Misurazione standardizzato di differenza di potenziale Transepithelial membrana nasale (NPD)

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo standardizzato per misurare la differenza di potenziale nasale (NPD). Regolatore di conduttanza del transmembrane di fibrosi cistica (CFTR) ed epiteliale del sodio (ENaC) canale funzione vengono valutati dal cambiamento nella tensione attraverso l'epitelio nasale dopo superfusione di soluzioni che modificano l'attività del canale ionico, fornendo un misura di risultato.

Abstract

Descriviamo una misura standardizzata della differenza di potenziale nasale (NPD). In questa tecnica, regolatore di conduttanza del transmembrane di fibrosi cistica (CFTR) e la funzione di canale (ENaC) epiteliale del sodio sono monitorati dal cambiamento nella tensione attraverso l'epitelio nasale dopo superfusione di soluzioni in grado di modificare il canale ionico attività. Questo è abilitato per la misurazione della differenza di potenziale tra il compartimento sottocutaneo e l'epitelio delle vie aeree nella narice, utilizzando un catetere a contatto con turbinate nasale inferiore.

Il test permette di misurare la tensione di linea di base stabile e i cambiamenti di tensione di rete successivi dopo aspersione di 100 µM amiloride, un inibitore del riassorbimento di Na⁺ in soluzione di Ringer; una soluzione esente da cloruri contenente amiloride alla secrezione di cloruro in auto e 10 µM isoproterenolo in una soluzione di cloruro-free con amiloride per stimolare il monofosfato di adenosina ciclico (cAMP)-conduttanza dipendente cloruro legate alla CFTR.

Questa tecnica ha il vantaggio di dimostrare le proprietà elettrofisiologiche dei due componenti chiave che istituisce l'idratazione del liquido di superficie delle vie aeree dell'epitelio respiratorio, ENaC e CFTR. Pertanto, è uno strumento di ricerca utile per la fase 2 e la prova di test di concetto di agenti destinati a attività CFTR ed ENaC per il trattamento delle malattie polmonari di fibrosi cistica (CF). È anche una procedura di follow-up chiave per stabilire la disfunzione CFTR quando test genetici e test del sudore sono ambigui. A differenza di cloruro di sudore, il test è relativamente più lungo e costoso. Richiede anche la formazione degli operatori e le competenze per condurre il test in modo efficace. Variabilità inter - e intra - soggetto è stata segnalata in questa tecnica, soprattutto in soggetti giovani o non collaboranti. Per facilitare questa preoccupazione, interpretazione è stata migliorata attraverso un algoritmo recentemente convalidato.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di misurare la differenza di potenziale nasale (NPD) che mira a indagare il trasporto trans-epiteliale dello ione in vivo¹. Questa tecnica permette la misurazione di sodio (Na⁺) e trasporto del cloruro (Cl^–). NPD è stato utilizzato come strumento di ricerca dalla fine del 1980 ed è stato accettato nel 1998 come una procedura diagnostica nella dichiarazione di consenso Cystic Fibrosis Foundation (CFF)² e nel 2017 in linee guida diagnostico di consenso la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) ³. infatti, disfunzione CFTR biologica, che è la causa della fibrosi cistica, è testimoniata da un aumentato assorbimento di Na⁺ a membrana apicale e un difetto nella secrezione di Cl^– . Questo test funzionale offre il vantaggio di uno strumento di diagnosi aggiuntiva quando genetica è non conclusiva in pazienti con sudore intermedio indeterminato test risultati³. Anche se queste informazioni possono essere ottenute anche da biopsie intestinali di misurazione corrente (ICM), ICM è, tuttavia, solo disponibile in pochi centri a livello mondiale e maggiori esigenze di standardizzazione. NPD è più disponibile in circa 60 centri globali e, inoltre, gli obiettivi dell'epitelio respiratorio che è la sede principale della malattia.

Dato le informazioni che fornisce attività di CFTR, viene anche usato nella prova di studi volti a valutare il ripristino funzionale della proteina CFTR dal modulatore terapie^{4,5,6,7, 8}. Infatti, i dati dagli studi di CFTR mRNA/gene editing, potenziatore CFTR e terapie di correttore, evidenziano cambiamenti significativi in Cl^– e Na⁺ di trasporto con terapia^6,9 e conferma che il NPD può essere un reattivo endpoint in sperimentazioni cliniche. Come ci mancano punti finali clinici sensibili in grado di rilevare un sottile cambiamento dello stato clinico del paziente in tempi brevi, questo biomarcatore preclinico potrebbe essere altamente informativo. Campo delle terapie di modulatore CFTR allarga rapidamente e abbiamo urgente bisogno di prove in vivo che sono in grado di decifrare rapidamente composti attivi prima di andare a grande fase 3 prove¹⁰.

Il fisiologico razionale della tecnica si basa sulla misurazione della differenza di potenziale tra l'epitelio delle vie aeree nella narice e il compartimento sottocutaneo. Attività della scanalatura dello ione sono esplorati misurando la differenza di potenziale massima linea di base stabile (PD), suoi cambiamenti dopo blocco ENaC relativo assorbimento di Na⁺ e secrezione di Cl^– di guida via apicale Cl^– diversi trasportatori tra cui CFTR. Disfunzione CFTR è indicata da un cambiamento minimo in differenza di potenziale attraverso la stimolazione della secrezione di Cl^– attraverso una via cAMP dipendente e un'aumentata ENaC mediata assorbimento di Na⁺ come rilevato da una differenza di potenziale di previsione negativa e una risposta migliorata di amiloride. La base meccanicistica per CF contro PD normale è riassunto nella Figura 1.

