Trattamento combinatorio di tricostatina A e la vitamina C migliora l'efficienza di clonazione topi da trasferimento nucleare di cellule somatiche

Sommario

Descriviamo un metodo migliorato notevolmente per mouse clonazione usando tricostatina A, vitamina C e deionizzata albumina di siero bovino. Vi mostriamo un protocollo semplificato, riproducibile che supporta lo sviluppo efficiente di embrioni clonati. Quindi, questo metodo potrebbe diventare una procedura standardizzata per la clonazione del mouse.

Abstract

Trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) offre un'opportunità unica per produrre direttamente un animale clonato da una cellula donatrice, e richiede l'utilizzo di tecniche abili. Inoltre, le efficienze di clonazione sono rimasti basse poiché il successo della produzione di animali clonati, soprattutto topi. Ci sono stati molti tentativi per migliorare l'efficienza di clonazione e tricostatina A (TSA), un inibitore delle deacetilasi istoniche, è stato ampiamente utilizzato per migliorare l'efficienza di clonazione. Qui, segnaliamo un metodo di clonazione notevolmente migliorato nei topi. Questo metodo di trasferimento nucleare del somatocita comporta l'utilizzo del virus Hemagglutinating del Giappone busta (HVJ-E), che consente la facile manipolazione. Inoltre, il trattamento utilizzando due piccole molecole, TSA e vitamina C (VC), con l'albumina di siero bovino deionizzata (dBSA), è altamente efficace per lo sviluppo embrionale. Questo approccio richiede ulteriori iniezione né manipolazione genetica e presenta dunque un metodo semplice, adatto per l'uso pratico. Questo metodo potrebbe diventare un approccio tecnicamente fattibile per i ricercatori per la produzione di animali geneticamente modificati da cellule coltivate. Inoltre, potrebbe essere un modo utile per il soccorso di animali in via di estinzione tramite clonazione.

Introduzione

La tecnologia SCNT consente la produzione di animali clonati utilizzando solo una cellula somatica o un nucleo di essere trasferito a un ovocita enucleated. Uno degli scopi della tecnica SCNT è la derivazione di linee di cellule staminali embrionali (NT-ESCs) trasferimento nucleare da embrioni clonati. Nel 1998, Wakayama et al., segnalati producendo un mouse con successo clonato denominato Cumulina per la prima volta¹. Da allora, la clonazione dei topi è stata ampiamente studiata, e molti importanti intuizioni riprogrammazione nucleare dei nuclei somatici sono stati ottenuti. D'altra parte, questa tecnica è accompagnata da numerosi passaggi di micromanipolazione che sono piuttosto difficili da Maestro, che richiedono una formazione intensiva di più di 3 mesi².

Produzione di topi clonati utilizzando SCNT si è evoluta dal originale Honolulu metodo¹, il metodo di elettrofusione³, per il metodo di fusione cellulare da virus Hemagglutinating del Giappone (HVJ)⁴. Tuttavia, l'iniezione diretta di un nucleo cellulare attraverso la cytomembrane tende a compromettere la sopravvivenza degli ovociti. L'elettrofusione è basso in termini di efficienza, poiché ogni membrana cellulare ha durezza differente, che lo rende difficile determinare una condizione ottima. La gestione di HVJ è laboriosa poiché richiede attrezzature specifiche per la sicurezza di ricercatori e di animali da laboratorio. Recentemente, per fondere il citoplasma delle cellule e degli ovociti di donatori, HVJ-E è stato usato⁵. HVJ-E ha solo la capacità di fondere le membrane senza la capacità proliferativa o infettiva del virus. RNA genomico di HVJ sono completamente inattivato in HVJ-E. L'utilizzo di HVJ-E supporta così facile movimentazione della fusione cellulare durante SCNT.

Parecchi rapporti hanno indicato che il trattamento degli embrioni SCNT con TSA, un inibitore delle deacetilasi istoniche, migliora notevolmente l'efficienza di produzione di cuccioli dal vivo da meno di 1% al 6,5%^6,7. Trattamento di TSA accelera riprogrammazione tramite modifica dell'istone marchi SCNT embrioni⁸. Recentemente, l'iniezione di particolare mRNA, sottofamiglia Istone lisina demetilasi 4 (KDM4), che rimuovere lisina istone H3 9 (H3K9) trimethylation in embrioni SCNT, soprattutto alle regioni riprogrammazione-resistente, è stato indicato per aumentare lo sviluppo di clonato embrioni di topo⁹. Nel frattempo, VC, che serve anche come un modificatore di istone, ha diminuito trimethylation di H3K9¹⁰. Inoltre, VC migliora lo sviluppo embrionale nella specie suina SCNT¹⁰. È stato segnalato che l'iniezione di dBSA negli embrioni SCNT conduce al miglioramento di sviluppo embrionale¹¹.

