In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Emato - encefalica (BBB) è costituito da cellule endoteliali microvascolari (ECs) supportate da periciti strettamente associati (pz), che sono ensheathed nella lamina basale, e astrociti (ACs) che avvolgono la membrana dello scantinato con i piedi di fine^{1 ,2}. ECs interagire con diversi tipi di cellule che supportano e regolano la funzione di barriera, principalmente ACs e PC, e anche i neuroni e microglia, che insieme formano l'unità neurovascolare (NVU). Il NVU è critico per la funzione della barriera emato-encefalica, che limita il trasporto di ematica tossine e agenti patogeni di entrare il cervello. Questa funzione è un risultato di molecole di giunzione stretta come claudin-5, occludina, zonula occludens-1, che sono presenti tra ECs e anche a causa dell'azione dei trasportatori come la p-glicoproteina (P-gp) che efflusso molecole che entrano l'endotelio nuovamente dentro il vaso lumen^1,2,3. Il BBB tuttavia consente il trasporto di molecole essenziali quali sostanze nutritive (glucosio, ferro, aminoacidi) dai trasportatori specifici espressi sul CE membrane plasmatiche^1,2,3. Il livello di CE è altamente polarizzato rispetto alla distribuzione dei vari trasportatori tra il luminal (esposto a sangue) e abluminal (cervello esposto membrane) per consentire il trasporto vettoriale e specifica funzione^4,5 . Mentre la BBB è protettiva per quanto riguarda strettamente che regolano il milieu di CNS, è una sfida importante per la somministrazione di farmaci CNS in malattie come il Parkinson con un funzionale BBB. Anche in malattie neurologiche con disfunzione BBB, non si può presumere che la consegna di droga del cervello è aumentata in particolare come la disfunzione della barriera potrebbe includere i bersagli di trasportatore specifico ad esempio come nel morbo di Alzheimer (annuncio). D.c., parecchi trasportatori di amiloide beta quali LRP1, RAGE, P-gp sono noti per essere dysregulated e quindi targeting questi trasportatori potrebbe essere inutile^6,7,8. La BBB è alterata in diverse malattie neurologiche come meningite da ictus, annuncio, sclerosi multipla e nel cervello tumori^9,10,11. Ripristinare la funzione di barriera è una parte cruciale della strategia terapeutica e così la sua valutazione è fondamentale.

In questo lavoro, abbiamo descritto un'oggettiva e quantitativa protocollo per l'analisi permeabilità nei roditori che abbiamo applicato con successo a numerose linee di mouse entrambi malattia transgenici e sperimentale modelli^{10,12,13 ,14}. Il metodo si basa su una semplice iniezione intraperitoneale di traccianti fluorescenti seguita da aspersione dei topi per rimuovere gli elementi traccianti dal compartimento vascolare. Cervello e altri organi sono raccolti post aspersione e permeabilità valutati da un obiettivo e indice di permeabilità assoluta basata su misure di fluorescenza degli omogeneati del tessuto in un lettore di piastra. Tutti i valori di fluorescenza grezzi vengono corretti per lo sfondo utilizzando omogenati o siero da animali di falsità che non ricevono alcun elemento tracciante. Le normalizzazioni di ampio sono incluse per volume del siero, di fluorescenza del siero e il peso dei tessuti, producendo così l'indice di permeabilità che è assoluto e comparabili tra esperimenti e tipi di tessuto. Per facilità di confronto tra i gruppi, i valori di indice di permeabilità assoluta possono essere trasformati prontamente ai rapporti come abbiamo in precedenza avevamo effettuato¹². Contemporaneamente, stored hemi-cervello ed il rene potrebbe essere utilizzate per la visualizzazione dell'elemento tracciante da microscopia di fluorescenza¹⁰. La microscopia di fluorescenza classico potrebbe essere preziosa nell'ottenere differenze regionali nella permeabilità seppur ingombrante a causa della selezione soggettiva di sezioni di tessuto e immagini per un'analisi semi-quantitativa. I passaggi dettagliati sono presentati nel protocollo e se del caso, vengono aggiunte note. Questo fornisce le informazioni necessarie per eseguire correttamente il dosaggio di permeabilità in vivo in topi che possono essere ridimensionati per altri piccoli animali. Il dosaggio può essere applicato a molti tipi di rivelatori permettendo per la carica e la dimensione ha basato la valutazione di permeabilità da una combinazione di traccianti con spettri di fluorescenza distinti.

