Articolo metodologico

Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata

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DOI:

10.3791/57028

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9 aprile 2018

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di microscopia STED contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine dei microtubuli in cellule di B che si sono diffuse sulle lamelle rivestite con gli anticorpi per il recettore delle cellule B, un modello per la fase iniziale di formazione della sinapsi immuni.

Abstract

Cellule di B che si legano agli antigeni di membrana-limiti (per esempio, sulla superficie di una cellula presentanti l'antigene) formano una sinapsi immuni, una struttura cellulare specializzata che ottimizza la segnalazione della B-cellula recettore (BCR) e acquisizione di antigene BCR-mediata. Il rimodellamento del citoscheletro di actina e il riorientamento della rete dei microtubuli verso il sito di contatto dell'antigene sono essenziali per la formazione della sinapsi immuni. Rimodellamento del citoscheletro in un denso anello periferico di F-actina è accompagnata dalla polarizzazione del centro di organizzazione dei microtubuli verso la sinapsi immune. Proteine leganti plus-fine dei microtubuli, come pure proteine corticale plus-fine acquisizione mediano interazioni fisiche tra il cytoskeletons actina e dei microtubuli, che consentono loro di essere riorganizzata in modo coordinato. Chiarire i meccanismi che questa riorganizzazione del citoscheletro, nonché a comprendere come queste strutture citoscheletriche forma formazione della sinapsi immuni e BCR di segnalazione, di controllo può fornire nuove intuizioni l'attivazione delle cellule B. Ciò è stata facilitata dallo sviluppo di approcci di microscopia di Super-risoluzione che rivelano nuovi dettagli di organizzazione della rete del citoscheletro. Descriviamo qui un metodo per l'utilizzo di microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine transfected GFP-etichettato microtubuli in cellule di B. Per modellare i primi eventi nella formazione della sinapsi immuni, permettiamo a cellule B a diffondersi sulle lamelle ricoperte di anticorpi (anti-Ig) anti-immunoglobulina, che avviano la segnalazione di BCR e rimodellamento del citoscheletro. Forniamo dettagliate protocolli per esprimere proteine di fusione di GFP in cellule di B-linfoma A20, per la diffusione di anti-Ig-indotta delle cellule e per la fissazione delle cellule successive, Immunostaining, acquisizione di immagini e passaggi di deconvoluzione di immagine. Le immagini ad alta risoluzione ottenute utilizzando queste procedure permettono di visualizzare contemporaneamente l'actina strutture, i microtubuli e proteine obbligatorie plus-fine dei microtubuli che possono collegare queste due reti del citoscheletro.

Introduzione

Quando le cellule B associare polarizzati matrici di antigeni (ad es., visualizzato sulla superficie dell'antigene-presentare cellule (APC)), il recettore della B-cellula risultante (BCR) segnalazione unità la formazione di una struttura classica sinapsi immuni, che era prima descritto in T cellule1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inizialmente, microclusters di form di BCRs antigene associato alla periferia del sito contatto B cellulare: APC. Questi microclusters quindi spostare verso il centro del sito contatto antigene, dove si fondono in un cluster centrale attivazione supramolecolari (cSMAC) che costituisce il nucleo della sinapsi immune. Formazione della sinapsi immuni ottimizza la segnalazione di BCR e facilita l'estrazione dell'antigene BCR-mediata dalla membrana APC14. Questa acquisizione di antigene, che è seguita da BCR-mediata antigene internalizzazione e l'elaborazione successiva dell'antigene, permette alle cellule di B di presentare i peptide: MHC II complessi alle cellule di T e suscitare la cellula T Guida14. Perché la formazione della sinapsi immunitaria promuove l'attivazione delle cellule B, chiarire i meccanismi che stabiliscono che questo modello funzionale dell'organizzazione del ricevitore può offrire nuove intuizioni in risposte immunitarie umorali come sono avviate e regolati.

