Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Più celle distinte interagiscono per costruire e mantenere complessi tessuti animali e vegetali. Queste cellule sono spesso intercalati e difficili da distinguere dai vicini a livello di singola cellula senza microscopia ad alta risoluzione che richiedono la fissazione del tessuto. Tuttavia, per capire come questi si formano tessuti, sono mantenuti e diventare malato, è stato fondamentale per indagare come singole cellule all'interno del tessuto interagisce nel corso del tempo. Idealmente, questi esperimenti richiedono l'etichettatura delle singole cellule all'interno di un tessuto in maniera non invasiva, senza l'obbligo di fissazione. Gli scienziati ora hanno sviluppato numerose tecniche per realizzare questo compito^1,2,3,4.

L'individuazione e l'attuazione della proteina fluorescente Medusa verde (GFP) è stato un approccio emozionante che ha permesso per l'etichettatura di cellule distinte in un tessuto ambiente¹. Utilizzando promotori di cellula-specifico, è possibile selezionare geneticamente un sottoinsieme delle cellule che sono classificati come¹. In alternativa, l'espressione virale indotta di GFP può essere utilizzato per utente-selezionato espressione della GFP^3,4. Anche se molto utile, espressione genetica mediata di GFP non consente l'espressione selezionata dall'utente all'interno di un sottoinsieme delle cellule nel tessuto; e l'espressione virale di GFP, sebbene vantaggioso, può essere invasivo. Con l'avvento di GFP derivati e tecniche intelligente come Brainbow di esprimere distinte proteine fluorescenti più scarsamente all'interno dei tessuti, è diventato possibile visualizzare singole cellule e le interazioni tra loro nel complesso tessuto^{2, 5}. Tuttavia, questi approcci marcare le cellule in modo casuale. Se l'esperimento desiderata richiede la visualizzazione di una singola cella o popolazione di cellule che è definita dallo sperimentatore, pertanto sono limitati. Con tali esperimenti, sarebbe vantaggioso avere una proteina fluorescente geneticamente espressa che può essere manipolata per distinguere, in maniera singola cella, e da altre cellule fluorescenti e non fluorescenti.

Per raggiungere questo obiettivo e visualizzare la biologia cellulare di cellule singole all'interno di un tessuto vivente complesso, la comunità scientifica utilizza fotoconversione unicellulare di distinte proteine fluorescenti^6,7,8. Espressione di una proteina di fotoconvertibile (cioè, eos, kaede, ecc.) che passa dal verde al rosso fluorescente stato quando esposto ai raggi UV con geneticamente controllata (488 nm) luce, possiamo distinguere una singola cella da sua fluorescente contrassegnati i vicini^6,7,8. Questo approccio utilizza un apparecchio attaccato al nostro microscopio confocale che possa indirizzare la luce da una pila di laser a una regione di diffrazione limitata di interesse. Con questa tecnica, possiamo etichettare o singole cellule o più grandi popolazioni in un modo definito dall'utente^9,10,11. La tecnica è mini-invasiva rispetto alle iniezioni di singola cellula di GFP virale. Come un proof of concept, mostriamo che possiamo fotoconvertita singole cellule all'interno di un ganglio nel sistema nervoso periferico e fotoconvertita più grandi popolazioni come cellule situate sul lato ventrale del midollo spinale^{9,10, 11,12}. Quindi possiamo visualizzare queste popolazioni di cellule photoconverted 24 h più tardi per guadagnare la comprensione nel loro movimento e la differenziazione durante lo sviluppo.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Università di Notre Dame istituzionali Animal Care e Comitato di uso.