Figura 1: riepilogo figura dell'attività del canale ionico. Agli ioni di (A) attività nel dimostrare epitelio respiratorio equilibrata attività di ENaC e CFTR in soggetti normali e (B) perdita di attività CFTR conseguente aumentato trasporto del sodio ENaC mediata e ridotto dipendente cloruro CFTR trasporto. ENaC: canale epiteliale del sodio, Na⁺: sodio, CFTR: regolatore del transmembrane di fibrosi cistica, CL^–: cloruro, mV: millivolt, PD: differenza di potenziale, min: minuti/s Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tuttavia, questo test dimostra un certo grado di variabilità sia a misure ripetute all'interno del paziente stesso e tra i pazienti con lo stesso genotipo. Questo è della massima importanza per facilitare l'interpretazione dei cambiamenti dopo il trattamento di modulatore. Inoltre, ci manca ancora convalidate soglie discriminare tra CF e soggetti sani. Ciò può essere parzialmente dovuto le differenze tra la disponibilità di strutture cliniche e le tecniche impiegate. Di conseguenza, un notevole sforzo internazionale finalizzato alla standardizzazione del test è in corso. Sia il noi CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network) ed ECFS-CTN (European Cystic Fibrosis Society-clinici prove Network) ha creato un NPD Procedure operative Standard (SOP) per l'uso nelle prove di ricerca e studio multicentrico. Questo recente lavoro collaborativo dal CTN e TDN ha provocato una SOP combinata, internazionale, che riunisce le competenze del CTN e TDN (2014)¹¹. Questa carta presenta le tecniche di protocollo e prova per impiegare NPD per diagnosi di CF o avviati studi di proof-of-concept. Ogni centro la tecnica di esecuzione è responsabile per l'applicazione al suo comitato di etica istituzionale ricerca umana per l'approvazione.

Figura 2: schema della intera NPD configurazione consigliata. Si noti che la configurazione consigliata è dimostrata, tra cui pompa di perfusione sequenziale e l'installazione di serie 4-fermata-gallo. Connessioni specifiche ed esempi di componenti sono mostrati nel SOP. (Diagramma modificato con il permesso di Solomon, G.M. petto, 2010¹³) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il flusso generale sperimentale è descritta nella Figura 2, per cui NPD è misurato tra il ponte di esplorare posizionato sul ponte epitelio di superficie e riferimento collocati nello spazio sottocutaneo, entrambe collegate con elettrodi e un'ad alta impedenza voltmetro.

Questo è assicurato da 2 sistemi differenti: ci sono 2 Setup di elettrodo di riferimento accettabile: (i) bilanciato Ag/AgCl elettrodi e un ponte di crema di elettrocardiogramma (ECG) collegato allo spazio sottocutaneo di leggera abrasione o (ii) saturato calomelano Semicelle e un agar riempito calibro 22 - 24 ago introdotto per via sottocutanea. Il contatto con la mucosa nasale è attivato da un catetere a doppio lume. Un lumen è riempito con agar o crema di ECG e collegato all'elettrodo di misura, l'altro permette di aspersione sulla mucosa nasale delle diverse soluzioni.

La punta del tubo di esplorazione viene posizionata sulla mucosa respiratoria sotto l'inferiore nasale dei turbinati (Figura 3).

Figura 3: posizionamento di esplorare tubi sulla mucosa respiratoria. Posizionamento di visualizzando Vista esterna (A). (B) Rhinoscopic vista dimostrando di posizionamento. Diagramma (C) che indica la posizione anatomica per il posizionamento del catetere. PD: differenza di potenziale

Per studiare la risposta del PD a parecchie droghe, le soluzioni di sopraffusione vengono applicate tramite il secondo lume del catetere. Ci sono diversi passaggi chiave per quanto riguarda la preparazione e lo svolgimento delle misurazioni di NPD, che sono descritte di seguito nel protocollo, dalla preparazione iniziale attraverso all'analisi dei dati.

Dopo la preparazione di soluzioni ed elettrodi, qualità adeguate prove di elettrodi e cateteri permette per la condotta di base del test. Misure basali sono effettuate lungo il turbinato, inferiore che consente di selezionare il posto migliore per la misura, solitamente che con la misura più negativa. Quindi le aspersioni sequenziale determinano Na⁺ (ENaC) e Cl^– flusso ionico (CFTR-dipendente) attraverso un cambiamento nella tensione attraverso l'epitelio nasale.

Protocollo

Il protocollo che coinvolga soggetti umani è stato approvato dal comitato di ricerca di tutti gli istituti partecipanti. Ogni centro la tecnica di esecuzione è responsabile per l'applicazione al suo comitato di etica istituzionale ricerca umana per l'approvazione.