Riorganizzazione dell'actina sia microtubule cytoskeletons è essenziale per la formazione della sinapsi immuni. Segnalazione stimolata da una matrice spazialmente polarizzato degli antigeni localizzati di BCR induce rapida e drammatica rimodellamento del citoscheletro dell'actina1,15. La formazione di strutture dendritiche actina alla periferia della cellula B esercita forze che spinge sulla membrana plasmatica e promuove la diffusione delle cellule di B. Questo permette alla cellula di B di acquisire una maggiore area di superficie del antigene-cuscinetto e aumenta il numero di BCRs che legano l'antigene e attivare vie di segnalazione di BCR. Allo stesso tempo, il MTOC e la rete dei microtubuli sono riorientati verso il sito di contatto dell'antigene. All'approssimarsi del contatto dell'antigene il MTOC, microtubuli che emana dal MTOC si estendono lungo la faccia interna della membrana del plasma all'interfaccia fra la cellula di B e l'antigene-cuscinetto superficie16,17. Questi microtubuli juxtamembrane possono quindi fungere da tracce per il movimento centripeto dineina-mediata di antigene associato BCR microclusters18, portando alla formazione di un cSMAC.

Il riorientamento e la polarizzazione del MTOC verso la sinapsi immunitaria richiede l'actina intatto e cytoskeletons dei microtubuli e spesso dipende dalle interazioni tra l'actina corticale rete e microtubuli16,17, 19,20. Proteine leganti l'actina corticale, come IQGAP1, possono catturare i microtubuli interagendo con complessi proteici che decorano il microtubulo plus-estremità21. Questi dinamici complessi delle proteine leganti plus-fine includono EB1 e CLIP-170, che vengono definiti collettivamente come microtubule plus-fine rilevamento delle proteine (+ puntali)21,22. + Suggerimenti alle estremità dei microtubuli possono associare alle proteine che sono associate con la membrana plasmatica o il citoscheletro di actina corticale. In questo modo i meccanismi di generazione di forza (ad es., il meno-end diretto movimento di dineina corticale ancorata lungo i microtubuli) per esercitare forze di trazione su microtubuli e quindi riposizionare il MTOC. CLIP-170 può legarsi alla proteina actina-collegati ponteggi IQGAP123, e abbiamo dimostrato che entrambi di queste proteine sono necessari per polarizzazione indotta da BCR MTOC verso il sistema immunitario sinapsi17. Questa interazione IQGAP1-CLIP-170 può giocare un ruolo chiave nel coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina con il riposizionamento della rete dei microtubuli alla sinapsi immune della B-cellula.

Microscopia a fluorescenza convenzionale ha rivelato la riorganizzazione drammatica della cytoskeletons actina e dei microtubuli durante la B-cellula immunitaria sinapsi formazione2. Tuttavia, questo approccio non può risolvere piccole strutture cellulari in dettaglio a causa del limite di diffrazione della luce, che, secondo la legge di Abbe, dipende dalla lunghezza d'onda della luce utilizzata per illuminare il campione e l'apertura del obiettivo24. Questo limite di diffrazione vincola la risoluzione dei microscopi ottici convenzionali a 200-300 nm in direzione laterale e 500-700 nm nella direzione assiale25. Di conseguenza, più piccole strutture subcellulari, come pure i dettagli degli cytoskeletons actina e dei microtubuli, potrebbero solo essere osservati usando la microscopia elettronica. Formazione immagine di microscopia elettronica del citoscheletro è che richiede tempo, richiede protocolli fissazione e preparazione del campione duro che possono alterare strutture biologiche ed è limitata alla rilevazione dell'anticorpo-mediata. La capacità di immunostain e contemporaneamente l'immagine più proteine o strutture cellulari è un vantaggio notevole di microscopia di fluorescenza. Inoltre, che esprimono le proteine di fusione fluorescenti in cellule permette l'imaging in tempo reale ed è utile quando gli anticorpi efficaci per immunostaining la proteina di interesse non sono disponibili.

