Meccanismi epigenetici sono frequentemente alterati nei gliomi. Immunoprecipitazione della cromatina poteva essere utilizzati per studiare le conseguenze delle alterazioni genetiche in glioma risultanti dalle modifiche in modificazioni istoniche che regolano la trascrizione di gene e la struttura della cromatina. Questo protocollo descrive immunoprecipitazione della cromatina nativo su neurosfere tumore del cervello murino.
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Articolo metodologico
Immunoprecipitazione della cromatina nativo utilizzando neurosfere tumore del cervello murino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Modificazioni epigenetiche possono essere coinvolti nello sviluppo e nella progressione del glioma. Cambiamenti nella metilazione e acetilazione dei promotori e regioni regolatorie di oncogeni e soppressori tumorali possono condurre ai cambiamenti nell'espressione genica e svolgono un ruolo importante nella patogenesi dei tumori cerebrali. Immunoprecipitazione della cromatina nativo (ChIP) è una tecnica popolare che permette la rilevazione di modifiche o altre proteine strettamente legate al DNA. Contrariamente a reticolato ChIP, chip nativo, le cellule non sono trattate con formaldeide per collegare covalentemente proteina al DNA. Questo è vantaggioso perché a volte reticolazione può fissare le proteine che solo transitoriamente interagiscono con il DNA e non hanno significato funzionale nella regolazione genica. Inoltre, gli anticorpi vengono generalmente sollevati contro peptidi non fissati. Di conseguenza, specificità dell'anticorpo è aumentata di ChIP nativo. Tuttavia, è importante tenere a mente che è applicabile per studiare gli istoni o altre proteine che legano strettamente al DNA solo ChIP nativo. Questo protocollo descrive l'immunoprecipitazione della cromatina nativo su neurosfere tumore del cervello murino.
Introduzione
Eventi epigenetici sono frequenti nei gliomi e probabilmente svolgono un ruolo importante nella patogenesi del tumore. Infatti, in pediatric glioma di alto grado, mutazioni in geni codificanti varianti istone H3.3 e H3.1 si verificano frequentemente1. Le mutazioni riguardano modifiche istoniche e presentano importanti conseguenze epigenetici2,3. Nell'adolescente adulto dello spettro, ricorrenti mutazioni nel gene della Isocitrato deidrogenasi 1/2 (IDH1/2), una mutazione che inibisce la α-KG dipendente degli istoni e DNA de-methylasaes e le alterazioni genetiche in altri regolatori della....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.
1. generazione di tumore cerebrale NS e condizioni di coltura.
- Preparare mezzo di cellule staminali neurali (NSC) con supplemento per volta Eagle Medium/F12B27 (1x) di Dulbecco, supplemento N2 (1x) e un reagente di antimicrobici. Supplemento media NSC il giorno di utilizzo con fattore di crescita endoteliale ricombinante umano (EGF) e basic-fibroblast growth factor (FGF) ad una concentrazione finale di 20 ng/mL.
- Indurre il tumore di cervello in mouse utilizzando il sistema di trasposone Sl....
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Risultati
Una rappresentazione schematica del tumore NS generata da un tumore al cervello dove le cellule del tumore di cervello sono Katushka positivo è presentata nella Figura 1. Figura 2 è una rappresentazione schematica della tecnica ChIP intera. Figura 3 Mostra i risultati rappresentativi della cromatina da tumore cerebrale NS digerito con MNase per 12 min, ottenendo una maggioranza di mono, di- e tri-nuc.......
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Discussione
Il protocollo presentato qui consentirà all'utente di eseguire ChIP nativo su NS derivate da tumori cerebrali geneticamente. A differenza di cross-linking ChIP, questo protocollo è limitato per lo studio delle proteine che associano strettamente con DNA6. Il numero di celle utilizzate possa essere modificato come necessario e il protocollo può essere scalato. Abbiamo usato 1 X 106 cellule per IP, tuttavia, ChIP nativo può essere effettuata anche con appena 4 x 104 cellule
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da istituti di salute nazionale Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS/NIH) sovvenzioni R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 a m.g.c.; NIH/NINDS concede R01-NS076991, R01-NS082311 e R01-NS096756 al Domaine; NIH/NINDS R01-EB022563; il reparto di neurochirurgia; Di Leah Happy Hearts e Chad Fondazione ma a m.g.c. e Domaine RNA biomedicina Grant F046166 a m.g.c. f.m.m. è supportato da un F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. è supportata dal NIH / NIGMS grant 5T34GM007821-37.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bioanalizzatore Agilent 2100 Bioanalizzatore | Agilent | G2946-90004 | |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerato | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 topo |
| Cloruro di calcio | Aldrich | 22350-6 | reagente tampone |
| D-Luciferina, Sale di potassio | Goldbio | LuckK-1g | |
| Cremagliera magnetica DiaMag1.5 | Diagenode | B04000003 | per lavaggi di biglie magnetiche |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | |
| rotator DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A biglie magnetiche |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | proteina G perline magnetiche |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | preparare 20 μ g/mL di stock in 0,1% BSA e aliquota. |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Reagente tampone Sigma | E-4884 | |
| Glicole etilenico-bis(β-etere amminoetilico)-Acido N,N,N',N'-tetraacetico) (EGTA) | Reagente tampone Sigma | E-4378 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 Reagente | qPCR |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10437028 | per il congelamento delle cellule |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Preparare 20 μ g/mL di stock in 0,1% BSA e aliquota. |
| Forcipe | Fine Science Tools | 11008-13 | per la dissezione del tumore |
| Glicerolo, grado MB | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | soluzione salina bilanciata |
| Fluriso | VETone | 501017 | anestetico per inalazione |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | sistema di imaging ottico in vivo |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | terreno di distacco cellulare |
| Cloruro di litio | Sigma | L8895 | reagente tampone |
| a basso legame Microprovette | Corning Costar | CLS3207 | a basso legame proteico Provetta per microcentrifuga |
| Fisher | 21-402-903 | provetta per microcentrifuga normale | |
| Nucleasi micrococcica | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | ogni lotto può differire; acquistare una quantità sufficiente per esperimenti e aliquota. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | Componente NSC |
| Normale Coniglio IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | agente antimicrobico, utilizzare a 0,1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | reagente tampone |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Proteasi Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquotare e conservare a -20 °C. |
| La protinasi K | Sigma-Aldrich | P2308 | produce 10 mg/mL di stock in acqua; aliquotare e conservare a -20 °C. |
| Kit di purificazione QIAquick PCR Kit di purificazione | DNA | Qiagen | 28104 |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | per la dissezione del tumore |
| Cloruro di sodio | VWR | 0241-5KG | reagente tampone |
| Sodio desossicolato | Sigma-Aldrich | D670-25G | Reagente tampone |
| Sodio Dodecil solfato (SDS) | Sigma | L-4390 | reagente tampone |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | reagente tampone |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polietilenglicole ottilfeniletere |
| centrifuga standard | Fisherbrand | 12-006-901 | mini centrifuga standard |
| Microscopio da | dissezione fluorescente | Olympus | SZX16 |
| Sistema di PCR in tempo reale ViiA 7 con blocco rapido a 96 pozzetti | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Riferimenti
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma th....
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Ristampe e permessi