Tutti gli animali erano gestiti con la massima cura, riducendo al minimo dolore o fastidio durante la procedura. Questa procedura segue le linee guida di cura degli animali della nostra istituzione ed è stata approvata dal comitato locale (Regierungspraesidium Darmstadt, numero di omologazione FK/1044).

Uno schema delle fasi di lavoro per dosaggio di permeabilità in vivo in topi è illustrato nella Figura 1. I dettagli di ogni passaggio sono descritti di seguito.

1. animale movimentazione

1. Preparazione e somministrazione di traccianti e anestetici
   1. Preparare provette e stampi per tessuto che almeno un giorno prima del dosaggio di permeabilità. Mantenere condizioni di sterilità in tutto il protocollo lavora sotto cappa pulita e utilizzando strumenti puliti con 80% di etanolo. Utilizzare il maschio o femmina wild-type (WT) o topi (GOF) CD1 di angiopoietina-2 (Ang-2) guadagno di funzione nel gruppo d'età adulto maturo di 3-6 mesi per il protocollo corrente. Eseguire la genotipizzazione dei topi come descritto in precedenza ¹⁰.
      Nota: 80% di alcol non si tradurrà in strumenti sterili ma riduce al minimo la contaminazione dei campioni preparati.
   2. Diluire tutti i traccianti in PBS sterile in scorte di 2 mM e conservare le aliquote al riparo dalla luce a-20 ° C.
   3. Scegliere elementi traccianti come (tetrametil rodamina) TMR e (isotiocianato di fluoresceina) FITC con spettri di eccitazione/emissione distinti e che sono lisina risolvibile con conseguente interferenza minima tra i coloranti da microscopia di fluorescenza (utilizzando il TMR o FITC filtrare rispettivamente) e dalla fluorometria in un lettore di piastre per il dosaggio di permeabilità.
      Nota: Destrano TMR 3 kD e destrano FITC 3 kD utilizzati nello studio sono entrambi lisina risolvibile e quindi potrebbe essere anche usato per la post-fissazione analisi di immunohistochemical con aldeidi al fine di indagare le differenze regionali.
   4. Gestire tutti gli animali con la massima cura seguendo le linee guida di assistenza istituzionale. Iniettare per via intraperitoneale ogni mouse con 100 µ l di soluzione di tracciante che può essere aumentata fino a 200 µ l quando un ulteriore elemento tracciante è combinato con 100 µ l di ciascun elemento tracciante in un mix 1:1^10,13. Iniettare almeno un animale con PBS da solo invece i traccianti per fungere da controllo sham per la sottrazione del background di autofluorescenza.
   5. 5 min dopo l'iniezione dell'elemento tracciante, anestetizzare l'animale con un'iniezione dei. p di ketamina e xilazina (100 mg e 5-10 mg in 0,9% soluzione fisiologica per kg di peso rispettivamente, 150 µ l del cocktail per topo 25 g).
      Nota: Unguento Vet non è stato applicato sugli occhi durante la procedura di come il periodo tra anestesia animale e aspersione/sacrificio è stato breve (10 minuti) dove qualsiasi secchezza degli occhi non era osservata.
2. Aspersione di sangue raccolta e cardiaco
   1. Preparare gli animali per la perfusione cardiaca 10 min dopo la somministrazione di anestetico. Verificare l'assenza di risposta di contrazione di zampa al fine di garantire che l'animale ha raggiunto un aereo chirurgico di anestesia.
   2. Posare gli animali sulla schiena e applicare 80% etanolo sulla pelle della zona addominale. Utilizzando le forbici piccole, aprire la parete addominale con una piccola incisione (2 cm) appena sotto la gabbia toracica. Separare il fegato dal diaframma e poi lentamente tagliare attraverso il diaframma esponendo la cavità pleurica ¹⁵.
   3. Tagliare la gabbia toracica bilateralmente e fissare lo sterno taglio al fine di esporre il ventricolo sinistro. Inserire un ago a farfalla 21-manometro collegato ad un sistema di perfusione peristaltica nel posteriore del ventricolo sinistro.
   4. L'atrio di destra di puntura e rapidamente (entro 10 s) raccogliere 200-300 µ l di sangue che viene rilasciato nella cavità di cassa utilizzando puntali per pipette da 1 mL (con taglio fine) in tubi di raccolta del siero e memorizzarlo sul ghiaccio.
      Nota: Questa procedura di perfusione è non-sopravvivenza.
   5. Non appena il sangue viene raccolto, accendere il sistema di perfusione (10-12 giri/min, 5 mL/min) e irrorare l'animale per 3 min con caldo (RT) 1x PBS (libero di Ca^{2 +}ioni Mg^{2 +} ).
      Nota: PBS contenente Ca^{2 +}/Mg^{2 +} ioni possono essere utilizzati per meglio attività cardiaca durante la perfusione. La quantità totale di PBS utilizzato per aspersione è nella gamma di 15-20 mL.
   6. Valutare la qualità di perfusione osservando il colore del fegato, i reni, che appaiono bianco/pale dopo aspersione.
      Nota: Aspersione del fegato o del rene non indicano necessariamente aspersione del cervello come le arterie (carotide/vertebrali) raggiungendo il cervello dall'aorta potrebbe avere rotto durante la preparazione nel passaggio 3 in particolare durante la puntura atriale.