Precedentemente abbiamo trovato che la combinazione di piccole molecole, vale a dire TSA e VC, insieme a dBSA, migliorato drammaticamente sviluppo del SCNT embrioni¹². Qui, abbiamo dettaglio il metodo SCNT precedentemente segnalato per topi, che rappresenta a procedure altamente efficiente e semplice clonazione¹². Descriviamo anche la manipolazione di HVJ-E. Questi potrebbe aiutare molti ricercatori nel campo della biologia riproduttiva e dello sviluppo di preservare risorse genetiche o di produrre animali geneticamente modificati attraverso questo metodo SCNT.

Protocollo

Tutte le procedure di animale conformano alle linee guida di Kindai University per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. preparazione di terreni di coltura

1. Preparare il supporto di KSOM (mKSOM) modificato per la coltura embrionale, composto da 95 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 0,35 mM KH₂PO₄, 0,2 mM MgSO₄ · 7H₂O, 1,71 mM CaCl₂ · 2H₂O, 0,2 mM P (+)-glucosio, 0,2 mM sodio piruvato, L-Glutammina, polivinilpirrolidone (PVP), mM 25,07 NaHCO₃, 1,0 g/L di 1.0 mM 10 mM DL-lattato di sodio 0,05 g/L penicillina e streptomicina in acqua sterile 0,05 g/L.
2. Preparare il supporto di tamponata Hepes CZB (HCZB) per la manipolazione dell'embrione, costituito da 81,5 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,7 mM CaCl₂ · 2H₂O, 1,18 mM MgSO₄ · 7H₂O, 1,18 mM KH₂PO₄, 0,11 mM EDTA · 2NA, 36,1 mM DL-lattato di sodio, 5,55 mM P (+)-glucosio, 0,025 g/mL penicillina, 0,035 g/L streptomicina, 0,014 mM rosso fenolo, alcool polivinilico 1,0 g/L, 5.0 mM NaHCO₃e 20,0 mM Hepes sale di sodio in acqua sterile.
3. Preparare il supporto di attivazione per l'attivazione degli ovociti: mKSOM supplementato con 50 nM TSA, 2 mM EGTA, 5 µ g/mL citocalasina B (CB) e 5 mM SrCl₂.

2. preparazione di deionizzata albumina di siero bovino (dBSA)

1. Sciogliere 1,2 g di albumina di siero bovino (BSA) in 10 mL di acqua sterile a temperatura ambiente (una concentrazione finale di 12%).
2. Aggiungere circa 0,12 g di perle di resina di scambio ionico misto al precedente preparato 12% di BSA in acqua sterile a temperatura ambiente con agitazione delicata.
3. Quando le perline cambia colore dal blu-verde all'oro, recuperare la soluzione surnatante con una pipetta. Quindi sostituire le perline con il fresco (Figura 1).
   Nota: La sostituzione di perline normalmente viene eseguita una sola volta. Forse richiede poche sostituzioni di deionizzazione completa. Solo come una guida, se il colore delle perle rimane invariato da blu-verde all'oro, indica che lo scambio ionico è completo.
4. Recuperare la soluzione dopo la conferma che non esiste nessun cambiamento di colore nelle perle.
   Nota: Se la soluzione recuperata diventa torbida, centrifugare per impedire l'intasamento del filtro (175 x g, 5 min).
5. Integrare il recuperato la soluzione con 250 µ l di 10,5% NaHCO₃.
   Nota: Questo processo è inteso per la soluzione di dBSA neutralizzare condizione di pH. Tuttavia, NaHCO₃ può essere superflua.
6. Sterilizzare il supernatante utilizzando un filtro da 0,45 µm e conservare a-20 ° C come soluzione di riserva dBSA.

3. ovocita collezione

Nota: Tutti i topi sono stati mantenuti in camere con aria condizionate e luce controllata.