1. soluzione preparazione

1. Preparare soluzioni #1, #2 e #3, che sono soluzioni di base, in lotti di 1L prima della procedura e memorizzati in loco (tabella 1).
   Nota: Amiloride è sensibile alla luce e deve essere conservato al buio (Vedi tabella 1 per la composizione della soluzione) (Vedi SOP per soluzione dettagliata preparazione¹¹).
   1. Tutte le soluzioni a pH 7.4 e filtro con una bottiglia-top filtro 0,22 µm di tampone.
   2. Per soluzione #3, aggiungere i sali contenenti fosfato in primo luogo, consentire loro di ionizzare per evitare la cristallizzazione (Vedi tabella 2 per la composizione della soluzione).
      Nota: La sequenza di miscelazione è fondamentale per la soluzione #3.
   3. Conservare queste soluzioni a 4 ° C (stabile per 3 mesi) o a-20 ° C (stabile per 6 mesi).
   4. Preparare soluzioni #4 e #5 aggiungendo agenti il giorno del test NPD. Isoproterenolo è luce e sensibili all'ossidazione e perde la sua attività a temperatura ambiente (dimostrando 4% decadimento oltre 4 h a 4 – 8 ° C). Conservare a 4 ° C.
      Nota: L'ATP è luce e ossidazione sensibile (Vedi tabella 3).

Composto	Peso molecolare	Concentrazione (mM)	Composizione (g/L)
NaCl	58	148	8,58
CaCl2 2 H2O	147	2.25	0,33
KCl	75	4,05	0.3
K2HPO4	174	2.4	0,42
KH2 PO4	136	0.4	0.05
MgCl2 6 H2O	203	1.2	0,24

Tabella 1: Composizione della soluzione.

Composto	Peso molecolare	Concentrazione (mM)	Composizione (g/L)
Gluconato di na	218	148	33,26
Gluconato di CA	430	2.25	0,97
Gluconato di K	234	4,05	0.95
K2 HPO4	174	2.4	0,42
KH2 PO4	136	0.4	0.05
MgSO4 7 H2O	246	1.2	0,24

Tabella 2: Composizione della soluzione.

Soluzione	La soluzione numero	Contenuto	Mark EDC
Iniezione di suonerie	Soluzione n. 1/A	Tamponata sonerie per iniezione	SUONERIE
Suonerie + amiloride	Soluzione n. 2/B	Tamponata suonerie + 100 μM amiloride	AMIL
Zero Cl– + amiloride	Soluzione n. 3/C	Tamponata zero Cl– + 100 μM amiloride	OCL
Zero Cl– + amiloride + isoproterenolo	Soluzione n. 4/D	Tamponata zero Cl– + 100 μM amiloride + 10 μM isoproterenolo	ISO
Zero Cl–, amiloride + isoproterenolo + ATP	Soluzione n. 5/E	Tamponata 100 μM amiloride + 10 μM isoproterenolo, zero Cl– + 100 μM ATP	ATP

Tabella 3: Elenco di soluzione.

2. catetere

1. Utilizzare un PVC, sterile, monouso, catetere a 2 lumi (Ø interno mm 0,7) con un'estremità rotonda e liscia (2,5 Ø mm esterno), che è specificamente progettata per NPD.
   1. Entrare in contatto con la mucosa di un foro laterale, 2 mm distante per la punta con un foro all'estremità per aspersione (Vedi punto 10.1).
   2. Collegare una delle due connessioni Luer-lock del catetere dell'elettrodo di misura e l'alla pompa di perfusione. Utilizzare il canale tinto in blu come il lume di misurazione. Tag il catetere a ogni intervallo di 0,5 cm per 10 cm.
      Nota: Lo spazio morto è 0,3 mL. È preferibile utilizzare la procedura sopra indicata per la preparazione del catetere, se questo non è possibile seguire i due passaggi successivi.
   3. Pari (~ 76 cm) lunghezze di tubo catetere PE50 e PE90 di taglio.
   4. Questi insieme a un pezzo di tubo in gomma silicone cm 1 appone. Inserire un 25 G punta smussata dell'ago snuggly nell'estremità opposta del tubo PE-90. Inserire un 25g butterfly needle snuggly l'estremità opposta del tubo PE50 facendo attenzione a non forare il tubo come è posizionato.

Figura 4: catetere utilizzato per misure di NPD. Scatola incasso dimostra la punta del catetere con foro di misura.

3. preparazione dell'Agar pelle Bridge (ago a farfalla) e catetere

Nota: La manipolazione dell'agar fuso può provocare ustioni, e questo dovrebbe essere fatto con cautela.

1. Preparare 3% agar con 3 g di agar con 100 mL di soluzione #1 in una bottiglia a bocca larga. Sciogliere l'agar nel microonde finché non solubile (trasparente).
   1. Riempire la siringa da 10 mL con agar caldo.
   2. Collegare successivamente la siringa, l'ago a farfalla (23 G) e il marcata lume del catetere. Iniettare l'agar finché viene visualizzata sulla punta.
   3. Lasciarlo raffreddare per almeno 10 min.
   4. Assicurarsi che il ponte di pelle ed il catetere sono completamente riempiti e visualizzati per essere privo di bolle d'aria.
   5. Memorizzare i ponti di pelle alla rinfusa in soluzione #1 a 4 ° C e non utilizzare dopo 1 settimana.

4. se crema Using ECG

1. Diluire la crema di ECG con la soluzione #1 (1:1, v/v della suoneria). Lasciate riposare fino a quando non è privo di bolle d'aria.
   1. Riempire la siringa da 10 mL con crema diluito di ECG.
   2. Collegare la siringa al lume del marcato del catetere e iniettare lentamente la crema di ECG, fino a quando non appare il foro sul lato inferiore.
   3. Assicurarsi che il catetere sia completamente riempito e privo di bolle d'aria.

5. sistema di acquisizione dati

Nota: La configurazione generale del sistema di acquisizione dati è illustrata nella Figura 5.