2. tessuto lavorazione

1. Organo di raccolta e conservazione
   1. Alla fine della perfusione, confermare la morte dell'animale di dislocazione cervicale e raccolto cervello e reni. Verificare di aspersione del cervello dal colore dei cervelli (nessun sangue visibile nei vasi delle meningi), in modo da escludere gli animali dall'analisi permeabilità quando aspersione qualità non è buona. Separare il cervello in 2 hemibrains usando un bisturi (Figura 1).
   2. Sezionare con un bisturi un hemibrain gratuito del lobi olfattivi e del cervelletto e trasferire la hemicerebrum in una provetta 2 mL. Conservare hemi-cervelletto in un tubo aggiuntivo se necessari per la valutazione della permeabilità cerebellare.
   3. Trasferire un singolo rene in un'altra provetta 2 mL. Conservare i campioni immediatamente il ghiaccio secco.
   4. Incorporare in temperatura di taglio ottimale del tessuto-tek (O.C.T) mescola il ghiaccio secco in modo nativo il restante rene e hemi-cervello (che comprende il cervelletto e lobi olfattivi).
   5. Alla fine, centrifugare i campioni di sangue conservati il ghiaccio nelle provette di raccolta del siero a 10, 000G, 10 min a 4 ° C. Trasferire i surnatanti di siero per provette da 1,5 mL e metterli nel contenitore di ghiaccio secco.
   6. Trasferire tutti i campioni raccolti su ghiaccio secco per congelatore a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione.
      Nota: È importante a congelare i campioni prima di procedere con i passaggi di omogeneizzazione come aumenti di efficienza di omogeneizzazione dopo come congelare lo scongelamento.
2. Omogeneizzazione e centrifugazione
   1. Scongelare il ghiaccio l'hemi-cervello e reni campioni congelati giù a-80 ° C e pesare le provette contenenti gli organi. Da questi pesi, sottrarre il valore medio di diversi tubi vuoti (circa 20) per ottenere il peso del tessuto. Aggiungere 300 µ l e 200 µ l di freddo 1 X PBS per le provette contenenti il rene e hemi-cervello, rispettivamente.
      Nota: per gli importi più bassi del tessuto (come hemi-cervelletto, inferiore a 100 mg) pesatura dei singoli tubi è raccomandato.
   2. Omogeneizzare ogni campione nella provetta eppendorf originale con un pestello di politetrafluoroetilene (PTFE) collegato a un agitatore elettrico (1, 000rpm) eseguendo circa 15 colpi (1 colpo = 1 a e 1 giù). Il pestello con PBS tra campioni di risciacquare ed asciugare prima di procedere con l'esempio successivo.
      Nota: L'uso di detergenti durante l'omogeneizzazione è stata evitata a causa di possibili interferenze con fluorometria. Tuttavia, tracciante intracellulare viene anche rilevato in questo protocollo come il tessuto è accuratamente omogeneizzato, che è più efficiente dopo un round di congelamento scongelamento.
   3. Conservare i campioni omogeneizzati su ghiaccio protette dalla luce e centrifuga tutti insieme alla fine alle 15.000 g, 20 min, 4 ° C in una centrifuga da tavolo. Trasferire i surnatanti in un nuove provette da 1,5 mL sul ghiaccio per fluorimetria immediato o a-80 ° C per essere analizzati successivamente.
3. Quantificazione e misurazione di fluorescenza
   1. Se congelati alla fine del passaggio precedente, scongelare su ghiaccio i campioni di tessuto surnatante e siero conservati a-80 ° c li protegge dalla luce con la pellicola.
   2. Pipettare 50 µ l di siero diluito (30 µ l 1X PBS + 20 µ l di siero) o surnatanti di tessuto (come è) in una piastra 384 pozzetti nera. Includere almeno un campione da animale di falsità da surnatanti del siero e del tessuto garantire sottrazione sfondo corretto, come questo sfondo di omogenato di tessuto è normalmente superiore a quella di PBS usato come diluente.
