un endpoint, gli animali possono sperimentare significativa morbidità e mortalità mentre il tempo progredisce. Il grado di lesione del tessuto e necrosi biliare è ulteriormente aggravato quando si lavora con alcuni modelli di mouse transgenici dell'affezione epatica, che dimostrano il parenchima del fegato anormale e funzione alla l...

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Disclosures

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Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Acknowledgements

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Dr. Khan riconosce sovvenzioni da NIH/NICHD K12HD052892, Alpha-1 Foundation, la Fondazione di Hillman e il centro di ricerca del fegato di Pittsburgh. Dr. Michalopoulos riconosce sovvenzioni da NIH/NIDDK P01DK096990. Apprezziamo l'assistenza tecnica eccellente e generoso di Anne Orr. Siamo anche grati al Dr. David A. Geller per fornire l'accesso al laboratorio di microchirurgia trapianto/roditore.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopio-Leica Wild M650, 6– 40&volte; ingrandimentoLeica Microsystemsn/a
Tec 3 isoflurano imbuto riempimento vaporizzatoredi anestesia generalen/a
Stevens Forbici per tenotomiaChirurgia accurata e Scientific Instruments CorporationASSI.9193
Pinza AdsonStrumenti per la scienza fine11006-12
Pinza emostatica delicata classica per zanzareCodman30-4472
Micro-divaricatoreMurdock; Roboz Strumento ChirurgicoRS-6550
Spugne di garza in tessuto non tessutoFisherband870-PC-DBL
Puritan 6" Piccolo batuffolo di cotone con manico in legnoPuritan Medical Products Company868-WCS
Dumont SS Pinze - Punte standard/Dritte/Inox/13,5 cmStrumenti per la scienza fine11203-23
Dumont SS Pinze - Punte standard/Angolate 45 gradi/Inox/13,5 cmStrumenti per la scienza11203-25
Forbici a molla Vannas - Tagliente da 3 mmStrumenti per la scienza fine15000-00
Porta microaghiAesculap Surgical InstrumentsFD231R
Micro AROSuture, sutura sterile in nylon 10-0, 70 & micro; m, punti TAPAROSurgical Instruments CorporationT4A10N07
4-0 VicrylEthiconJ662H
Siringa da 5 mlBD309646
Piatto per coltura tissutale Falcon, 60 e 15 mmCorning353002
isoflurano, Farmacopea degli Stati Uniti (USP) liquido per inalazione, 250 mlPiramal HealthcareNDC 66794-017-25
Buprenex iniettabile (buprenorfina cloridrato)Reckitt Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496-0757-1
Cefazolina per preparazioni iniettabili, USPAPP PharmaceuticalsNDC 63323-238-61
PVP scrub solution (povidone– iodio 7,5%)MedlineNDC 12496-0757-1
70% etanoloDecon Labs2716
soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio o magnesioLONZA17-516F
Sirius RedSigma365548
HematolxylinFisher (Richard-Allan Scientific)22-050-111 (7211)
EosinAnatech (Fisher)832 (NC9686037)
FormalinaFisherSF100-20
Servizi

References

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