Figura 5: messa a punto di un sistema di acquisizione dati. Dimostrando collegamenti del bioamplifier e headstage dell'interfaccia computer così come i collegamenti di elettrodo al headstage¹¹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Connessioni
   1. Collegare il computer al sistema di acquisizione dati (Tabella materiali) con un cavo USB.
   2. Per collegare il sistema di acquisizione dati per il bioamplifier, è necessario collegare il cavo BNC da ingresso sul sistema di acquisizione dati (anteriore) per l'output su bioamplifier (indietro) del canale 1.
   3. Collegare il bioamplifier per l'headstage con un cavo personalizzato pre-collegato alle viti di headstage nella porzione di ingresso nella parte anteriore del bioamplifier.
   4. Collegare l'headstage per gli elettrodi e l'elettrodo di terra. Utilizzare connettori femmina-femmina standard di 2 mm per collegare la parte anteriore del headstage agli elettrodi.
      Nota: La porta è incassata e adatta solo una direzione del cavo mm 2: rosso-misura elettrodo al naso paziente (tramite catetere nasale); Elettrodo di nero-riferimento al ponte di pelle del paziente; Bianco all'elettrodo di ECG a terra per la pelle del soggetto.
   5. Impostare il bioamplifier come descritto: Offset: tirare per attivare, girare per regolare, lasciare tirato dopo la regolazione; Tensione: CC; 1 mV cal: posizione neutra; Potenza: Su per raccogliere dati, off per carica batteria; Guadagno: impostato su 10; Passa banda: LoFreq (pomello esterno): DC; Passa banda: HighFreq (manopola interna): 1kHz; Volume: Off.

6. regolazione dell'Offset di testa-fase

1. Collegare il portatile e l'amplificatore nella sequenza come indicato nei SOP¹¹. Accendere il sistema di acquisizione dati e poi il portatile (la sequenza è importante per il software di riconoscere l'apparecchio utilizzato per l'acquisizione dati).
   1. Regolare l'Offset di testa-fase secondo la sequenza di SOP.

7. offset

Nota: Esistono diversi offset deve essere controllato per garantire la stabilità del sistema elettrico di misura. (vedere la Figura 6)

1. Per l'Offset dell'elettrodo, posizionare l'elettrodo di riferimento (negativo) e l'elettrodo di misura (positiva) insieme alla crema diluita di ECG o il 3 M KCl. garantire che la differenza di potenziale tra gli elettrodi è vicino a zero sull'headstage.
   1. Per impostare l'offset di ponte catetere e/o pelle, posto alla fine di Luer-lock del catetere nasale o alla fine di Luer-lock del ponte della pelle nel bagno con l'elettrodo di misura (positiva). Inserire l'altra estremità del catetere nel ECG crema bagno o 3M KCL contenente l'elettrodo (negativo) di riferimento per garantire che la differenza di potenziale è vicino a zero sull'headstage.
   2. Per impostare un offset di ciclo chiuso, assicurarsi che il circuito sia chiuso quando si sostituisce il catetere nasale nel bagno degli elettrodi. Controllare che il circuito chiuso offset letture vicino a 0 mV (= 'offset'; ± 2,5 mV). Regolare la manopola di offset headstage per portare l'offset a 0 mV.
      Nota: Questo conferma che tutte le connessioni all'interno del circuito sono intatte. Se questo non è il caso, il catetere nasale potrebbe non essere intatto (bolle in agar o la crema di ECG di aria). Cambiare il ponte di agar o spingere la crema ECG nel setup. L'offset dell'elettrodo deve essere eseguita in primo luogo, seguito dal chiuso sistema (ciclo chiuso offset) con l'elettrodo e il ponte (Figura 6).

Figura 6: Offset di installazione di elettrodo offset di (A), (B) catetere (o ponte), (C) loop chiuso offset.

8. siringa set-up

Nota: Di seguito è la configurazione consigliata.

1. Scongelare soluzioni #1, #2 e #3 circa 1 h prima della misurazione.
   1. Collegare il tubo di prolunga al rubinetto più vicino al catetere.
   2. Accendere tutte le pompe e lavare il catetere con soluzione #1 per svuotare completamente il catetere fino a quando i rubinetti sono chiari di bolle.

9. posizionamento di riferimento e misura elettrodo

Figura 7: Soggetto con elettrodo e sottocutaneo ponte pronto per misurazioni di misurazione.

1. Sono l'oggetto di studio a prendere posizione seduta rivolto verso l'operatore NPD. Per un maggiore comfort, posto piedi sul tappetino antistatico opzionale e la testa sul resto di mento di ortottica.
   1. Collegare l'elettrodo di piombo di terra al pad ECG immessi sul braccio del soggetto (Figura 7).
   2. Inserire l'ago sottocutaneo avambraccio dorsale (sistema di agar) o applicare l'elettrodo di riferimento all'ECG crema su un'area precedentemente minimamente abrasa sull'avambraccio (cfr. punti 7 attraverso a 10 qui sotto).
   3. Controllare il collegamento nello spazio sottocutaneo misurando la differenza di potenziale con la pelle (dito PD) e chiedendo al soggetto di chiudere il "foro misura" pizzicando il catetere tra la punta del suo pollice e indice.
   4. Se il PD dito non è -30 mV o più negativo, verificare l'inserimento dell'ago farfalla. Ripetere l'abrasione (per set-up ECG crema) e verifica ponti.
   5. Avviare la pompa a siringa soluzione #1 a 80 mL/h. Start con la narice destra.
   6. Misurare il PD dito come una costante tensione negativa (tipica gamma da -40 a -80 mV).
   7. Se si utilizza il sistema di crema ECG: diluire la crema di ECG 1:1 e riempire il catetere dopo uno svuotamento completo fuori dal foro di sonda come già visto per l'Agar.
   8. Collegare il catetere per una siringa da 50 mL riempito a metà con la crema di ECG per fare il bagno gli elettrodi, consentendone la verifica degli offset dell'elettrodo e il ponte fuori set.
   9. Collegare il riferimento Ag/Cl elettrodo nello spazio sottocutaneo di leggera abrasione minima precedente della pelle, la pelle apparirà 'rosa e splendente' quando viene raggiunto il livello del derma.
   10. Posizione dell'elettrodo di misura, ricoperto di crema di ECG, sulla pelle abrasa. Verifica il dito PD come precedentemente indicato per il sistema di Agar.