      Nota: Una media di 3 animali sham utilizzabile per autofluorescenza anche se è stata osservata una variabilità molto poco nei valori di autofluorescenza sham (dati non mostrati). La quantità di siero utilizzato può essere ridotto diluendo con PBS, che può anche aumentare il rapporto segnale-rumore per campioni con bassa fluorescenza come i campioni di cervello. Fino a 10 µ l di siero è stato testato diluendola con 40 µ l PBS. Assicurarsi che nessun bolle sono presente nei pozzetti.
   3. Inserire la piastra 384 pozzetti nera nel lettore della piastra e aprire un nuovo script selezionando la misura della fluorescenza.
   4. Impostare il guadagno ottimale e utilizzare rispettivamente i valori di eccitazione/emissione (nm) di 550/580 o 490/520 per dyee TMR o FITC e avviare la misurazione per ottenere le unità di fluorescenza crudo (RFU).
   5. Utilizzare le unità di fluorescenza crudo (RFU) dal lettore di piastra per calcolare l'indice di permeabilità (PI) dopo avere sottratto i corrispondenti valori di sham.
      1. * Indice di permeabilità (mL/g) = (Peso del tessuto tessuto RFU/g) / (siero RFU/mL di siero)
   6. Esempio di calcolo per l'indice di permeabilità del cervello (PI) dell'animale GOF1 (tabella 1):
      1. GOF1 cervello RFU - SHAM cervello RFU = 154-22,5 = 131,5
      2. GOF1 siero RFU - siero SHAM RFU = 38305-27 = 38278
      3. Peso (g) del cervello = 0,195
      4. Volume del siero (ml) = 0,02
      5. Indice di permeabilità (10^-3 mL/g) del cervello = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
         Nota: Il calcolo di indici di permeabilità yield valori assoluti e comparabili tra esperimenti e tipi di tessuto. Questi, tuttavia, può essere presentati come rapporti per facilità di confronto tra i 2 gruppi di ¹². Ciò può essere ottenuto dividendo il PI di ogni animale in entrambi i gruppi con il PI medio del gruppo di controllo, la media del gruppo di controllo attraverso 1 pur mantenendo la variazione animale inter nel gruppo di controllo di guida. Questa trasformazione fornisce i valori per il gruppo sperimentale (o gruppi) rispetto al gruppo di controllo impostato su 1.
4. Visualizzazione di immunofluorescenza del tracciante
   1. Tagliare i blocchi di rene/hemi-cervello incorporati in modo nativo in tessuto-tek composto (O.C.T) (punto 2.1) in µm 10 sezioni su un criostato impostato a-20 ° C e trasferire le sezioni a diapositive disposto a temperatura ambiente. Una volta che le sezioni vengono essiccate (circa 30 min), trasferimento diapositive per congelatore a-80 ° C fino all'utilizzo.
   2. Il giorno di macchiatura, scongelare le diapositive a 37 ° C per 10 min e poi fissare le sezioni con paraformaladehyde 4% (PFA) per 10 min a temperatura ambiente, seguita da rapido lavaggio in PBS.
   3. Incubare le sezioni nel tampone di permeabilizzazione/blocco di PBS sterile contenente BSA 1% e 0,5% Triton X-100 pH 7.5 per 1 h a temperatura ambiente.
   4. Incubare i vetrini per 1,5 h a temperatura ambiente con l'anticorpo primario CD31 (0,5 mg/ml, clonare MEC 13,3), diluito in 1: 100 in tampone PBS sterile, BSA 0,5%, 0,25% Triton X-100 (pH 7,2) seguita da tre min 5 lavaggi in PBS.
   5. Eseguire incubazione anticorpo secondario nel buffer di cui sopra per 1 h a temperatura ambiente con specie-specifica con l'etichetta fluorescente anticorpi diluiti 1: 500 (2 mg/mL). Per CD31, capra anti-topo Alexa 568 o Alexa 488 può essere utilizzato ad una diluizione di 1: 500. Sono DAPI (300 µM) nell'anticorpo secondario mescolare (1:1, 000 diluizione dallo stock) per macchiare per i nuclei.
   6. Montare le sezioni macchiate con aqua polymount e lasciarlo tutta la notte per polimerizzazione a temperatura ambiente buio.
   7. Acquisire immagini utilizzando un laser confocale imaging spettrale microscopio sistema di scansione. Analizza le immagini per software di NIS elements (versione 4.3). Software come Photoshop può essere utilizzato per la generazione di figure di montaggio.