I recenti progressi tecnologici nella microscopia di Super-risoluzione hanno superato i limiti di diffrazione della luce e ha permesso la visualizzazione di nanoscala strutture cellulari24. Una tale tecnica di microscopia di Super-risoluzione viene chiamato emissione stimolata svuotamento (STED) microscopia. STED impiega due laser, dove un laser eccita il fluoroforo e un secondo laser con un motivo a forma di ciambella selettivamente sopprime l'emissione di fluorescenza intorno il fluoroforo. Questo riduce la funzione di punto di diffusione (zona apparente) di una singola particella fluorescente e fornisce un limite di Sub-diffrazione immagine fluorescente25,26. Microscopia di stato fondamentale svuotamento impiega anche tecniche basate sulla fluorescenza per acquisire immagini di Super-risoluzione. Tuttavia, i tempi di acquisizione e ricostruzione di immagine sono lunghi, ci sono solo un numero limitato di fluorofori che possono essere utilizzato, e l'imaging ad alta risoluzione simultanea di più componenti citoscheletriche è tecnicamente impegnativo, perché mantenere strutture di actina e microtubuli richiede le procedure di fissaggio diversi. Di conseguenza, STED ha più vantaggi rispetto la microscopia elettronica e altre microscopia di Super-risoluzione si avvicina in quanto esso offre acquisizione rapida di immagini, ha i requisiti minimi di post-elaborazione e impiega la stessa fluorofori e tecniche di colorazione che vengono utilizzati per microscopia di fluorescenza convenzionale di campioni fissati26.

Microscopia di Super-risoluzione ora è stata utilizzata per visualizzare le strutture di actina alla sinapsi immune in cellule natural killer (NK) e T cellule26,27,28,29,30, 31. Tuttavia, la formazione immagine di Super-risoluzione del citoscheletro dei microtubuli, così come la riorganizzazione coordinata della cytoskeletons di actina e dei microtubuli durante la formazione della sinapsi immuni, solo recentemente è stato segnalato17. Abbiamo usato la microscopia STED per celle di immagine B che erano state lasciate a diffondersi sulle lamelle ricoperte di anticorpi (anti-Ig) anti-immunoglobulina, che stimolano la segnalazione di BCR e avviare la riorganizzazione del citoscheletro. Quando placcato sugli anticorpi anti-Ig immobilizzati, le cellule B subiscono drammatica diffusione actina-dipendente, che ricapitola gli eventi iniziali durante la formazione della sinapsi immuni. D'importanza, microscopia STED ha rivelato i dettagli dell'anello dendritica di F-actina che forme alla periferia del sistema immunitario sinapsi e ha mostrato che il MTOC, come pure i microtubuli collegati ad esso, avevano spostato vicino l'antigene contatto sito17. Questi microtubuli esteso verso l'esterno verso l'anello periferico di F-actina. Inoltre, formazione immagine di STED multi-colore di varie combinazioni di F-actina, tubulina, IQGAP1 e GFP-etichettato CLIP-170 + suggerimenti ha indicato che microtubule plus-estremità segnata da CLIP-170-GFP erano strettamente associata con il reticolo di actina periferici e con IQGAP1, un corticale cattura proteina17.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'actina e microtubule cytoskeletons alla sinapsi immune usando la microscopia STED di imaging. Questi metodi sono stati ottimizzati utilizzando la linea A20 murino delle cellule di B, che è stato ampiamente impiegata per lo studio della segnalazione di BCR e immuni sinapsi formazione17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. perché gli anticorpi commerciali a CLIP-170 non hanno funzionato bene per immunostaining in precedenti esperimenti, descriviamo dettagliatamente l'espressione della GFP-etichettato CLIP-170 in cellule A20, con macchiatura dei protocolli per visualizzare contemporaneamente fino a tre componenti del citoscheletro o proteine associate al citoscheletro. Metodi per l'utilizzo di microscopia STED all'actina di immagine a livello delle sinapsi immune delle cellule NK sono stati descritti in precedenza40. Qui, estendiamo questo per l'acquisizione di immagini ad alta super-risoluzione multi-colore di actina sia microtubule cytoskeletons in cellule di B.