10. misurazione del PD basale

1. Inserire il catetere nasale nella narice destra utilizzando un rhinoscope illuminante (o equivalente) per visualizzare il turbinato inferiore. Utilizzando la punta anteriore come un punto di riferimento, far avanzare il catetere targeting per sito inferiore del turbinato sulla mucosa respiratoria inferiore. In alternativa, se il posizionamento è difficile, il foro della sonda può essere posizionato a contatto con il pavimento della narice.
   Nota: Il catetere è abbastanza rigido per essere guidati nella narice dall'operatore. Per agevolare il posizionamento, un canale del catetere è colorato in blu e contiene il foro di sonda sul lato a contatto con il turbinato inferiore. Questo impedisce la rotazione del catetere. I marchi indicati sul catetere da 1 a 10 cm forniscono punti di riferimento facile.
   1. Misurare il PD presso il turbinato inferiore. Per questo scopo, assicurarsi che il foro misura del catetere è chiuso dalla relativa posizione contro la mucosa del Turbinato inferiore (contrassegno basale a destra).
   2. Misurare il PD a 3.0, 2.0, 1.5, 1,0 e 0,5 cm (distanza all'interno del meatus inferiore dal Turbinato inferiore): contrassegnare PDs basale destra.
   3. Mantenere ogni misura alla distanza specificata per circa 5 s ciascuno per garantire una lettura costante (± 1 mV) e per facilitare la corretta interpretazione dei valori basali di PD.
   4. Ripetere i passaggi precedenti nella narice sinistra, utilizzando il tasto funzione per contrassegnare il PDs basale sinistra (3 cm, 2cm, ecc.) e la sinistra basale a.
   5. Utilizzando basale PD misure come guida, inserire la sonda del catetere nasale per il sito di segnale più negativo (fino a 3 cm dalla punta anteriore del turbinate nasale inferiore) e sicuro con un piccolo pezzo di nastro sulla punta del naso (o equivalente).

11. analisi sequenziale aspersioni di NPD

1. Per la narice destra
   1. Verificare che la soluzione sta gocciolando dal naso del paziente. Avere il soggetto assumere una posizione comoda con la loro testa verso il basso (spesso aiutato da avere il soggetto riposare la testa, sulla loro mano o utilizzare un chinrest o altro dispositivo di immobilizzazione). Ricordare il soggetto a ridurre al minimo il movimento ed evitare di toccare il naso o il tubo e per evitare di parlare.
   2. Girare la soluzione #1 pompa (suonerie) su (5 mL/min, o 300 mL/h). Registrare fino ad ottenuta un valore stabile (< 1 mV cambiamento/30 s).
      Nota: Questo richiede circa 3 minuti per raggiungere la stabilità.
   3. Disattivare la perfusione con soluzione #1.
   4. Iniziare la perfusione con soluzione #2 (Amiloride). Registrare NPD per un minimo di 3 minuti (se la tensione di altopiano è in dubbio, continuare la registrazione per fino a 5 min in totale).
   5. Iniziare la perfusione con soluzione #3 (cloruro di Zero). Registrare NPD per un minimo di 3 minuti (se la tensione di altopiano non è stabile, continuare la registrazione per fino a 5 min in totale).
   6. Iniziare la perfusione con soluzione #4 (isoproterenolo). Registrare NPD per un minimo di 3 min [se la tensione di altopiano non è stabile (una traccia di tensione costante per almeno 30 s di < 1 mV deriva), continuare la registrazione per fino a 5 min totale].
   7. Iniziare la perfusione con soluzione #5 (ATP). NPD record per un minimo di 1 min, fino ad ottenuta un picco hyperpolarizing risposta.
   8. Accendere la perfusione con la soluzione #1 (suonerie) e lasciare 30 s per irrorare il catetere.
   9. Disattivare la perfusione di soluzione #1.
   10. Ripetere la procedura per la narice sinistra.

12. fine del Test

1. Ricontrollare e registrare stabile dito PD («Post dito») per 5 s.
   1. Rimuovere il ponte cutaneo del soggetto e la fasciatura dal sito inserimento sulla pelle. Per il sistema di crema di AgCl/ECG, è necessario rimuovere l'elettrodo dal braccio.
   2. Registrare la tensione "Finale Offset di Loop chiuso" come descritto per misurare l'offset iniziale ciclo chiuso (Vedi punto 7.1.3).
   3. Offset finale di Mark con il tasto funzione.
   4. Smettere di acquisizione dati (premere "Avvia"").
      Nota: L'attuale SOP raccomanda l'uso di 100 µM ATP per attivare purinergic calcio dipendenti dalla secrezione di Cl^– , per servire come controllo positivo per il test; Tuttavia, questo è un test facoltativo.

