Lo scopo di questa carta è di presentare una procedura dettagliata per raccogliere diversi tessuti adiposi bianchi dai topi, trattare i campioni di grasso ed estrarre RNA.
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Articolo metodologico
Accumulazione del tessuto adiposo del mouse ed elaborazione per l'analisi del RNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
Rispetto ad altri tessuti, tessuto adiposo bianco ha un considerevolmente meno contenuto di RNA e proteine per applicazioni a valle come Real-Time PCR e Western Blot, poiché esso contiene principalmente i lipidi. Isolamento del RNA dai campioni di tessuto adiposo è impegnativo anche come passaggi aggiuntivi sono necessari per evitare questi lipidi. Qui, presentiamo una procedura per raccogliere tre tessuti adiposi bianchi anatomicamente diversi da topi, per elaborare questi campioni ed eseguire isolamento del RNA. Descriviamo ulteriormente la sintesi di cDNA e gene esperimenti di espressione mediante Real Time PCR. Il protocollo descritto dichiara permette la riduzione della contaminazione dell'animale capelli e sangue su cuscinetti adiposi, nonché la contaminazione incrociata tra diversi rilievi grassi durante la raccolta del tessuto. Esso è stato ottimizzato anche per garantire un'adeguata quantità e qualità del RNA estratto. Questo protocollo può essere ampiamente applicato a qualsiasi modello di topo dove campioni di tessuto adiposo sono necessari per gli esperimenti di routine come la PCR in tempo reale, ma non è inteso per l'isolamento da colture cellulari primarie adipocytes.
Introduzione
L'obesità è un'epidemia mondiale che può portare a complicazioni quali 2 diabete di tipo1. Modelli animali obesi e geneticamente indotta da dieta sono frequentemente utilizzati per la ricerca in obesità e delle complicanze associate. Tradizionalmente, il tessuto adiposo bianco è conosciuto come un vano portaoggetti per l'energia in eccesso ed è prevalentemente composto da lipidi mentre il tessuto adiposo bruno converte l'energia in calore2,3. Tessuto adiposo è dinamico e sarà ampliata e ridursi a seconda di molti fattori come l'ingestione di cibo e attività fisica. Quindi, per determina....
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Protocollo
Cura dei topi utilizzati nelle procedure rispettate norme per la cura e l'uso di animali da esperimento fissato dal Consiglio canadese per la protezione degli animali. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso del CHUM Research Center e Università Animal Care.
1. l'autopsia e raccolta di tessuto adiposo da topi maschi
- Fare gruppi sperimentali secondo obiettivi di studio. In questo studio, i campioni sono stati raccolti da due gruppi di topi maschi su uno sfondo di C57Bl/6 (n = 12-14/gruppo). Garantire che topi usati qui sono 12-15 settimane di età e sono mantenuti su 12 h ciclo luce/buio con accesso normale (N) o....
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Risultati
Seguendo la procedura di autopsia, tre tessuti adiposi bianchi sono stati raccolti e appesantiti da due gruppi di topi (N e HF topi dieta-federazione). Come previsto, i topi sulla dieta HF avevano aumentato peso corporeo finale e aumento di peso rispetto ai littermates sulla dieta N (tabella 1). Queste osservazioni sono state accompagnate da più di un aumento di 2 volte del peso della PGF, PRF e SCF in topi obesi rispetto a quelli sulla dieta N.
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Discussione
HF-dieta seguente nutrire, topi obesi sono stati trovati una maggiore corpo e tessuto adiposo bianco pesi rispetto ai topi alimentati con una dieta di N. RNA estratto usando fenolo soluzione dato i campioni con buona purezza. Leptina è un'adipochina prodotta principalmente da tessuto adiposo ed è conosciuta per correlare positivamente con massa grassa16. Come previsto, espressione di mRNA di leptina aumentata di topi obesi in concomitanza con la loro massa grassa.
Quest.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da diabete Canada.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 mL di seringi | |||
| 1X soluzione TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA• Na2. pH 8,0) | |||
| aghi da 22 g aghi | |||
| da 26 g Riscaldatore | |||
| etanolo | |||
| (bagno a secco) | |||
| Cloroformio | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Termo scientifico | R0141 | |
| dCTP | Termo scientifico | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNasi I (1 U/µ l) | Termo scientifico | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR verde Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universale SYBR verde master (Rox) colorante fluorescente | Roche | 4913914001 | |
| Punte | |||
| Pincipe | Instrumentarium | HB275 | |
| Garza | |||
| Martello | |||
| Dieta per roditori ad alto contenuto di grassi | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanolo | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Primer PCR diretto alla leptina (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 uM | |||
| Primer PCR inverso alla leptina (5'-GGCTATCTGCAGCAGCATTTTG-3') 10 uM | |||
| Azoto | |||
| Maxima Trascrittasi inversa (enzima e tampone 5x) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Acqua nanopura (indicata come acqua ultrapura) | |||
| esplorazione in nitrile | |||
| Guanti | |||
| Dieta normale per roditori | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Soluzione di fenolo (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| alluminio pre-identificato | |||
| Cuvetta | |||
| Rack per strisce | |||
| Rack per strisce | |||
| Esaminatori casuali | Invitrogen | 58875 | |
| Sistema genico del rotore PCR in tempo reale | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene termociclatore | |
| Centrifuga da banco refrigerata Inibitore | |||
| RNasi RiboLock | Thermo scientific | EO0381 | |
| Provette eppendorf da 1,5 mL senza RNasi Provette | |||
| con tappo a vite da 1,5 mL senza RNasi | |||
| Strisce di provette PCR prive di RNasi (0,2 mL) e tappi Acqua | |||
| senza RNasi | Macchina Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR strisce di provette (0,1 mL) e tappi | |||
| S16 primer PCR forward (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM | |||
| S16 primer PCR inverso (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') Spettrofotometro da 10 uM | |||
| Biochrom | Ultrospec 3100 pro | ||
| Mortaio e pestello | |||
| Cuscinetti chirurgici | Fatto in casa un pannello di schiuma avvolto in un sottopiede | ||
| Forbici chirurgiche | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Termociclatore | |||
| Termociclatore | Biometra | Thermocycler | |
| a vortice | |||
| Spatola |
Riferimenti
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88(2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemic....
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Ristampe e permessi