1. preparazione del campione di Zebrafish

1. Posizionare un maschio adulto e un adulto femmina Tg (convertibile della proteina) in una camera di accoppiamento per le procedure standard¹³. In questo manoscritto, utilizzare Tg(sox10:eos) pesce⁹ a causa di accesso ma altre linee transgeniche con fotoconvertibile della proteina può essere ugualmente usato. Impostare più di una camera nel caso in cui il pesce non posare. Consentire il pesce a rimanere nella camera durante la notte.
2. La mattina successiva, raccogliere le uova in piastre Petri da 100 mm. Consentire uova di maturare alla post-fecondazione 24h (hpf) prima proiezione.
3. Se gli animali di cui sopra erano eterozigoti per il transgene, schermo 24 hpf piatti per Tg(sox10:eos) + embrioni con un 488 nm sorgente e GFP filtrare i set su un microscopio per dissezione. Isolare Tg(sox10:eos) + embrioni e permettono di maturare a 48 hpf.
4. Dechorionate embrioni manualmente con un ago o una pinzetta.
5. Preparare e microonde 5 mL di soluzione di agarosio di punto basso punto di fusione dello 0,8%.
   1. Una volta fredde al tatto dell'agarosi, posto 3-4 anestetizzati Tg (sox10:eos) + 48 pesce hpf al centro di un coprioggetto in vetro-10 mm inferiore di Petri.
   2. Aggiungere sufficiente dell'agarosi per coprire la superficie del vetrino coprioggetti, circa 1 mL. Utilizzare un ago sonda per disporre il pesce sui loro lati. Consentire l'agarosio a solidificare per garantire il montaggio degli animali. Può essere necessario continuamente ri-organizzare il danio zebrato, fino a quando l'agar solidifica¹⁴. Solidificazione dura circa 2 min.
6. Dopo l'agarosio è solidificato per 2 min, aggiungere lentamente il mezzo di embrione contenente 0,02% acido aminobenzoic estere (tricaina) a piatto fino a quando la superficie inferiore dell'agar e il piatto è sommerso. Questo dovrebbe essere circa 3mL.

2. microscopio montaggio e pre-conversione Imaging

1. Confocale software Open e selezionare le finestre di acquisizione e messa a fuoco [Figura 1]. Sotto la finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione di imaging di laboratorio specifico conversione sotto all'opzione cattura impostazione discesa scheda [Figura 1]. Qui, l'impostazione di specifiche del laboratorio viene chiamato "pesce di Imaging".
2. Inserire esemplare nell'ambito confocale e mettere a fuoco usando il corso e le manopole di regolazione fine.
3. Aprire la finestra di messa a fuoco e individuare l'area desiderata di interesse (cioè gangli delle radici dorsali).
4. Selezionare il laser c488 sotto il menu filtro impostato. Impostare l'esposizione a 300 ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2].
5. La casella 3D nella sezione tipo di cattura . Nella sezione Capture 3D , selezionare utilizza la posizione corrente e controllare la gamma intorno a corrente. Nella stessa sezione, è possibile impostare l'intervallo a 35, il numero di aerei a 36 e le dimensioni di passaggio a 1. La gamma può essere aumentata o diminuita per ospitare per la profondità dell'area di imaging. Per il midollo spinale un valore compreso tra 35-40 stack è in genere sufficiente [Figura 5].
6. Selezionare la posizione corrente [Figura 5].
7. Fare clic su start nella parte inferiore della finestra di cattura per acquisire l'immagine.