Risultati

Negli epiteli delle vie respiratorie normali, Na⁺ assorbimento è l'attività di trasporto di ioni primari. In questo modo una differenza di potenziale negativo delle vie aeree superficiali per quanto riguarda l'interstizio. Aspersione dell'ENaC channel blocker amiloride conduce ad una differenza di potenziale meno negativa. Quindi, superfusione di Cl^–-soluzione gratuita crea un gradiente chimico per Cl^-, che crea una differenza di potenziale più negativa e attiva tutti i trasportatori di Cl^– , tra cui CFTR. Isoproterenolo, che aumenta di cAMP intracellulare, ulteriormente aumenta la secrezione di Cl^– attivando specificamente CFTR ed aumenta la differenza di potenziale.

Al contrario, nei soggetti CF, assente o disfunzionale CFTR risultati in un aumento ENaC mediata Na⁺ assorbimento¹². Di conseguenza, la differenza di potenziale della linea di base è più negativa. La depolarizzazione osservata con applicazione di amiloride è più grande, considerando che non c'è minimo o nessun cambiamento nella differenza potenziale attraverso la stimolazione della secrezione di Cl^– attraverso percorsi dipendente CFTR. Questo può essere visto nei rappresentante tracciati in Figura 8, mostrando vs 'sano' tracciati 'CF'.

Figura 8: tracciati di rappresentante del soggetto 'sano' e il soggetto con CF PD: differenza di potenziale, ΔAmiloride: delta amiloride, Cl 0^–/ISO^–: basso cloruro: il cambiamento nel PD tra completamento della soluzione #2 e #4 soluzione perfusione, S1-S4: linea verde di fasi 1-4, nei grafici A e B indicano la traccia di NPD e nero le frecce indicano la differenza di differenza di potenziale

Discussione

In vivo, NPD fornisce una misurazione uniche che possa essere eseguita ripetutamente su base longitudinale e dimostra che con misure ripetute, simili risultati longitudinali sono osservate su una base individuale e group-wise^{14, 15}. C'è forte evidenza che la NPD ha validità di eccellente discriminazione per distinguere CF da non CF. 25 studi ha dimostrato costantemente una differenza statisticamente significativa nella Cl^– e Na⁺ conduttanza tra pazienti CF e controlli sani¹⁰. Mentre parecchi indici precedentemente sviluppati dimostrano questa capacità, possiamo anticipare che sono necessari nuovi aggiornamenti dato recente standardizzazione della metodologia^7,8.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi

Questo test richiede diversi passaggi chiave per assicurare misure accurate. Questo include l'offset del ciclo chiuso elettrodi e cateteri per garantire che il sistema sta eseguendo a norme raccomandate. I pazienti devono rimanere fermi e astenersi dal parlare come questo riduce al minimo gli artefatti e dislocazione del catetere. Questo rende il test difficile in pazienti non cooperativi e la tecnica è stata segnalata soltanto in uno studio nei bambini sotto i 6 anni di età⁷.

Pre-ispezione dell'epitelio nasale è necessario garantire che non esistono croste o muco sull'epitelio, che può influire sulle misurazioni.

Cosa molto importante, si deve sottolineare che la posizione del posizionamento del catetere è oggetto di dibattito. Il SOP qui presentato utilizza misura sotto il turbinato inferiore (IT). Il posizionamento del catetere sotto esso è stato standardizzato e condotto nei trials multicentrici e, di conseguenza, questa è la tecnica consigliata. Misura sotto l'IT viene eseguita con il catetere foro laterale, che può essere difficile da mantenere in costante contatto con la mucosa nasale, pur essendo a contatto con le soluzioni. Altri gruppi possono misurare il PD al piano nasale, che è tecnicamente più facile. D'importanza, Vermeulen (2011) hanno dimostrato che i 2 metodi sono comparabili¹⁶.

Il riscaldamento delle soluzioni rimane un aspetto del dibattito tra europei e centri statunitensi^17,18. Esso è stato sostenuto che l'utilizzo di soluzioni a 37 ° C invece di 22 ° C aumenta la risposta osservata cloruro totale di circa il 25% e la risposta di isoproterenolo-dipendente cloruro di circa 95%¹⁸. Tuttavia, il riscaldamento aumenta la variabilità, come valutato da una deviazione standard più grande del cloruro totale risposta¹⁷. Pertanto, come le soluzioni di riscaldamento sono un fattore aggiuntivo di variabilità, si consiglia di non scaldare le soluzioni se non richiesta su una base di studio.

In precedenza abbiamo confrontato sia delle tecniche dell'elettrodo e trovato che sistemi di elettrodi di AgCl sia calomelano operati allo stesso modo nelle correnti basale e stimolate in soggetti normali¹³.

Limiti della tecnica

Questo test è soggetto a variabilità significativa entro-oggetto. La variabilità di scoring è particolarmente prevalente in pazienti con tracciati indeterminati e questo deve essere contabilizzato in applicazione diagnostica¹⁹. Fattori di variabilità includono infezione acuta del tratto respiratorio superiore, ampi polipi nasali, chirurgia del seno prima e infiammazione relativa CF, che diminuiscono la sua specificità e sensibilità^20,10. Inoltre, interpretazione dei tracciati può essere differenti tra i lettori, anche se i lettori esperti dimostrano accordo eccellente di scoring quantitativo e interpretabilità in CF e non CF tracciamenti, a contrasto con una significativa variabilità nella fiducia del traccia¹⁹.

