Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata

Jia C. Wang; Madison Bolger-Munro; Michael R. Gold

doi:10.3791/57028

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata

13.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/57028

⸱

9 aprile 2018

Jia C. Wang¹ , Madison Bolger-Munro¹ , Michael R. Gold¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di microscopia STED contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine dei microtubuli in cellule di B che si sono diffuse sulle lamelle rivestite con gli anticorpi per il recettore delle cellule B, un modello per la fase iniziale di formazione della sinapsi immuni.

Abstract

Cellule di B che si legano agli antigeni di membrana-limiti (per esempio, sulla superficie di una cellula presentanti l'antigene) formano una sinapsi immuni, una struttura cellulare specializzata che ottimizza la segnalazione della B-cellula recettore (BCR) e acquisizione di antigene BCR-mediata. Il rimodellamento del citoscheletro di actina e il riorientamento della rete dei microtubuli verso il sito di contatto dell'antigene sono essenziali per la formazione della sinapsi immuni. Rimodellamento del citoscheletro in un denso anello periferico di F-actina è accompagnata dalla polarizzazione del centro di organizzazione dei microtubuli verso la sinapsi immune. Proteine leganti plus-fine dei microtubuli, come pure proteine corticale plus-fine acquisizione mediano interazioni fisiche tra il cytoskeletons actina e dei microtubuli, che consentono loro di essere riorganizzata in modo coordinato. Chiarire i meccanismi che questa riorganizzazione del citoscheletro, nonché a comprendere come queste strutture citoscheletriche forma formazione della sinapsi immuni e BCR di segnalazione, di controllo può fornire nuove intuizioni l'attivazione delle cellule B. Ciò è stata facilitata dallo sviluppo di approcci di microscopia di Super-risoluzione che rivelano nuovi dettagli di organizzazione della rete del citoscheletro. Descriviamo qui un metodo per l'utilizzo di microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine transfected GFP-etichettato microtubuli in cellule di B. Per modellare i primi eventi nella formazione della sinapsi immuni, permettiamo a cellule B a diffondersi sulle lamelle ricoperte di anticorpi (anti-Ig) anti-immunoglobulina, che avviano la segnalazione di BCR e rimodellamento del citoscheletro. Forniamo dettagliate protocolli per esprimere proteine di fusione di GFP in cellule di B-linfoma A20, per la diffusione di anti-Ig-indotta delle cellule e per la fissazione delle cellule successive, Immunostaining, acquisizione di immagini e passaggi di deconvoluzione di immagine. Le immagini ad alta risoluzione ottenute utilizzando queste procedure permettono di visualizzare contemporaneamente l'actina strutture, i microtubuli e proteine obbligatorie plus-fine dei microtubuli che possono collegare queste due reti del citoscheletro.

Introduzione

Quando le cellule B associare polarizzati matrici di antigeni (ad es., visualizzato sulla superficie dell'antigene-presentare cellule (APC)), il recettore della B-cellula risultante (BCR) segnalazione unità la formazione di una struttura classica sinapsi immuni, che era prima descritto in T cellule¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,