3. single-cell fotoconversione

1. Confocale software Open e selezionare le finestre di acquisizione e messa a fuoco [Figura 1]. Sotto la finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione di imaging di laboratorio specifico conversione sotto all'opzione cattura impostazione discesa scheda [Figura 1]. Qui, l'impostazione di specifiche del laboratorio viene chiamato "Pesce l'ablazione chip completo."
2. Selezionare il laser c488 e c541 sotto il menu filtro impostato. Se non si utilizza lo stesso software di microscopio, trovare il menu per selezionare diversi laser e selezionare la 488 nm e 541 nm laser. Impostare le esposizioni ai 300 ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2]. Queste impostazioni di laser vengono selezionate in base a produrre abbastanza segnale fluorescente senza causare tossicità o photobleaching. Se è visualizzata la tossicità o photobleaching, ridurre potenza laser o esposizione.
3. Aprire la finestra di messa a fuoco e fare clic sulla scheda photomanipulation nella finestra di messa a fuoco. Regolare di conseguenza i parametri laser. Modificare la potenza del laser dello stack a 2 e quindi fare clic su Vai. Modificare la dimensione del blocco Raster 1 e fare clic su imposta. Modificare le dimensioni di doppio clic a 4. Modificare la linea laser a v405 [Figura 3].
4. Aprire le impostazioni di acquisizione avanzate nella finestra di acquisizione. Selezionare la scheda photomanipulation e modificare le ripetizioni fare doppio clic su 2. Fare clic su OK [Figura 4].
5. Selezionare la scheda XY nella finestra di messa a fuoco. Ricontrollare i parametri laser dal passaggio 2 nella scheda photomanipulation [Figura 3, Figura 4]. Impostare impostazioni laser fotoconvertita la cella di interesse senza fotoconversione delle cellule circostanti.
   1. Se fotoconversione delle celle adiacenti è presente, ridurre la potenza del laser. Se fotoconversione delle cellule non si verifica, poteri del laser possono essere aumentate. Impostare in modo ottimale, potenza laser fotoconvertita solo la regione di interesse e non le zone circostanti.
6. Selezionare la casella di timelapse sotto tipo di cattura. Quindi, fare clic su Start [Figura 6A].
7. Una volta aperta la finestra di live della webcam, selezionare lo strumento cerchio sulla barra superiore [Figura 7]
8. Disegnare un cerchio nella regione più centrale della cellula. Fare clic destro il cerchio disegnato, selezionare regione FRAPe attendere 3 secondi. L'area selezionata dovrebbe diventare dimmer [Figura 8]. Scegliere Interrompi acquisizione.
9. Se più di un animale di imaging, tornare alla scheda XY nel menu di messa a fuoco e selezionare la posizione 2. Quindi, ripetere i passaggi 4.1-4.6.
10. Per convertire una popolazione di cellule, seguire i parametri di protocollo e laser per la procedura 4.1-4.4 tranne invece di disegnare un cerchio di FRAP la regione di interesse, utilizzare lo strumento linea. Tracciare una linea sulla regione di interesse e FRAP la regione utilizzando gli stessi parametri sopra elencati.

4. post-fotoconversione Imaging

1. Una volta che tutti i punti sono photoconverted. Selezionare lo stack di immagine standard di laboratorio specifiche impostazione descritta in precoversion passo 3 di imaging. Questo si trova sotto all'opzione cattura impostazione scheda a discesa nella finestra di cattura [Figura 5].
2. Selezionare il laser c488 e impostare l'esposizione a 300ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2].
3. Selezionare il laser c541 trovato sotto lo stesso menu come il laser c488. Impostare l'esposizione a 500 ms, laser di potenza a 10 e intensificare a 75 [Figura 9].
4. La casella 3D nella sezione tipo di cattura . Nella sezione Capture 3D , selezionare utilizza la posizione corrente e controllare la gamma intorno a corrente. Nella stessa sezione, è possibile impostare l'intervallo a 35, il numero di aerei a 36 e le dimensioni di passaggio a 1. Il numero di serie può aumentare o diminuire per accomodare la profondità imaging desiderata [Figura 5].
5. Se esistono più punti nella scheda di messa a fuoco XY, è possibile selezionare l'opzione multipunto elenco nella finestra di acquisizione. In caso contrario, selezionare la posizione corrente.
6. Fare clic su start nella parte inferiore della finestra di cattura per acquisire l'immagine.