Variabilità intrinseca contro soglie significative

Cosa molto importante, la fisiologica variabilità della misurazione è considerevole, come illustrato in diversi studi¹⁰, quali le prove di terapia del gene CFTR che ha dimostrato una notevole variabilità nei cambiamenti nel trasporto totale del cloruro e Amiloride gamma^21,22. Valutazione della sezione trasversale suggerisce che zero Cl^– plus isoproterenolo risposta sopra la soglia di -5 a -7 mV è il cut-off tra CF e non CF soggetti¹⁰.

Ci manca tuttavia la chiara conoscenza circa l'entità della variazione di questo parametro, che rappresenta un'efficace correzione di CFTR in studi di fase II con terapie di modificazione di malattia. Per valutare la risposta individuale, ripetuti test di monitoraggio della risposta ad un intervento potrebbe essere necessario distinguere cambiamenti significativi da variabilità intrinseca. Cosa molto importante, studi futuri a lungo termine con farmaci malattia devono dimostrare che il miglioramento nella funzione CFTR correla con miglioramento clinicamente rilevanti risultati o gli esiti surrogati (come miglioramento in FEV₁) del CF malattia. Infatti, una fase recente studio II Ivacaftor ha dimostrato contrassegnato beneficio clinico nonostante un piccolo miglioramento nel cloruro secrezione²³.

Tali studi aiuteranno a stabilire se un valore di cut-off di miglioramento nella conduttanza Cl^–trans-epiteliale potrebbe essere un parametro surrogato per il beneficio clinico. Questo sarebbe un parametro importante per orientare lo sviluppo di CFTR modificando terapie.

Significato per quanto riguarda i metodi esistenti: Sweat Test e misurazioni di corrente intestinale (ICM)

In pazienti con fibrosi cistica ' discutibile ', come valutato da un sudore intermedio Cl^– concentrazione tra 30 e 60 mM, i punteggi compositi di NPD forniti uno strumento altamente sensibile per diagnosticare i pazienti come 'CF-probabile ' e ' CF-improbabile '¹⁰ . Misura corrente intestinale (ICM), che fornisce una misurazione ex vivo della Cl netti^– flussi attraverso l'epitelio rettale, consente anche la determinazione della funzione CFTR residua con un'alta sensibilità perché CFTR è altamente espresso in Questo epitelio.

Considerando la modifica della funzione CFTR da modulatori CFTR, la relazione tra queste diverse modifiche di biomarcatore CFTR è attualmente poco chiaro. Anche se recenti lavori basato su Ivacaftor determinato che prova NPD e sudore sono correlati⁴, non è ancora stato stabilito se una misurazione nelle vie respiratorie è un migliore preannunciatore di risultato respiratorio rispetto, ad esempio, il sudore test^{24 , 25} o il cambiamento di ICM. Inoltre, farmaci modificatore possono anche differire in loro efficacies specifico organo. Per quanto riguarda la NPD, è importante notare che cambia in risposta PD e amiloride basale express trasporto Na⁺ , mentre cambiamenti nella risposta di isoproterenolo e Cl 0^{– –} Cl trasporto express. È ancora da stabilire quale di questi è più importante per il miglioramento della malattia.

Futura applicazione di questa tecnica

L'uso di questa tecnica è previsto all'esterno del campo CF. Poiché questa tecnica è particolarmente adatta per dimostrare Na⁺ e Cl^– canale ionico, può essere applicato per dimostrare la disfunzione in malattie vie aeree compreso asma²⁶, bronchite cronica²⁷, bronchiectasie non CF²⁸ e pancreatite ricorrente²⁹. Inoltre, le modifiche di questa tecnica sono state utilizzate nelle vie aeree inferiori (LAPD) per dimostrare la disfunzione CFTR airways-messa a fuoco più bassa nei pazienti di malattia polmonare ostruttiva cronica (BPCO) con bronchite cronica³⁰.