1. Super-ovulare ogni mouse B6D2F1 femminile (età compresa tra 8-10 settimane) tramite l'iniezione intraperitoneale di 7,5 UI di gonadotropina del siero di cavalla gravida (PMSG) e 7,5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) 48 h dopo l'iniezione di PMSG.
2. Eseguire l'eutanasia di dislocazione cervicale 14-16 h dopo l'iniezione di hCG. Incise l'addome per accedere il tratto riproduttivo usando tecniche di dissezione standard¹³. Brevemente, pizzicare la pelle e fare una piccola incisione laterale al midline con le forbici. Tenere la pelle saldamente sopra e sotto l'incisione e tirare la pelle verso la testa e la coda. Tagliare il peritoneo utilizzando le forbici, spingere via le bobine dell'intestino e confermare la presenza di due corni dell'utero, ovidotti e le ovaie.
3. Estirpare ovidotti con piccole Forbici rette e pinzette, posto su un foglio di carta da filtro per pulire il sangue dalla superficie. Impostare gli ovidotti in olio minerale. Quindi, tagliare l'ampolla dell'ovidotto utilizzando aghi di dissezione e spostare i complessi cumulo-ovocita proveniente dal ampulla dell'ovidotto in gocce per 200 µ l di HCZB con 0,1% ialuronidasi. Incubare per 5 minuti su una piastra riscaldante.
   Attenzione: Un'esposizione di più di 10 min in mezzo HCZB con 0,1% ialuronidasi sarebbe dannosa per gli ovociti.
4. Confermare che le cellule del cumulo vengono rilasciate dai complessi cumulo-ovocita sotto un microscopio stereoscopico, trasferimento seconda metafase meiotica (MII) fase ovociti con alcune cellule del cumulo restante per mKSOM media contenenti 0,3% dBSA. Quindi, lavare gli ovociti di fase MII quattro volte pipettando su e giù (usando una pipetta di < 100 µm di diametro interno) in mKSOM media contenenti 0,3% dBSA per staccare le restanti cellule del cumulo.
   Nota: L'uso di una pipetta piccola facilita il distacco delle cellule del cumulo.
5. Incubare gli ovociti di fase di Mll in mKSOM Media contenente dBSA 0,3% a 37 ° C inferiore al 5% CO₂ incubatrice fino al enucleation.
   Nota: È consigliabile una piccola pipetta con un diametro che è leggermente superiore a quello dell'ovocita.

4. preparazione delle cellule erogarici per trasferimento nucleare

1. Dopo passi 3,3-3,5, ovociti decumulati sono isolati dai complessi cumulo-ovocita. Trasferire una piccola quantità (circa 2 µ l) delle restanti cellule del cumulo dislocate dai complessi cumulo-ovocita nel mezzo di HCZB con l'ialuronidasi 0,1% a mezzo HCZB con 6% dBSA utilizzando una pipetta sotto un microscopio stereoscopico.
2. Posizionare le cellule del cumulo in mezzo HCZB con 6% dBSA sulla piastra riscaldante a 37 ° C fino a quando necessario per SCNT.
   Nota: Quando le cellule del fibroblasto (ad es., cellule dei fibroblasti embrionali murini) sono usate come cellule del donatore, staccare le cellule da un piatto di coltura del tessuto e centrifugare a loro in una pallina. Risospendere il pellet di cellule nel mezzo HCZB che contiene 6% dBSA.