Fotoconversione di proteine fluorescenti può essere utilizzato per marcare le cellule distinte all'interno di un tessuto6. Per dimostrare questo, Tg(sox10:eos) pesce9 sono stati utilizzati per esprimere la proteina fotoconvertibile Eos sotto le sequenze regolatrici di sox10. Gli animali di Tg(sox10:eos) 48 hpf erano prima montato e poi ripreso per rilevare qualsiasi fotoconversione aspecifici che può essersi verificati. La Eos non convertito segnale fluorescente con poco segnale fluorescente di Eos photoconverted era quindi visualizzate (Figura 10). Animali sono stati tenuti al buio per garantire fotoconversione aspecifica è minima. Quindi, le regioni di interesse sono stati esposti a luce UV utilizzando il set-up al microscopio confocale. Per confermare che singole cellule erano photoconverted come conseguenza l'esposizione ai raggi UV, abbiamo preso z-stack della zona che attraversa la regione di photoconverted. Coerente con successo fotoconversione, c'era poco rilevamento di Eos non-convertito di fuori della regione di interesse e photoconverted Eos era distintamente presenti all'interno della regione di interesse. L'immagine risultante Mostra una singola cella all'interno di un ganglio l'etichetta sicuramente da limitrofi (Figura 10).

Per dimostrare l'utilità di questa tecnica di fotoconversione, una popolazione delle cellule inoltre è stato esposto ai raggi UV. In questo paradigma, pre-fotoconversione immagini sono state scattate e nessun segnale di Eos di ONU-photoconverted era presente. Successivamente, il lato ventrale del midollo spinale è stato esposto ai raggi UV utilizzando una linea (Figura 11). Per confermare il successo fotoconversione, post-fotoconversione immagini sono state scattate e photoconverted Eos nelle cellule ventrale del midollo spinale nella posizione della linea di interesse che abbiamo disegnato sono stati visualizzati (Figura 11). Non-photoconverted Eos segnale era visibile in tutte le altre aree. Per estendere questa tecnica abbiamo poi preso immagini identiche 24 ore dopo la fotoconversione. In queste immagini, photoconverted Eos+ cellule sono stati veduti sparsi in tutta la regione del midollo spinale in località dorsale e ventrale (Figura 12). Questi dati sono coerenti con l'ipotesi che cellule spinali ventrali si trasferì a posizioni dorsale come precedentemente descritto10. Insieme queste due tecniche dimostrano che fotoconversione della Eos può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule o popolazioni di cellule all'interno di una regione di tessuto in modo definito dall'utente. Ciò ha contribuito ad una migliore comprensione delle caratteristiche cellulari quali la migrazione cellulare, comunicazione e dinamiche.