Una considerazione critica per microscopia di Super-risoluzione è utilizzando le procedure di fissazione appropriato per il mantenimento di strutture cellulari e prevenendo danni to le proteine fluorescenti. La fissazione e la macchiatura metodi presentati qui sono stati ottimizzati per conservare la fluorescenza di GFP e fornire imaging ad alta risoluzione delle reti di actina e dei microtubuli. Quando è necessario esprimere proteine fluorescenti, dovrebbe essere notato che le cellule B sono solitamente difficili a transfect. Usando questo protocollo, 20-50% di A20 cellule tipicamente esprimono la proteina di fusione GFP transfettata, e fra questa popolazione i livelli di espressione della proteina sono variabili. Tuttavia, super-resolution imaging di actina e i microtubuli utilizzando le procedure che descriviamo è abbastanza robusta e immagini di alta qualità sono facilmente ottenute. Nonostante le piccole dimensioni rispetto a cellule A20, mostriamo che queste procedure utilizzabile anche all'immagine della rete dei microtubuli in cellule primarie di B che sono stati attivati brevemente con il lipopolysaccharide (LPS). Abbiamo dimostrato che cellule di B primarie LPS-attivato possono trasfettate con siRNA a relativamente alta efficienza (cioè, tale che lo svuotamento della proteina può essere rilevato dall'immunoblotting), che li rende una buona alternativa all'uso di linee di cellule di B per alcuni studi 17.

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Protocollo

Tutte le procedure di animali sono state approvate dall'Università della British Columbia Comitato di cura degli animali.

1. esprimere proteine di GFP-fusione in cellule di B-linfoma A20

  1. Cellule di cultura A20 in completano medium RPMI (RPMI-1640 completati con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS), 50 µM 2-mercaptoetanolo, glutamina 2mm, piruvato di 1 mM, 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina) a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto con 5 % CO2.
  2. Preparare il reagente di transfezione (Vedi la Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    Nota: Questo protocollo è stato ottimizzato per i reagenti specifici e protocollo di transfezione descritto nella Tabella materiali. Altri reagenti di transfezione che abbiamo provato non hanno dato sufficiente efficienza di trasfezione.
  3. Contare le celle utilizzando un emocitometro. Centrifuga 2,5 x 106 A20 cellule (per ogni trasfezione) per 5 min a x 525 g. Risospendere le cellule in 100 µ l di reagente di transfezione contenente 1-2,5 µ g di DNA plasmidico. Per il DNA codifica CLIP-170-GFP23, utilizzare 2,5 µ g per la transfezione. Mescolare delicatamente.
  4. Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e regolare il volume a 2 mL con terreno RPMI completo pre-riscaldato. Coltura delle cellule per 18 h a 37 ° C per consentire l'espressione della proteina.

2. isolamento primario del Mouse B cellule e loro attivazione con LPS

  1. Utilizzare strumenti chirurgici sterilizzati per rimuovere la milza da un mouse, seguendo protocolli approvati dal comitato di cura degli animali dell'istituzione.
  2. Nella coltura del tessuto cappa, posizionare un colino di cella sterile 70 µm in un piatto di coltura del tessuto 35 mm contenente 3 mL di PBS sterile temperatura ambiente. Utilizzare la parte di gomma dello stantuffo da una siringa da 5 ml per schiacciare la milza attraverso il filtro delle cellule.
  3. Dispensare la sospensione unicellulare di splenoctyes in una provetta sterile da 15 mL e centrifugare a 525 x g per 5 min.
  4. Uso un isolamento magnetico basato su perlina B cellula kit (Vedi Tabella materiali) per ottenere una popolazione altamente arricchita delle cellule B.
  5. Risospendere le cellule di B di 3 x 106/ml in completa medium RPMI completate con 2,5 µ g/mL LPS più fattore (BAFF; una citochina di sopravvivenza) di attivazione delle cellule di B di 5 ng/mL.
  6. Le cellule della coltura per 6 ore a 37 ° C.