5. enucleazione di ovociti

1. Preparare il supporto di PVP di 9% aggiungendo 0,9 g PVP a 10 mL di terreno di HCZB, conservare in frigorifero durante la notte (4 ° C) e poi sterilizzarlo usando un filtro da 0,45 µm.
2. Preparare soluzioni «stock» CB (concentrazione di 1 mg/mL) con l'aggiunta di 5 mg di CB a 5 mL di solfossido dimetilico (DMSO). Diluire la soluzione di riserva CB con il mezzo di HCZB (una concentrazione finale di 5 µ g/mL) e utilizzare come soluzione di enucleazione.
3. Lavare gli ovociti di fase di Mll in 20 µ l di terreno HCZB contenente 5 µ g/mL CB (soluzione di enucleazione) di inspirare ed espirare attraverso la pipetta sterilizzata (diametro interno: 150 µm a 200 µm). Ripetere il lavaggio cinque volte. Attendere circa 10 min sulla piastra di riscaldamento in soluzione di enucleazione prima di iniziare il processo di enucleazione.
4. Preparare la camera di enucleazione come mostrato nella Figura 2A. Trasferire gli ovociti di Mll alla camera di enucleazione di inspirare ed espirare con la pipetta (diametro interno: 150 µm a 200 µm); mettere 4 µ l di soluzione di enucleazione e coprire la camera con olio minerale.
   Nota: Invece di una camera, una cover di un 60mm di Petri può essere utilizzata.
5. Identificare i mandrini e cromosomi dell'ovocita fase MII al microscopio (400 X) a temperatura ambiente. Orientare l'ovocita di fase di Mll con il primo globulo polare pronunciato, in modo che il posizionamento del mandrino e del cromosoma è alle 3 o 9 posizione (Figura 2B) usando una pipetta di supporto e la micropipetta.
   Nota: Il microscopio utilizzato ha lenti di ingrandimento di 400 volte in totale. Inoltre, la lente dell'obiettivo Nardi è 5 X / 0.12 e 40 X / 0.55. L'azionamento di impulso piezo-elettrici della pipetta consente rapida perforazione della zona pellucida. Inoltre, un sistema laser (ad esempio, XYClone) è anche utilizzabile per la perforazione della zona pellucida al posto del sistema di azionamento piezo-elettrico.
6. Impostare l'intensità di stimolazione piezo per 3-6 e drill per la zona pellucida usando una pipetta di micromanipolazione (7-8 µm diametro interno estremità piatta in punta) con l'impulso di piezo di guida. Dopo l'apertura di un foro nella zona pellucida, completamente enucleare i mandrini e cromosomi con una minima quantità di citoplasma (Figura 2).
   Nota: Durante questo processo, gli ovociti tendono a strettamente attaccare sul fondo del piatto o dispensare dovuto il mezzo senza BSA¹⁴. Entro 10 minuti, deve essere completato il processo di enucleazione e gli ovociti enucleated devono essere restituiti nell'incubatore. Il numero appropriato di ovociti che possono essere manipolate in un enucleation è tra 10 e 20. Per grandi lotti di ovociti, si ripete la procedura di enucleazione.
7. Confermare l'assenza dei cromosomi nel citoplasma sotto luce visibile (Figura 2, medio), quindi lavare accuratamente gli ovociti enucleated in mKSOM medium contenente 0,3% dBSA carente CB. Introdurre il piatto nell'incubatore a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ fino a quando la fusione cellulare.
   Nota: Dopo il enucleation, rimosso da ooplasma citoplasma contiene i mandrini e cromosomi.