Abbiamo recentemente dimostrato che l'angiopoietina-2 (Ang-2) guadagno di funzione (GOF) topi hanno maggiore permeabilità vascolare cerebrale rispetto ai topi di controllo in condizioni sane10. In topi indotti da ictus, è stato anche spettacoli che i topi GOF avevano dimensioni maggiori di infarto e una maggiore permeabilità rispetto i littermates di controllo. Questi risultati indicano un ruolo critico di Ang-2 nella permeabilità alle BBB. Il protocollo pertanto utilizzati i topi GOF e rispetto loro per controllare littermates per descrivere il test di permeabilità in vivo . Tuttavia, questo metodo può essere applicato a qualsiasi modello di topo transgenico, modello malattia o trattamenti che alterano la permeabilità BBB come abbiamo fatto in precedenza 10,11,12,13della droga.

Si suggerisce un intervallo breve circolazione (15 min) per l'analisi di permeabilità, come più lunghi tempi di circolazione porterà ad una maggiore distanza dal compartimento vascolare, che è stato osservato anche in precedenti studi16. La clearance di 3 kD FITC-Destrano a 2 h (Figura 2 C, D) è molto maggiore rispetto a 15 min (Figura 2 A, B) nel rene così come nel tessuto cerebrale. Nel cervello, non c'è molto poco tracciante extravascular dovuto intatta barriera emato - encefalica in questi topi WT adulti (Figura B, D). Applicando questo metodo, è stata confrontata la permeabilità di tracciante in GOF Ang-2 con littermates WT. I risultati presentati in un formato di tabella (tabella 1) indicano maggiore accumulo del tracciante nei cervelli di topi GOF rispetto ai topi WT. Tuttavia, la fluorescenza del rene non è alterata tra questi gruppi. Immagini di immunofluorescenza confermano l'aumento extravascular tracciante in topi GOF (Figura 3 B, D) rispetto ai topi WT (Figura 3 A, C) dove il tracciante è limitato al compartimento vascolare.

Figura 1. Schema del flusso di lavoro per l'analisi in vivo permeabilità utilizzando traccianti fluorescenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Spazio dell'elemento tracciante a breve e lunghi tempi di circolazione. Al fine di stabilire il tempo di circolazione del tracciante per il dosaggio di permeabilità, un tempo breve circolazione di 15 min (A, B) è stato confrontato con un tempo di lunga durata di circolazione di 2 h (C, D) post iniezione di tracciante. Il tempo di circolazione più lungo di 2 h portato a quantità molto basse di accumulazione dell'elemento tracciante nel rene (C) dove la permeabilità basale è elevata rispetto a un tempo circolazione a breve 15 min (A) potenzialmente a causa di una clearance molto elevata di FITC Destrano-3 kD (verde canale) dal compartimento vascolare. Questo effetto è stato ancora più drammatico nel cervello caratterizzato dalla stretta barriera emato - encefalica (B, D). CD31 macchiatura (canale rosso) ha confermato la presenza di vasi nella regione di interesse. Immagini rappresentative da un singolo animale fuori 2 topi CD1 adulti wild-type iniettato con il tracciante per ogni punto nel tempo e gli animali sono stati sacrificati senza che irrora li per visualizzare il tracciante intravascolare. La barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. L'immunofluorescenza che macchia per traccianti valutare i cambiamenti di permeabilità del cervello nei topi GOF. Aumentata permeabilità della 3 kD tracciante TMR-destrano (in rosso) possa essere visualizzati in topi GOF Ang-2 (B, D) rispetto ai littermates WT (A, C) della regione di corteccia. In animali WT il tracciante è limitato ai vasi (A, C) considerando che extravascular tracciante può essere osservato nei topi GOF (frecce bianche in B, D). Macchiando per CD31 (in blu) nelle immagini unite (A-D) conferma la presenza di vasi. Figura Mostra immagini rappresentative da 2 WT e 2 GOF topi iniettati con traccianti i. p e sacrificato 15 min dopo l'iniezione con aspersione. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Calcoli di permeabilità del tessuto. Indice di permeabilità calcoli per topi littermates wild type (WT) e Ang-2 guadagno di funzione (GOF) mostrano chiaramente maggiore (circa 2 volte) del cervello permeabilità nei topi GOF rispetto ai topi WT. La permeabilità del rene è tuttavia nello stesso intervallo fra i 2 gruppi. La permeabilità renale basale è molto maggiore rispetto al cervello come previsto a causa di endotelio fenestrato nel rene che non formano una barriera.

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.