Qui presentiamo un'analisi di permeabilità vascolare del cervello del mouse usando iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione che è applicabile ai modelli animali di disfunzione della barriera emato - encefalica. Un hemi-cervello è usato per valutare quantitativamente permeabilità e l'altro per la visualizzazione dell'elemento tracciante/immunostaining. La procedura richiede 5-6 h per 10 topi.
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Articolo metodologico
In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Barriera emato - encefalica (BBB) è una barriera specializzata che protegge il microambiente del cervello dalle tossine e agenti patogeni nella circolazione e mantiene l'omeostasi del cervello. I siti principali della barriera sono cellule endoteliali dei capillari del cervello cui funzione barriera risultati da giunzioni intercellulari strette e trasportatori di efflusso espressi sulla membrana plasmatica. Questa funzione è regolata da periciti e astrociti che insieme formano l'unità neurovascolare (NVU). Parecchie malattie neurologiche come l'ictus, morbo di Alzheimer (annuncio), i tumori cerebrali sono associati con un'alterata funzione BBB. Valutazione della permeabilità BBB è quindi cruciale nella valutazione della gravità della malattia neurologica e il successo delle strategie di trattamento impiegato.
Presentiamo qui un semplice eppure analisi permeabilità robusto che sono state applicate con successo a diversi mouse modelli entrambi, genetica e sperimentale. Il metodo è altamente quantitativa e oggettiva rispetto l'analisi di fluorescenza di tracciante da microscopia che è comunemente applicata. In questo metodo, i topi sono iniettati intraperitonealmente con un mix di traccianti fluorescenti inerti acquosi seguita da anestetizzare i topi. Aspersione cardiaca degli animali viene eseguita prima della raccolta del cervello, i reni o altri organi. Gli organi sono omogeneizzati e centrifugati seguiti dalla misura di fluorescenza dal surnatante. Disegnata dalla puntura cardiaca appena prima l'aspersione del sangue serve per scopo di normalizzazione per il compartimento vascolare. La fluorescenza del tessuto è normalizzata per la fluorescenza del siero e peso bagnata per ottenere un quantitativo indice di permeabilità del tracciante. Per ulteriore conferma, controlaterale hemi-cervello conservato per immunohistochemistry può essere utilizzato per scopi di visualizzazione dell'elemento tracciante di fluorescenza.
Introduzione
Emato - encefalica (BBB) è costituito da cellule endoteliali microvascolari (ECs) supportate da periciti strettamente associati (pz), che sono ensheathed nella lamina basale, e astrociti (ACs) che avvolgono la membrana dello scantinato con i piedi di fine1 ,2. ECs interagire con diversi tipi di cellule che supportano e regolano la funzione di barriera, principalmente ACs e PC, e anche i neuroni e microglia, che insieme formano l'unità neurovascolare (NVU). Il NVU è critico per la funzione della barriera emato-encefalica, che limita il trasporto di ematica tossine e agenti patogeni di entrare il cervello. Ques....
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Protocollo
Tutti gli animali erano gestiti con la massima cura, riducendo al minimo dolore o fastidio durante la procedura. Questa procedura segue le linee guida di cura degli animali della nostra istituzione ed è stata approvata dal comitato locale (Regierungspraesidium Darmstadt, numero di omologazione FK/1044).
Uno schema delle fasi di lavoro per dosaggio di permeabilità in vivo in topi è illustrato nella Figura 1. I dettagli di ogni passaggio sono descritti di seguito.
1. animale movimentazione
- Preparazione e somministrazione di traccianti e anestetici ....
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Risultati
Abbiamo recentemente dimostrato che l'angiopoietina-2 (Ang-2) guadagno di funzione (GOF) topi hanno maggiore permeabilità vascolare cerebrale rispetto ai topi di controllo in condizioni sane10. In topi indotti da ictus, è stato anche spettacoli che i topi GOF avevano dimensioni maggiori di infarto e una maggiore permeabilità rispetto i littermates di controllo. Questi risultati indicano un ruolo critico di Ang-2 nella permeabilità alle BBB. Il protocollo pertanto u.......
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Discussione
Disfunzione della barriera emato - encefalica è associata con una serie di disturbi neurologici, compreso i tumori cerebrali primari e secondari o ictus. Ripartizione BBB è spesso associata a edema CNS pericoloso. La delucidazione dei meccanismi molecolari che determinano l'apertura o chiusura della BBB è quindi di importanza terapeutica nelle malattie neurologiche e comunemente studiato dai ricercatori. Tuttavia, metodi per indagare BBB permeabilità in vivo segnalati nella letteratura, sono spesso associati con.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Gli autori desidera ringraziare Sphingonet consorzio finanziato dalla Fondazione Leduq per sostenere questo lavoro. Questo lavoro è stato anche sostenuto del Collaborative Research Center "differenziazione vascolare e rimodellamento" (CRC / Transregio23, progetto C1) e dalla 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc programma GO-IN, no. 291776 finanziamenti. Riconosciamo ulteriormente Kathleen Sommer per la sua assistenza tecnica con i topi, manipolazione e genotipizzazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| destrano tetrametil rodamina (TMR) 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| isotiocianato di fluoresceina (FITC) destrano 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| ketamina (Ketavet) | Zoetis | ||
| xilazina (Rompun) | Bayer | ||
| 0,9% soluzione salina | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T composto | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% soluzione di formaldeide | Sigma | 252549-1L | preparare una soluzione al 4% |
| di albumina sierica bovina, frazione V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| ratto anti CD31 anticorpo, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| capra anti ratto alexa 568 | sonde molecolari | A-11077 | |
| capra anti ratto alexa 488 | sonde molecolari | A-11006 | |
| DAPI | sonde molecolari | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| ago a farfalla calibro 21 | BD | 387455 | |
| siero provetta per prelievi | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| provette eppendorf da 2 ml | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Salviette di precisione Kimtech tergicristalli per tessuti | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| piastra nera a 384 pozzetti | Greiner | 781086 | |
| vetrini superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| pestello in PTFE | Wheaton | 358029 | |
| agitatore elettrico ad asta | VWR | VWR VOS 14 | |
| lettore di piastre | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocale Sistema di microscopio a scansione laser Sistema | |||
| BVK Ismatec | |||
| microcentrifuga | eppendorf | 5415R |
Riferimenti
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M.
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Ristampe e permessi