6. fusione di una cellula donatrice e un ovocita Enucleated

1. Preparazione di HVJ-E
   1. Aggiungi 260 µ l di soluzione di sospensione HVJ-E ghiacciata a liofilizzato HVJ-E (da kit, vedere la Tabella materiali) e pipettare su e giù fino a quando completamente sospesa.
      Nota: La quantità appropriata di liofilizzato HVJ-E viene preparata in una bottiglia, e 260 µ l HVJ-E sospensione soluzione è incluso nel kit.
   2. Preparare 5 aliquote µ l della soluzione HVJ-E e quindi conservare a-80 ° C fino a fusione cellulare.
      Attenzione: Trattare con cura il HVJ-E su ghiaccio, poiché è sensibile alla temperatura. Dopo il completamento dell'esperimento, in modo appropriato autoclave HVJ-E materiali e contenitori per inattivare completamente componenti virus.
2. Fusione cellulare
   1. Diluire il 5 µ l di soluzione di HVJ-E con 20 µ l di tampone di fusione la cella immediatamente prima dell'uso. Posto la soluzione diluita di HVJ-E su ghiaccio fino all'utilizzo.
      Nota: Il buffer di fusione delle cellule è incluso nel kit HVJ-E.
   2. Preparare la camera di fusione delle cellule come mostrato in Figura 3A. Trasferire gli ovociti enucleated a terreno di HCZB sulla camera di fusione di cella usando la pipetta (diametro interno: 150 µm a 200 µm); posto 4 µ l di ciascuna soluzione (mezzo HCZB che contiene 6% -BSA per le cellule erogarici, soluzione HVJ-E, HCZB medio, 9% PVP in mezzo HCZB) e coprire la camera con circa 1 mL di olio minerale.
      Nota: Il numero appropriato di enucleated ovociti che vengono trasferiti alla camera per manipolazione durante una procedura di fusione delle cellule è da 5 a 30. Per grandi lotti di ovociti, si ripete la procedura di fusione delle cellule. Invece di camera, una cover di 60 mm di Petri può essere utilizzata, se disponibile.
   3. Posizionare gli ovociti enucleated nel mezzo di HCZB sotto un microscopio a 400 X magnificationat temperatura. Aspirare le cellule del donatore con la pipetta di micromanipolazione (6-7 µm diametro interno estremità piatta in punta) e di espellere le cellule in soluzione di sospensione HVJ-E.
   4. Quindi aspirare le cellule del cumulo uno per uno con la soluzione di sospensione HVJ-E altrettanto essere separato da altro, consentendo la fusione cellulare seriale. Tenere gli ovociti enucleated medium HCZB facendo uso di una pipetta di supporto. Forare la zona pellucida con la pipetta di micromanipolazione con l'impulso di piezo (intensità di 3-6, velocità di 2-3).
   5. Dopo aver aperto il foro nella zona pellucida, mettere una cella di cumulus strettamente alla membrana dell'ovocita, insieme con la soluzione di sospensione HVJ-E con un volume di 5 volte il volume di una cella di cumulus, senza passare attraverso la membrana dell'ovocita.
      Nota: Preparare 6-7 punte di estremità piatta di µm di diametro interno di pipette di micromanipolazione per le cellule del cumulo. Pipette devono essere lavati regolarmente usando 9% PVP mezzo per mantenere il rilascio regolare delle cellule. 6.2.3 --passi-6.2.5 devono concludersi entro 10 min, o l'efficienza di fusione cellulare sarà inferiore. Attività di fusione della membrana di HVJ-E è inattivato in autoclave, trattamento con etanolo al 70%, o un detergente. Dopo l'esperimento, la soluzione di HVJ-E deve essere opportunamente smaltita.
   6. Dopo manipolazione di fusione cellulare, prontamente trasferire gli ovociti mKSOM media contenenti 0,3% dBSA e spostare in un incubatore a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 1 h.

7. attivazione del ricostruito ovociti e trattamento con tricostatina A e vitamina C

1. Preparazione di TSA
   1. Pipettare 5 mM TSA soluzione in 3 aliquote µ l e conservare la soluzione a-20 ° C.
   2. Aggiungere 2,5 µ l di soluzione madre di TSA di 5 mM a 1 mL di DMSO (a una concentrazione di 12,5 µM).
   3. Diluire 8 µ l di 12,5 µM TSA soluzione in 2 mL di attivazione medio e medio mKSOM (una concentrazione finale di 50 nM).
2. Preparazione di VC
   1. Aggiungere 1 mg di VC in 1 mL di acqua sterile privo di endotossina e conservare a-20 ° C.
   2. Aggiungere la soluzione di riserva di VC mKSOM medio (una concentrazione finale di 10 µ g/mL).
3. Attivazione degli ovociti ricostruiti
   1. Un'ora dopo la fusione cellulare, controllare la condensazione prematura dei cromosomi (PCC) in ovociti ricostruiti (Figura 3B) utilizzando un microscopio (400 X).
   2. Trasferire gli ovociti ricostruiti al mezzo di attivazione (Vedi punto 1.3) contenenti TSA e incubare per 6 h a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ nell'aria (Figura 3). Osservare la formazione di pro-nuclei negli embrioni SCNT, quindi applicare 2 ore di trattamento TSA in mKSOM media contenenti 0,3% dBSA (Figura 2).
4. Trasferire gli embrioni trattati con TSA mKSOM supplementato con VC e incubare per 7 h, come illustrato nella Figura 3D.
5. Dopo 7 h del trattamento VC, trasferire gli embrioni trattati con VC mKSOM media contenenti 0,3% dBSA e incubare per 4 giorni a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ nell'aria.
   Nota: Per produrre topi clonati, trasferire gli embrioni morfologicamente normale fase 2-cell in ovidotti di topi femminili pseudo-incinto (MCH(ICR)) il giorno quando un plug vaginale viene trovato (giorno 0,5 di pseudogravidanza)¹⁵. Dopo 19,5 giorni, il numero di siti di impianto ed i neonati è registrato dopo la sezione cesarean.