Figura 1 : Catturare e concentrarsi Windows. Screenshot del software raffigurante la posizione di capture e stato attivo windows e laboratorio specifico "Pesce ablazione completa chip" menu a tendina sulla scheda. Vedere caselle rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : parametri Laser c488. Schermata della finestra di acquisizione dei parametri specifici per il laser c488. L'esposizione è di 300 ms. potere del Laser è 5. Intensificare è 75. Vedere caselle rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Parametri Laser fotoconversione. Screenshot della scheda photomanipulation nella finestra di messa a fuoco che delinea le impostazioni laser specifico necessario per fotoconversione. Laserstack Power è 2. Fare doppio clic su dimensione è 4. Dimensione del blocco di raster è 1. Vedere caselle rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Fotoconversione Laser parametri avanzati. Screenshot delle impostazioni nella finestra di acquisizione laser avanzato. Verrà visualizzata nella finestra di preferenze di cattura con la scheda photomanipulation. Le ripetizioni di doppio clic è impostato su 2. Vedere caselle rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Pre-conversione parametri di Imaging. Screenshots di windows attivo e capture. Evidenzia i parametri specifici di cattura finestra necessari per l'imaging pre-conversione. L'impostazione di cattura è "Pesce Imaging." Il 3D sia selezionata sotto il tipo di cattura. E le impostazioni di acquisizione 3D vengono specificate come; Gamma è 35, numero di aerei è 36, passo minimo è 1 e Offset è -15. Verranno selezionate anche le caselle di "gamma intorno corrente" e "posizione corrente". Vedere caselle rosse. Descrive come selezionare punti singoli o multipli sulla finestra di cattura (a sinistra) e come selezionare singoli punti sulla finestra di messa a fuoco (a destra). Vedere le scatole verdi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Apertura della finestra di fotoconversione. Screenshot raffigurante il tipo di cattura timelapse è selezionata secondo parametri precedentemente impostati. Vedere caselle rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : Impostare la fotoconversione. Schermata che mostra la posizione dello strumento cerchio (in alto) e la finestra di controllo di acquisizione che appare (a destra). Vedere caselle rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8 : Fotoconversione single-Cell. Menu a discesa screenshot raffiguranti l'uso dello strumento cerchio fotoconversione e il tasto destro del mouse. L'azione di conversione "FRAP tutte le regioni" si trova all'interno del menu a discesa del tasto destro del mouse. Vedere caselle rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9 : I parametri di post-fotoconversione c561Laser. Schermata della finestra di acquisizione dei parametri specifici per il laser c561. L'esposizione è 500 ms. potere del Laser è 10. Intensificare è 75. Vedere caselle rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10 : Fotoconversione single-cell. (A). z-proiezioni schematiche e confocale di zebrafish Tg(sox10:eos) alle 48 hpf visualizzando gangli spinali nel sistema nervoso periferico prima di fotoconversione. Linea tratteggiata indica la posizione approssimativa di entrata DRG del midollo spinale... (B). z-proiezioni schematiche e confocale di zebrafish Tg(sox10:eos) alle 48 hpf visualizzando gangli spinali nel sistema nervoso periferico durante fotoconversione. Linea tratteggiata indica la voce di DRG del midollo spinale. Cerchio giallo indica il sito di conversione e fulmine indica l'esposizione alla luce UV. (C). z-proiezioni schematiche e confocale di zebrafish Tg(sox10:eos) alle 48 hpf visualizzando gangli spinali nel sistema nervoso periferico post-fotoconversione. Linea tratteggiata indica la voce di DRG del midollo spinale. CNS è un'abbreviazione per il sistema nervoso centrale e PNS è un'abbreviazione per il sistema nervoso periferico (A-C). Barra della scala è pari a 10 um. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11 : Procedura di fotoconversione in una più grande regione del midollo spinale. (A). z-proiezioni schematiche e confocale di zebrafish Tg(sox10:eos) alle 48 visualizzando hpf OPCs e gangli delle radici dorsali della regione ventrale del midollo spinale prima di fotoconversione. Linea tratteggiata indica la regione dorsale del midollo spinale. (B). z-proiezioni schematiche e confocale di zebrafish Tg(sox10:eos) alle 48 visualizzando hpf OPCs e gangli delle radici dorsali della regione ventrale del midollo spinale durante fotoconversione. Solido giallo linea indica l'area selezionata per fotoconversione. Linea tratteggiata indica la regione dorsale del midollo spinale. (C). z-proiezioni schematiche e confocale di zebrafish Tg(sox10:eos) alle 48 visualizzando hpf OPCs e gangli delle radici dorsali della regione ventrale del midollo spinale dopo fotoconversione. Le linee tratteggiate indicano la regione dorsale del midollo spinale. Barra della scala è pari a 10 um.

Figura 12 : Cellulare rilevamento e visualizzazione post-fotoconversione. (A). schematica del midollo spinale di Tg(sox10:eos) zebrafish alle 48 visualizzando hpf OPCs e gangli delle radici dorsali della regione ventrale del midollo spinale dopo fotoconversione. Fulmine indica la conversione della luce UV. (B). confocale z-le proiezioni di Tg(sox10:eos) zebrafish del midollo spinale a partire da 48 visualizzando hpf OPCs e gangli delle radici dorsali della regione ventrale del midollo spinale dopo fotoconversione. Fulmine indica la conversione della luce UV. Barra della scala è pari a 10 um.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.