3. rivestimento vetrini coprioggetti con gli anticorpi Anti-Ig

  1. Preparare la soluzione di anticorpo per il rivestimento di lamelle. Diluire la soluzione madre di capra-anti-mouse Ig anticorpi nella temperatura ambiente PBS sterile per rendere un 12,5 µ g/mL di soluzione; 400 µ l di soluzione di anticorpo è richiesto per ogni vetrino coprioggetti.
    Nota: Utilizzare il anti-topo di capra IgG per celle A20; utilizzare anti-topo di capra IgM per cellule primarie di B. Gli anticorpi IgG di capra non si legano bene ai recettori Fc del mouse. Tuttavia, per evitare qualsiasi potenziale grippaggio del ricevitore di Fc, uno può usare F(ab) o punto2 frammenti di anti-IgG di topo o di anticorpi IgM anti-topo.
  2. Immergere un coprioggetto in vetro rotondo 18 mm #1.5 in 100% di metanolo e lasciarla asciugare completamente (~ 10 min).
  3. Usando il forcipe, porre il coprivetrino secco in una coltura del tessuto 12-pozzetti piastra e dispensare 400 µ l di 12,5 µ g/mL Anticorpo soluzione (5 µ g totale; 2 µ g/cm2) sul coprioggetto affinché si forma una bolla al centro del coprivetrino e si diffonde ai bordi.
  4. Essere attenti a coprire l'intero vetrino coprioggetti, ma non lasciare che la soluzione di anticorpo di estendere oltre il bordo del vetrino coprioggetti e sulla plastica di coltura del tessuto. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  5. Lavare i vetrini coprioggetto di pipettaggio 1 mL di PBS sterile nel bene e, successivamente, aspirare la soluzione. Ripetere altre due volte per rimuovere gli anticorpi non legati.
  6. Aggiungere 1 mL di PBS sterile la ben contenente il coprioggetto anticorpo-rivestite fino a quando le cellule sono pronte per essere aggiunti.
    Nota: Lamelle possono essere conservate a temperatura ambiente, coperto con PBS, per l'uso sullo stesso giorno.

4. diffusione sulle lamelle Anti-Ig-rivestito delle cellule B

  1. Preparare per volta tamponata HEPES salino (mHBS): 25mm HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1mm Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, destrosio di 1 mg/mL, glutamina 2mm, piruvato di sodio di 1 mM e 50 µM 2-mercaptoetanolo). Filtro sterilizzare questa soluzione e conservare a 4 ° C.
  2. Il giorno dell'esperimento, fare 50 mL di mHBS con 2% FBS (mHBS-FBS) aggiungendo 1 mL di FBS inattivati a 50 mL mHBS. Caldo mHBS-FBS a 37 ° C prima dell'uso.
  3. Centrifugare le cellule transfected A20 o le cellule di B primarie che erano state coltivate con BAFF plus LPS a 525 x g per 5 min.
  4. Risospendere le cellule in 1 mL di mHBS-FBS, contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire le cellule a 2 x 105 cellule/mL in mHBS-FBS.
  5. Usando il forcipe, trasferire il coprioggetto dalla piastra di coltura del tessuto per un pezzo di pellicola di paraffina.
  6. Aggiungere 250 µ l di B cellule (5 x 104 ) per ogni vetrino coprioggetti.
  7. Incubare i vetrini coprioggetti a 37 ° C per 15 min al buio per consentire le cellule B a diffondersi su tutta la superficie anti-IgG-rivestito.