Risultati

Per produrre embrioni clonati del mouse, le cellule del cumulo e fibroblasti fetali sono stati usati. Il numero di ovociti ricostruiti e sviluppo alla fase 2 celle dopo l'attivazione dell'ovocita è riportato nella tabella 1. Un tasso molto alto di formazione pronuclei (89-100%) e lo sviluppo alla fase 2 celle (77-89%) sono stati osservati in tutte le condizioni. Alcuni degli embrioni clonati, che sono stati derivati dalle cellule cumulus e sviluppati alla fase 2 celle, furono trasferite a ovidotti delle pseudo-gravidanze. Sei clonati prole fuori 72 embrioni trasferiti erano prodotte da tre femmine gravide dal trattamento seriale di TSA e VC (Figura 4). Circa il 15% degli embrioni clonati sono stati segnalati per svilupparsi a termine seguendo questo SCNT procedure¹². Inoltre, il trasferimento degli embrioni clonati 2 celle alle altre istituzioni ha raggiunto piccoli vivi 9 al 15%, che rappresenta il migliore sviluppo rispetto al singolo trattamento di TSA su embrioni clonati. Inoltre, il trattamento con TSA e VC ha migliorato significativamente l'efficienza dello sviluppo embrionale in vitro alla fase blastocisti (tabella 2, P < 0.05, test t di Student). Questi dati di inerente allo sviluppo in vitro dimostrano che l'effetto positivo della TSA e VC è limitato da diversi ceppi di topi né da tipi di cellule. Questi risultati indicano che questo metodo SCNT facilita la capacità di sviluppo degli embrioni clonati.

Figura 1: Preparazione di dBSA.
Procedure dettagliate per la preparazione di soluzione dBSA sono raffigurate. Nella misura di scambio ionico può essere giudicata dal cambiamento di colore delle perle. Mostra la figura di sinistra superiore che 1,2 g di BSA è disciolto in 10 mL di acqua sterile a temperatura ambiente. Dopo BSA è dissolto, le perle di resina di scambio ionico vengono aggiunti (alto a destra). Quando la miscela di soluzione di BSA con perle di resina di scambio ionico cambia colore dal blu-verde all'oro (basso a destra), sostituire le perline con quelli freschi. La figura in basso a sinistra mostra che rimane il colore delle perle blu-verde, e scambio ionico è finito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Procedure di enucleazione.
(A) un'illustrazione della camera enucleazione. Enucleation di ovociti è effettuato nel medio HCZB con CB. Per il sistema di azionamento piezo, un posto di mezzo PVP 9% viene utilizzato per preparare la pipetta di vetro per enucleazione. Macchie sono coperti da olio minerale. (B) un diagramma e un Micrografo mostrare la posizione dei mandrini e cromosomi prima enucleazione. Punte di freccia di nero: i mandrini e cromosomi. Punte di freccia rosse: il primo corpo polare. Diagramma (C) A e un Micrografo mostrare successo enucleazione. Punte di freccia di nero: i mandrini e cromosomi. Punta di freccia rossa: il primo corpo polare. Freccia blu: il foro nella zona pellucida. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Procedure di fusione di cella e condizione degli embrioni SCNT della coltura.
(A) un'illustrazione della camera di fusione delle cellule. Fusione cellulare avviene nel mezzo di HCZB che contiene 6% dBSA. Un posto di mezzo PVP 9% è utilizzato per preparare la pipetta di vetro per fusione cellulare. Macchie sono coperti da olio minerale. (B) un diagramma e un Micrografo della condensazione prematura dei cromosomi formata un'ora dopo la fusione delle cellule (freccia nera). Diagramma (C) A e un Micrografo della struttura pronuclei formati sei ore dopo l'attivazione (frecce nere). (D) sistema del trattamento TSA, VC e dBSA per gli embrioni SCNT. Freccia verde rappresenta il trattamento con TSA, seguita da incubazione con VC (freccia gialla) sotto mKSOM mezzo contenente con 0,3% dBSA (freccia blu). Le frecce indicano i tempi per il cambio medio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Prole clonati derivati da cellule del cumulo solo dopo taglio cesareo dopo 19,5 giorni di gravidanza.
Esistono abruptio nella fila superiore. La prole clonata mostrata qui sono stata generata in uno esperimento di trasferimento nucleare da tre madri affidatarie. La placenta era 1,5 a 2 volte più grande della dimensione di quelle prodotte da fecondazione in vitro . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gruppo	Tipo di cellule del donatore	Razza del topo		Lol di ovociti utilizzati	Lol di ovociti fusa	Lol di ovociti risultati condensazione prematura dei cromosomi	Lol di ovociti risultati formazione pronuclei (%)	Lol di ovociti pronuclei-formata che ha sviluppato agli embrioni 2 celle (%)
TSA, VC	Cumulus	C57BL/6 × DBA/2		84	82	82	81 (99)	72 (89)
non trattati	Cumulus	C57BL/6 × DBA/2		84	82	82	82 (100)	68 (83)
TSA, VC	dei fibroblasti fetali	MCH(ICR)×MCH(ICR)		202	171	169	151 (89)	124 (82)
non trattati	dei fibroblasti fetali	MCH(ICR)×MCH(ICR)		201	171	147	142 (97)	109 (77)