NPD fornisce un biomarcatore sensibile in vivo della funzione CFTR, che può essere utilizzato per la diagnosi di entrambi e, inoltre, per gli studi di proof-of-concept che mira a correggere CFTR ed ENaC canale attività di ricerca traslazionale. Questo permette la valutazione longitudinale della funzione trans-epiteliale e promettente come una strategia per la medicina personalizzata adattare il correttore più efficiente per ogni paziente con CF.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pompa per infusione KD Scientific (o equivalente, come le pompe per infusione programmabili fornite dall'istituto/ospedale)	Fisher Scientific
Powerlab 4/30	AD Instruments
BMA-200 AC/DC bioamplificatore portatile	AD Instruments
Stadio di isolamento IS0-Z per BMA-200	AD Instruments
PC compatibile con Windows - Requisiti minimi di Windows XP o superiore	Vari
software AD Instruments: GLP Client V6 (Windows) o superiore	Elettrodo ECG AD Instruments
(messa a terra per il soggetto dello studio)	Standard ospedaliero
2 elettrodi di riferimento al mini calomelano	Fisher Scientific	13-620-79
Cloruro di potassio KCl, granulare – USP, peso formula 76, quantità: 500 g Spectrum
Contenitore sterile (come contenitore per la raccolta dei campioni o simili) da utilizzare per il bagno di calomelano KCl, con fori tagliati nel coperchio per tenere gli elettrodi in posizione. (Se non fornito dal produttore dell'elettrodo.)	Standard ospedaliero
2 elettrodi: Ag/AgCl 8 mm TP	elettrodo BIOPAC Systems	UNSHLD-EL258
2 elettrodi Ag/AgCl, B0194, spina 4 mm	SLE Instruments
Crema per elettrodi conduttivi	Fisher Scientific	Parker Labs ref # 17-05
Dispositivo per l'abrasione della pelle	PROMED Feeling	Ref 374901
Hi Di 541 M, Frese dentali con punta di diamante	Ash Instruments
Becton Dickinson Tubi PE 50	Fisher Scientific	427411
Becton Dickinson PE 90 tubi	Fisher Scientific	427421
Tubo Silastic, 0,062" ID, 0,095" OD	Fisher Scientific	508-007
Micropore Nastro chirurgico di carta (25 mm x 9,1 m)	3M	1530-1
Marquat catetere a doppio lume Lunghezza: 80 cm; Diametro esterno: 2,5 mm; Diametro interno dei canali: 0,8 mm; Distanza dei fori laterali dalla punta: 2 mm. Etichetta UE Accordo per NPD: I0202US	Marquat	I0202US
nastro di seta da 1" X 10 iarde	3M Durapore	1538-1
IV (30", 50/scatola)	International Limited	IMN30
Rubinetto a tre vie (50/scatola)	Medex	MX5311L
Filtri per siringhe sterili (ANOTOP 25 sterile 50 pk; 0,22-μ m o più piccoli filtri; Fisher	Scientific	09-926-7
Adattatore per tronchetto Luer Intramedic Becton Dickinson (20 G, per il collegamento a PE90 se si utilizza un catetere nasale prodotto nel sito di studio)	Fisher Scientific	427564
Becton Dickinson 23 G, 0,75" Vacutainer (" farfalla") aghi (0,6 mm x 19 mm; 50 U/scatola) (per il collegamento a PE50) se si utilizza un catetere nasale prodotto nel sito dello studio)	Fisher Scientific	367283
Siringa Becton Dickinson 60 mL senza ago Punta Luer-Lok (40/scatola)	Fisher Scientific	309653
Siringa Becton Dickinson 10 ml senza ago Punta Luer-Lok (100/scatola)	Fisher Scientific	309604
Salviette sterili monouso (in base alla disponibilità istituzionale)	Standard ospedaliero
70% EtOH (1 pinta), numero di catalogo Aaper Alcohol and Chemical Co. NC9274019 (o equivalente)	Filtri
Corning, 0,22 &; m dimensione dei pori (0,15 - 1,0 L volumi accettabili)	Fisher Scientific	430624
Buffer Cert Ph 10,00 (1 L Sn04332) – per la calibrazione del pHmetro	Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 4.00 (1 L Sn04327) – per la calibrazione del pHmetro	Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 mL Sn04328) – per la calibrazione del pHmetro	Fisher Scientific
Sottosponde monouso (Blue Pads; 23" x 36" 150/Box; o equivalente secondo lo standard ospedaliero)	SureCare
23 G, 0,75" Vacutainer " farfalla" aghi (0,6 mm x 19 mm; 50 U/scatola)	Becton Dickinson	367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100 g 0142-15-2; o equivalente)	Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (o equivalente)	Fisher Scientific
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (o equivalente) O Otoscopio con batteria	Fisher Scientific
Poggiatesta e mentoniera (o equivalente; opzionale)	Richmond Products, Inc	629R
Tappetino anti-fatica dissipativo statico  (o equivalente)	Fisher Scientific	No. 791
REAGENTI PER SOLUZIONI MISCELATE IN SITO
Cloruro di sodio, granulare – USP NaCl	Spectrum		Formula Peso: 58; Formato: 500 g di
cloruro di calcio CaCl2 • 2H2O – USP	Spectrum		Formula Peso: 147; Dimensioni: 500 g di
cristallo di cloruro di magnesio esaidrato, MgCl2• 6H2O – USP	Spectrum		Formula Peso: 203; Dimensioni: 500 g di
fosfato di potassio bibasico, anidro, granulare, KH2PO4 – USP	Spectrum		Formula Peso: 174; Dimensioni: 500 g
di cristalli monobasici di fosfato di potassio NF (KH2PO4)	Spettro		Formula Peso: 136; Formato: 500 g
di gluconato di sodio - USP (sale monosodico)	Spettro		Formula Peso: 218; Formato: 500 g di
gluconato di calcio USP (polvere anidra)	Spectrum		Formula Peso: 430; Dimensioni: 500 g di
gluconato di potassio - USP (anidro)	Spettro		Formula Peso: 234; Dimensioni: 500 g di
solfato di magnesio eptaidrato USP MgSO4• 7H2O	Spettro		Formula Peso: 246; Formato: 500 g di
Amiloride HCl USP	Spectrum		Formula Peso: 302; Dimensioni: 5 g di
adenosina 5'-trifosfato (ATP) (sale disodico)	Peso della formula dello spettro		: 551; Dimensioni: 5 g di
cloruro di magnesio, esaidrato, cristallo USP MgCl2• 6H2O	Spettro		Formula Peso: 203; Dimensioni: 500 g
di acqua bidistillata (ddH2O)	Formula della farmacia		Peso: NA; Dimensioni: 1 L
di isoproterenolo HCL Iniezione - USP 1 mg/5 mL di fiala	Formula Farmacia Ospedaliera		Peso: 248; Dimensioni: monouso
Ringers Injection, USP o Ringers Irrigation	Hospital Pharmacy		Formula Peso: NA; Formato: 5 L