5. fissaggio e Immunostaining le cellule

  1. Preparare la soluzione di fissazione diluendo la soluzione di riserva 16% paraformaldeide e la soluzione di riserva 50% glutaraldeide in acqua distillata a temperatura ambiente per produrre concentrazioni finali di 3% di paraformaldeide e 0,1% di glutaraldeide. Preparare la soluzione di fissazione del giorno che è di essere usato e scartare qualsiasi eccesso.
    Attenzione: Le soluzioni stock paraformaldeide e glutaraldeide devono essere utilizzate solo in una cappa chimica. Seguire le istruzioni della scheda di dati di sicurezza (MSDS).
  2. Preparare il tampone di permeabilizzazione/blocco (3% BSA e 0,1% Triton X-100 diluito in PBS). Filtro sterilizzare questa soluzione e conservare a 4 ° C. Il giorno dell'esperimento, calda la quantità necessaria a temperatura ambiente.
  3. Preparare il tampone di colorazione (saponina BSA e 0,1% 1% in PBS). Questa soluzione utilizzando un filtro di 0,2 µm di sterilizzare e conservare a 4 ° C. Il giorno dell'esperimento, calda la quantità necessaria a temperatura ambiente.
  4. Pipettare 350 µ l della soluzione di fissaggio su ogni vetrino coprioggetti, assicurando che la superficie sia completamente coperta. Incubare a temperatura ambiente per 10 min al buio.
  5. Rimuovere la soluzione di fissaggio da coprivetrino aspirando attentamente dal bordo del coprivetrino utilizzando una micropipetta.
    Attenzione: La soluzione di fissaggio deve essere eliminata come rifiuti chimici pericolosi.
  6. Lavare i vetrini coprioggetti una volta con 500 µ l di tampone di permeabilizzazione/blocco. Dispensare il liquido.
  7. Permeabilize e bloccare le cellule aggiungendo 250 µ l di tampone di permeabilizzazione di blocco per ogni vetrino coprioggetto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
  8. Diluire 1: 100 dell'anticorpo anti-tubulina coniglio nella macchiatura buffer.
  9. Aspirare il tampone permeabilizzazione/blocco da lamelle e aggiungere 50 µ l della soluzione diluita dell'anticorpo anti-tubulina ogni vetrino coprioggetti. Incubare a temperatura ambiente per 30 min al buio.
  10. Preparare la soluzione di anticorpo secondario/actina macchia diluendo falloidina coniugati Alexa Fluor 568 1: 100 in buffer di colorazione sia l'anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 532 capra anti-coniglio IgG.
  11. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte per rimuovere l'anticorpo primario in eccesso aggiungendo 500 µ l di buffer di colorazione e quindi ad aspirazione e.
  12. Aggiungere 50 µ l della soluzione macchia secondaria dell'anticorpo/actina ogni vetrino coprioggetto e incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio.
  13. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte per rimuovere l'eccesso anticorpo secondario aggiungendo 500 µ l di buffer di colorazione e quindi ad aspirazione e.
  14. Aggiungere 10 µ l di reagente di montaggio di un vetrino da microscopio. Montare il vetrino coprioggetto sulla diapositiva microscopio con il lato di cella verso il basso.
    Nota: Un mezzo di montaggio "anti-dissolvenza" (Vedi Tabella materiali) è fortemente consigliato per preservare l'intensità della fluorescenza delle proteine di fusione di GFP. Evitare l'uso di reagenti contenenti DAPI, che può interferire con l'imaging dei fluorophores quando si utilizza il laser STED di montaggio.
  15. Lasciare i vetrini per asciugare durante la notte al buio. Le diapositive di immagini il giorno successivo.
    Nota: Le diapositive di Imaging, non appena il coprioggetto è asciutto è fortemente consigliato, come la fluorescenza di GFP si riduce nel tempo.

6. imaging mediante il microscopio STED

Nota: Si prega di notare che tutti i passaggi di software descritte di seguito sono specifici per il microscopio e il software che abbiamo usato (Vedi la Tabella materiali). I passaggi e le impostazioni dovrà essere regolato se imaging viene eseguita utilizzando un microscopio/software diversi.