Tabella 1: effetti del trattamento TSA e VC sulla in vitro sviluppo di embrioni di topo clonato per la fase 2-cell.

Gruppo	Tipo di cellule del donatore	Razza del topo		Lol di embrioni di 2 celle utilizzati	Lol di 2 celle embrioni sviluppati per ogni fase (%)
					4-cella	morula	blastocisti
TSA, VC	Cumulus	C57BL/6 × DBA/2		152	152 (100)	149 (98)	135 (89) un
non trattati	Cumulus	C57BL/6 × DBA/2		83	47 (57)	41 (49)	32 (39) b
TSA, VC	dei fibroblasti fetali	MCH(ICR)×MCH(ICR)		124	110 (89)	101 (81)	88 (71) c
non trattati	dei fibroblasti fetali	MCH(ICR)×MCH(ICR)		109	54 (50)	45 (41)	29 (27) d
a-b, c-d Gli apici differenti all'interno delle cellule del donatore stesso rappresentano le differenze significative (P < 0,05)

Tabella 2: effetti del trattamento TSA e VC sulla in vitro sviluppo di embrioni di topo clonato alla fase blastocisti.

Discussione

In conclusione, questi risultati indicano che il metodo presentato SCNT potrebbe ridurre le difficoltà tecniche e aumentare l'efficienza del SCNT senza richiedere modificazioni genetiche ed il completamento di mRNA (tabella 1, tabella 2) e garantire produzione stabile di embrioni clonati. Questo metodo ci consente di ricostruire più embrioni SCNT rispetto ai metodi convenzionali a causa della migliore tasso di sopravvivenza e protocollo semplificato. In questo protocollo, un passaggio fondamentale è la fusione cellulare. Per produrre con successo clonati topi, è fondamentale per garantire che la quantità adeguata di HVJ-E descritto nel protocollo viene mantenuta durante il processo di fusione delle cellule e gli ovociti devono essere restituiti nell'incubatore entro 10 min durante i passaggi 6.2.3 - 6.2.5. Poiché le cellule erogarici di 20-30 possono essere aspirate insieme HVJ-E contemporaneamente nella pipetta di manipolazione, il numero di ovociti ottenuti con una sola operazione è maggiore di quella del metodo esistente. Alla fine, possiamo produrre ovociti ricostruiti circa 20-30 entro 10 min. Anche quando si lavora con una grande serie di ovociti (100 o più), la procedura di fusione delle cellule dovrebbe prendere un'ora o meno ripetendo i passaggi 6.2.3 - 6.2.5. Il metodo e le tecniche qui presentate possono servire come efficienti protocolli con requisiti tecnici semplificati.

Attualmente, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo degli embrioni SCNT sono ancora poco chiari. Questo metodo SCNT migliorato contribuisce anche allo studio di tali meccanismi di riprogrammazione, dato che questo metodo può produrre molti embrioni clonati in un solo esperimento. Questo metodo utilizza cellule somatiche con le membrane delle cellule intatte per fusione cellulare. Quindi, sarebbe possibile applicare questo approccio ad altre cellule come cellule punta coda¹⁶,¹⁷di cellule di sertoli e cellule staminali embrionali (ES)¹⁸. Quando vengono utilizzati i metodi convenzionali di SCNT per l'iniezione di cellule relativamente grandi, come le cellule di punta coda, direttamente nel citoplasma dell'ovocita, diventa anche più tecnicamente impegnativo ottenere embrioni dal vivo. Inoltre, cellule relativamente dure, come cellule di sertoli, sono difficili da rompere pipettando per via parenterale. Quando si considerano questi vari tipi di cellule, il metodo di fusione delle celle che utilizzano HVJ-È semplice ed efficace. Anche se il valore e la sicurezza di HVJ-E sono stati dimostrati in modo convincente^19,20, potrebbe essere importante per ri-considerare la possibilità di usando HVJ-E per la produzione di animali clonati per scopi agricoli o biomedicali.

