L'obiettivo del presente protocollo è quello di stabilire ex vivo Drosophila cultura larvale cervello ottimizzato per monitorare i ritmi circadiani molecolari con formazione immagine di time-lapse fluorescenza a lungo termine. L'applicazione di questo metodo a dosaggi farmacologici inoltre è discussa.
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Articolo metodologico
Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il circuito di stimolatore cardiaco circadiano Orchestra ritmiche uscite comportamentali e fisiologiche, coordinate con segnali ambientali, ad esempio cicli giorno/notte. L'orologio molecolare all'interno di ogni neurone di pacemaker genera i ritmi circadiani nell'espressione genica, che sottendono le funzioni neuronali ritmiche essenziali per il funzionamento del circuito. Indagine delle proprietà di singoli oscillatori molecolare in diverse sottoclassi di neuroni pacemaker e la loro interazione con la segnalazione di un neurone produce una migliore comprensione del circuito stimolatore cardiaco circadiano. Qui, presentiamo un approccio di time-lapse microscopia fluorescente sviluppato per monitorare l'orologio molecolare in neuroni di orologio di coltura della drosofila larvale cervello. Questo metodo permette la registrazione di multi-giorno dei ritmi di reporter circadiano fluorescenti geneticamente codificato a cella singola risoluzione. Questa configurazione può essere abbinata a manipolazioni farmacologiche per analizzare da vicino risposta in tempo reale dell'orologio molecolare di vari composti. Oltre i ritmi circadiani, questo metodo multiuso in combinazione con potenti tecniche genetiche di Drosophila offre la possibilità di studiare diversi processi neuronali o molecolari in tessuto cerebrale dal vivo.
Introduzione
Orologi circadiani aiutano gli organismi ad adattarsi ai cambiamenti ambientali periodici generati dalla rotazione della terra 24 h. I cicli di feedback trascrizionale traslazionale interbloccata comunemente sono alla base di macchine molecolari della orologi circadiani attraverso specie1. Il circuito di stimolatore cardiaco circadiano composto contenente orologio neuroni integra time-of-day informazioni veicolate dagli stimoli ambientali, come luce/buio (LD) e cicli di temperatura, di orchestrare i ritmi di una pletora di quotidiano fisiologico e processi comportamentali2,3. Il coordin....
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Protocollo
1. preparazione delle soluzioni madri sotto una cappa di cultura
- Preparare 400 mL di 1x Schneider mezzo attivo (SAM), ottimizzato per ex vivo cultura dei cervelli larvali (modificato da riferimento24,25) (tabella 1). Aliquota di 5 mL e flash congelamento in azoto liquido (LN2), conservare a - 80 ° C.
- Preparare soluzione salina dissecante (DSS): 1x diluendo 10 x soluzione madre (modificato dal riferimento26) (tabella 2).
- Aliquota fibrinogeno a 10 mg e conservare a 4 ° C per un uso singolo.
Attenzione: ....
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Risultati
Qui, vi mostriamo i risultati rappresentativi della registrazione a lungo termine di un reporter fluorescente circadiano in ex vivo larvale cervello cultura e i risultati di imaging dal vivo di applicazione bagno PDF sull'espressione di reporter.
Non vagare le larve L3 esprimendo l'orologio molecolare reporter PER-TDT e UAS-mCD8::YFP guidato da un conducente di neurone orologio Clk 856-gal4 (
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Discussione
Qui abbiamo descritto il metodo per lungo termine microscopia di fluorescenza time-lapse di cervelli larvale coltivate. Il successo di questo tipo di esperimenti dipende da molteplici fattori, come la salute della cultura, metodo per immobilizzazione del espianto del cervello, l'intensità di fluorescenza e rapporto segnale-rumore del reporter, temporale e risoluzione spaziale, e accessibilità per l'espianto. Questi fattori possono essere mutuamente esclusivi. Ad esempio, aumentando la frequenza time-lapse colpisce la sal.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Michael Rosbash per suo tutoraggio e supporto durante la fase iniziale dello sviluppo di questo metodo. Questo lavoro è stato finanziato dal programma JST PRESTO, la Swiss National Science Foundation (31003A_149893 e 31003A_169548), il Consiglio europeo della ricerca (ERC-StG-311194), Novartis Foundation for Medical-Biomedical Research (13A39) e l'Università di Ginevra .
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Non sono sicuro che siano esattamente gli stessi che abbiamo in laboratorio. Ho scelto "adatto per la coltura di cellule di insetti" quando disponibile |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucosio | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Estratto di lievito | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillina-Streptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Acido malico | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trealosio diidrato | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Acido succinico | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Acido fumarico | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Acido chetoglutarico | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Siero fetale di vitello (FCS) non inattivato a caldo Screening di micoplasmi e virus | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E& K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogeno da plasma bovino | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | ATTENZIONE: Nocivo per inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Manipolare sotto flusso laminare |
| Trombina da plasma bovino | Sigma-Aldrich | T9549 | ATTENZIONE: Pericolo per la salute, utilizzare guanti |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | su misura | |
| Sigma-Aldrich | 18405 | ||
| Piatto da 35 mm, n. 1.5 Vetrino coprioggetti, diametro vetro 20 mm, non rivestito | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Piastre per colture tissutali | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP Filtro filettato per bottiglia da 33 mm, 0,22 &; m | Millipore | SCGPS05RE | |
| Film in politetrafluoroetilene (PTFE) | Dupont | 200A Teflon FEP | |
| Film Millex-HV Unità filtro siringa, 0,45 µ m, PVDF, 33 mm, sterilizzato a raggi gamma | Millipore | SLHV033RS | |
| Unità filtro per siringa Millex-GV, 0,22 µ m, PVDF, 33 mm, sterilizzato a raggi gamma | Millipore | SLGV033RS | |
| Piatto di dissezione in vetro a tre pozzetti | Qualsiasi azienda | ||
| Pinza fine, misura 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Scanner tandem Microscopio confocale TCS SP5 invertito, con scanner risonante e rivelatori fotomoltiplicatori HyD Microsystem | Leica CMS GmbH | ||
| Camera di controllo della temperatura | Servizi di imaging Life | Il CUBE & Sistema di controllo della temperatura BOX, progettato | |
| Regolatore di umidità da palco | Life Imaging Services | ||
| acqua: erogatore, micropompa estesa serie MP6 e software di controllo dell'obiettivo a immersione automatica | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Creazione di stack SUM e plug-in per la deriva della correzione 3D | Software | ||
| ImageJDeconvoluzione iterativa 10x | AutoQuant e Imaris |
Riferimenti
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol.
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Ristampe e permessi