  1. Accendere il microscopio STED, attivare il laser e la lampada di illuminazione epifluorescenza e avviare il software di microscopio.
  2. Impostare i parametri per i laser di svuotamento STED.
    Nota: Questo dipenderà il microscopio specifico utilizzato e i laser che è dotato. Alcune consigliate sono le impostazioni di luce bianca (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%.
  3. Attivare le impostazioni di STED e allineare i raggi laser STED utilizzando l'obiettivo 100x.
  4. Utilizzando l'oculare, concentrare il campione e selezionare una cella con espressione di GFP moderata.
    Nota: Espressione di GFP basso non sarà visibile perché STED riduce l'intensità di emissione. Al contrario, un'alta espressione di CLIP-170-GFP induce la formazione spontanea di cluster di grandi dimensioni, che non riflette il normale microtubule plus-fine proteina complessa morfologia e distribuzione. Selezionando una cella con espressione moderata GFP è essenziale per l'imaging con precisione le strutture citoscheletriche il contatto dell'antigene.
  5. Zoom nella cella selezionata e scegliere la regione di interesse per l'imaging. Regolare il fuoco in modo che il piano x-y della cellula B che è più vicino il coprioggetto è a fuoco.
    1. Per effettuare questa operazione, è possibile spostare progressivamente più vicino l'obiettivo al vetrino coprioggetti in modo che le strutture del citoscheletro delle cellule di B vengono messi a fuoco e poi andare fuori fuoco. Poi gradualmente spostare l'obiettivo nella direzione opposta fino a quando le strutture del citoscheletro delle cellule di B prima tornare a fuoco.
  6. Ottimizzare le impostazioni tra cui la potenza del laser, fascio di eccitazione e gamma del rivelatore. Iniziare con le impostazioni consigliate dalle istruzioni del produttore. Quindi apportare modifiche necessarie per ottimizzare il segnale per i campioni. Tutti i campioni da confrontare a vicenda con le stesse impostazioni di immagine.
  7. Sotto la scheda "acquisire" del software, impostare l'acquisizione dell'immagine su acquisizione sequenziale fotogramma nel pannello inferiore sinistro "Scansione sequenziale" selezionando l'opzione "tra i frame".
  8. Impostare la sequenza di acquisizione.
    Nota: Acquisiamo la fluorescenza di GFP in primo luogo al fine di evitare la degradazione del segnale GFP.
    A seconda della combinazione di fluorofori utilizzati oltre a GFP, prima il segnale di fluorescenza di lunghezza d'onda più lungo di imaging può produrre risultati migliori. Tuttavia, l'ordine in cui i fluorofori o proteine fluorescenti sono sottoposti a svuotamento stimolato dell'emissione e imaged dovrebbe essere ottimizzato per ottenere i più forti segnali di fluorescenza e la migliore risoluzione.
  9. Selezionare e impostare la potenza del laser STED per ogni fluoroforo sotto la scheda "Acquire" del software e utilizzare la barra di scorrimento per il 592-nm o il laser STED 660 nm per regolare la potenza del laser. Regolare la potenza del laser lo svuotamento 592-nm per GFP e Alexa Fluor 532. Regolare la potenza del laser di svuotamento di 660 nm per Alexa Fluor 568.
  10. Per aumentare la risoluzione e ridurre il segnale di fondo, andare alle impostazioni "Acquisizione" sotto la scheda "Acquire" del software, aumentare la linea e/o il frame in media selezionando un valore maggiore di 1 utilizzando il menu a discesa per ogni opzione.
  11. Inoltre, acquisire il segnale fluorescente usando tempo-gated STED spuntando l'opzione gating per il fluoroforo sotto la scheda "Acquire", e specificando i valori per tempo-gating (Vedi nota sotto). Aumentare la potenza del laser STED per migliorare la risoluzione, anche se ciò aumenterà anche photobleaching di fluorophores.
    Nota: Il tempo di gating dovrà essere ottimizzato per il microscopio, il campione e fluorofori utilizzati. Un tempo gating da 0,3 a 6 ns è raccomandato. Dopo la fissazione, la GFP è particolarmente sensibile ad alta potenza laser. Per ridurre il photobleaching di GFP, deve essere applicato il tempo gating e la potenza del laser STED deve essere ridotta.
  12. Per catturare immagini in 3D STED, usare il cursore per modificare il punto diffusa funzione (PSF) in "3D STED".
  13. Acquisire manualmente immagini multiple per assicurare la riproducibilità. Deconvoluzione le immagini (Vedi Figura 1) utilizzando un software di deconvoluzione di confezionare41(Vedi Tabella materiali).

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Risultati

Per le cellule B diffusione su immobilizzato anti-Ig, microscopia STED utilizzata in combinazione con il software di deconvoluzione fornisce immagini ad alta risoluzione delle strutture citoscheletriche di microscopia confocale. Questo è evidente nella Figura 1, dove la rete di F-actina è stata visualizzata mediante il protocollo descritto sopra. Un confronto tra confocale e immagini ad alta super-risoluzione STED dello stesso esempio illustra che le immagini...

