Qui sono disponibili due metodi per determinare la funzione di barriera intestinale. Un contatore epiteliale (volt/ohm) è utilizzato per la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale del epithelia coltivate direttamente in pozzi di coltura del tessuto. Nei topi, il metodo di alimentazione mediante sonda gastrica FITC-Destrano è utilizzato per determinare la permeabilità intestinale in vivo.
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Articolo metodologico
In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La barriera intestinale difende contro i microrganismi patogeni e tossine microbiche. La sua funzione è regolata dalla stretta della giunzione permeabilità e l'integrità delle cellule epiteliali, e rottura della funzione di barriera intestinale contribuisce alla progressione di malattia gastrointestinale e sistematica. Due semplici metodi descritti qui per misurare la permeabilità dell'epitelio intestinale. In vitro, le cellule Caco-2BBe sono placcate in pozzi di coltura del tessuto come uno strato monomolecolare e resistenza elettrica transepiteliale (TER) può essere misurato con un misuratore di epiteliale (volt/ohm). Questo metodo è convincente per la sua facilità di utilizzo e ripetibilità. In vivo, i topi sono gavaged con 4 kDa isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano e le concentrazioni di FITC-Destrano sono misurati in campioni di siero raccolti da topi per determinare la permeabilità epiteliale. Alimentazione mediante sonda gastrica orale offre una dose precisa e pertanto è il metodo preferito per misurare la permeabilità intestinale in vivo. Presi insieme, questi due metodi in grado di misurare la permeabilità dell'epitelio intestinale in vitro e in vivoe quindi essere usati per studiare la connessione tra malattie e funzione di barriera.
Introduzione
Cellule epiteliali intestinali non sono solo responsabili per l'assorbimento dei nutrienti, ma anche formano una barriera importante per difendere contro microrganismi patogeni e tossine microbiche. Questa funzione di barriera intestinale è regolata da permeabilità stretta della giunzione e delle cellule epiteliali integrità1,2,3, e disfunzione della funzione di barriera epiteliale è associata con infiammatorie intestinali malattia (IBD). L'anello di actomiosina perijunctional (PAMR) si trova all'interno della cellula che è strettamente contigua per giunzioni strette. La cont....
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dalla cura degli animali e uso protocollo di Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU), Soochow University.
1. placcatura e la manutenzione di Caco-2bbe sulle membrane porose in policarbonato
- Crescere le cellule in una boccetta di T75 con media (DMEM contenente 10% FBS). Boccette dovrebbero essere alimentati regolarmente, a seconda della densità delle cellule.
Nota: Per la placcatura ottima, cellule dovrebbero dividersi rapidamente e hanno una forma piatta "fritto-uovo", che indica che le cellule sono in fase di crescita. - Una volta che le cellule sono 80% confluenti, prendere il p....
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Risultati
In coltura, cellule Caco-2BBe crescono come uno strato monomolecolare e lentamente differenziano in enterociti assorbenti maturi che hanno bordi del pennello. In questo protocollo, le cellule Caco-2BBe sono state placcate con un'alta densità su membrane in policarbonato e celle raggiunto 100% confluency un giorno dopo la semina. Tuttavia, le cellule sono indifferenziate in questa fase: completamente differenziare le cellule, il media è cambiato ogni 2-3 giorni per 3 settimane. Le cellule .......
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Discussione
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Le cellule Caco-2BBe (confine-esprimendo la spazzola) vengono sempre utilizzate per la misurazione di TER, selezionato dalla linea delle cellule Caco-2 per l'espressione delle proteine del spazzola-confine. Le cellule Caco-2BBe hanno un fenotipo assorbente del villo quando completamente differenziato (dopo circa 3 settimane di post-confluenza cultura)17. È necessario per evitare la contaminazione durante la misurazione e per sterilizzare l'elettrodo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Ringraziamo il dottor Jerrold R. Turner, da Brigham and Women Hospital, Harvard Medical School, per il suo generoso aiuto nel completare questo studio. Questo lavoro è sostenuto da Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (concessione numero 81470804, 31401229 e 81200620), il Natural Science Foundation di Jiangsu Province (concessione numero BK20180838 e BK20140319), programma di ricerca dell'innovazione per Collegio laureati della provincia di Jiangsu (concessione numero KYLX16-0116), Advanced Research Progetti di Soochow University (concessione numero SDY2015_06) e di Crohn & colite Foundation Research Fellowship Award (grant numero 310801).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 22 G gavage ago | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-destrano | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Piastre nere a 96 pozzetti per fluorescenza | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 topi | Nanjing Biomedical Research Institute dell'Università | ||
| Cellule Caco-2BBe | ATCC | CRL-2102 | |
| destrano solfato di sodio | MP Biomedicals 2160110 | ||
| DMED con alto contenuto di glucosio e piruvato di sodio | di iclone | SH30243.01B | |
| Millicell-ERS | MERS00002 | ||
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagente | 10009218 | |
| provetta Falcon (15 mL) | Corning | ||
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus | FV1000 | |
| Fluorimetro | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM di glucosio | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Centro modulare per l'inclusione dei tessuti | Leica | EG1150H | |
| Provette per la raccolta del siero | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 pallone | per corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Membrane in policarbonato (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pompa a pressione | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Microtomia rotativa | Leica | RM2235 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xilene | Sinopharm ChimicoReagente | 10023418 |
Riferimenti
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & ....
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Ristampe e permessi