Inoltre, recentemente un gruppo prodotto con successo clonati topi derivati da urina cellule²¹. Per salvare la specie di mammiferi in via di estinzione, d'ora in poi SCNT usando le cellule raccolte in maniera non invasiva, ad esempio la cella di urina, sarà ideale. Più recentemente, un altro gruppo ha direttamente generato topi clonati utilizzando antigene-specifici CD4 cellule⁺ T²². Sarebbe interessante esaminare se questo metodo è applicabile per clonare in modo efficiente i topi da tali cellule. Inoltre, Latrunculina A è stato segnalato come un'alternativa migliore per inibire la polimerizzazione dell'actina durante l'enucleazione e partenogenetico attivazione di SCNT ovociti²³. Lo studio futuro può rivelare se il trattamento di Latrunculina A, invece di citocalasina B, migliora ulteriormente la generazione della prole clonato. Inoltre, il trattamento di TSA è stato utilizzato con successo nei topi, maiali²⁴e conigli²⁵ modificando la concentrazione, periodo e durata del trattamento. Inoltre, il VC non solo migliora lo sviluppo embrionale nella specie suina SCNT¹⁰, ma migliora anche la produzione di cellule iPS in esseri umani e topi²⁶. Pertanto, è plausibile a speculare che la TSA e VC trattamento può essere applicato anche ad altre specie di mammiferi, e potremmo dover ottimizzare i tempi di trattamento della TSA e VC per ciascuna specie.

In conclusione, questo metodo renderebbe possibile generare topi clonati con un pratico livello di efficienza con procedure semplici. Di conseguenza, i risultati di questo studio potrebbero condurci a utilizzare la tecnologia SCNT per preservare le risorse genetiche degli animali rari e per comprendere i meccanismi molecolari della riprogrammazione nucleare e lo sviluppo embrionale precoce.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaCl	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	28-2270-5	Per
KCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-03542	Per KH
2PO4	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	165-04242	Per
MgSO4 e middot; 7H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	137-00402	Per
CaCl2 e middot; 2H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	039-00431	Per il medio
D (+)-glucosio	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	041-00595	Per medio
Piruvato di Sodio	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	199-03062	Per
L-Glutammina	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	G3126	Per
medio Polivinilpirrolidone	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	168-17042	Per
NaHCO3	Nacalai tesque, Inc.	31213-15	Per
il DL-Lattato di sodio	Nacalai tesque, Inc.	31605-72	Per la
penicillina	Meiji Seika Pharma Co., Ltd.	4987222637671 (GTIN-13)	Per
la streptomicina	Meiji Seika Pharma Co., Ltd.	4987222665643 (GTIN-13)	Per
acqua sterile media, priva di endotossine	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	196-15645	Per
EDTA medio e middot; 2Na	Dojindo Lab.	345-01865	Per
rosso fenolo	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	P0290	Per
sale sodico HEPES	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	H3784	Per
alcool polivinilico	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	P8136	Per
albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	A3311	Per resina
media BT AG 501-X8 (D)	Bio-Rad Lab., Inc.	143-7425	Per la preparazione di dBSA
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	H3506	Per la raccolta di ovociti e cellule cumuliformi
Citocalasina B	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	034-17554	Per l'enucleazione e l'attivazione degli ovociti
Micro manipolatore piezoelettrico	Prime tech, Co., Ltd.	PMM-150FU	Per micromanipolazione
HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF	Ishihara sangyo kaisha, Ltd.	CF001	Contiene 0,5 mL di soluzione di sospensione HVJ-E e 10 mL di tampone di fusione cellulare per la fusione cellulare
SrCl2 · 6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	193-09442	Per l'attivazione degli ovociti
EGTA	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	E8145	Per l'attivazione degli ovociti
Dimetilsolfossido	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	045-24511	Per il solvente
Trichostatin A	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	T1952	Per l'incubazione con embrioni SCNT
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	A5960	Per l'incubazione con embrioni SCNT
Olio minerale	Sigma-Aldrich, Co., Lcc.	M8410	Per mezzo di copertura