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Discussione

Immagini dettagliate di strutture citoscheletriche possono essere ottenuti usando la microscopia STED super-risoluzione, che teoricamente può raggiungere una risoluzione di 50 nm, rispetto al convenzionale microscopia confocale, per cui la risoluzione di diffrazione limitata è ~ 200 nm 24. la capacità di risolvere strutture più fini è ulteriormente migliorata utilizzando software di deconvoluzione per calcolare la posizione più probabile della sorgente luminosa originale dal segnale di fluorescenz...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo la struttura di Imaging di UBC Life Sciences Institute (LSI) per sostenere e mantenere il microscopio STED. Questo lavoro è stato finanziato da grant #68865 l'istituti canadesi di ricerca sanitaria (a M.R.G.). Ringraziamo il dottor Kozo Kaibuchi (Università di Nagoya, Nagoya, Giappone) per il plasmide CLIP-170-GFP.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Coltura cellulare
A20 cellule di linfoma B di topoATCCTIB-208Linfoma murino a cellule B di origine Balb/c che esprime un BCR contenente IgG sulla sua superficie
RPMI-1640Thermo Fisher Scientific  R0883
Siero fetale bovinoThermo Fisher Scientific12483020Inattivare il calore a 56 oC per 30 min
2-mercaptoetanoloMillipore SigmaM3148
GlutamminaMillipore SigmaG5763
Piruvato di sodioMillipore SigmaP5280
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122Liquid, 10.000 unità<
forte>Materiali aggiuntivi per cellule B primarie
70-µ filtro per cellule mCorning352350
Kit di isolamento delle cellule B basato su biglie magneticheStemcell Technologies19854EasySep Mouse Kit di isolamento delle cellule B
Lipopolisaccaride (LPS)Millipore SigmaL4391LPS di E. coli 0111:Fattore
attivazione delle cellule B B4 (BAFF)R& D Systems2106-BF-010
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Transfection
Codifica plasmidico CLIP-170-GFPDono del Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Giappone); descritto in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Recommended reagents and equipment
Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003Seguire le indicazioni del produttore per miscelare i reagenti di trasfezione con il DNA
Amaxa Nucleofector modello 2bLonzaAAB-1001Programma L-013 utilizzato
Piastre Falcon a 6 pozzetti, trattate TC, steriliCorning353046
NomeCompanyNumero di catalogoComments
Rivestimento vetrini
18 mm di diametro rotondo #1.5 occhiali di coperturaThomas Scientific1217N81Prodotto simile: Marienfield-Catalogo superiore #117580
PinzeFisher Scientific1381242Pinze per schegge extra fini
Falcon Piastra per coltura tissutale sterile in polistirene perFalcon Corning353043
100% metanoloFisher ScientificA412-4
Soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) senza calcio o magnesioThermo Fisher Scientific10010049
Anticorpo IgG di capra anti-topoJackson ImmunoResearch115-005-008Per cellule A20
Anticorpo IgM di capra-anti-topoJackson ImmunoResearch115-005-020Per le cellule B primarie di topo
NameCompanyNumero di catalogoComments
Staining
Paraformaldeide (soluzione madre al 16%)Microscopia elettronicaSciences 15710Diluire con PBS alla concentrazione di lavoro
Glutaraldeide (soluzione madre al 50%)Millipore Sigma340855Diluire con PBS alla concentrazione di lavoro
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
SaponinaMillipore SigmaS2149
Albumina sierica bovina (BSA), Frazione VMillipore Sigma10735094001
Anticorpo anti-tubulina di coniglioAbcamab52866Diluizione 1:250 consigliata ma dovrebbe essere ottimizzata
Alexa Fluor 532-capra coniugata anti-coniglio IgGThermo Fisher ScientificA11009Diluizione 1:100 consigliata ma dovrebbe essere ottimizzata
Alexa Fluor 568-falloidina coniugataThermo Fisher ScientificA12380Diluizione 1:100 consigliata ma dovrebbe essere ottimizzata
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970Senza DAPI
Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopioFisher Scientific12-550-15
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Materiali
ParafilmVWRP1150-2
HEPESMillipore SigmaH3375
NaClFisher ScientificBP358
KClMillipore SigmaP9333
CaCl2Millipore SigmaC1016
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500
MgSO4Fisher ScientificM63
DestrosioFisher ScientificD16-500
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Microscopy
Leica SP8 TCS STED microscopioLeica
Voume ImagingVedere https://svi.nl/HuygensProducts
di tessuti sterili Huygens software di deconvoluzione Scientific

Riferimenti

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