Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Sommario

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Abstract

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che produce ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Le isole sono costituite principalmente da cinque tipi di cellule che secernono l'ormone: le cellule secernono glucagone, le cellule secernono insulina, cellule che sortostatine, le cellule secernono la grelina e le cellule PP secernono la polipeptide pancreatica. Il sessanta-80% delle cellule nelle isole sono cellule z, che sono la popolazione cellulare più importante per studiare la secrezione di insulina. Le isole pancreatiche sono un sistema modello cruciale per studiare la secrezione di insulina ex vivo. Acquisire isocchi di alta qualità è di grande importanza per la ricerca sul diabete. La maggior parte delle procedure di isolamento dell'isolotto richiedono tecnicamente difficile accedere al sito di iniezione di collagenase, procedure di digestione dure e complesse e più fasi di purificazione del gradiente di densità. Questo documento presenta un semplice metodo di isolamento dell'isolotto del mouse ad alto rendimento con descrizioni dettagliate e dimostrazioni realistiche, che mostra i seguenti passaggi specifici: 1) iniezione di collagene P all'ampulla di Vater, una piccola area che unisce il condotto pancreatico e il dotto biliare comune, 2) la digestione enzimatica e la separazione meccanica del pancreas esocrino, e 3) un singolo passo di purificazione del gradiente. I vantaggi di questo metodo sono l'iniezione di enzima digestivo utilizzando l'ampulla più accessibile di Vater, una digestione più completa utilizzando la combinazione di approcci enzimatici e meccanici e una fase di purificazione a singolo gradiente più semplice. Questo protocollo produce circa 250-350 isolotti per mouse; e isolotti sono adatti per vari studi ex vivo. Possibili avvertenze di questa procedura sono potenzialmente danneggiate isole a causa di digestione enzimatica e/o incubazione del gradiente prolungata, che possono essere evitati in gran parte con un'attenta giustificazione pubblicitaria del tempo di incubazione.

Introduzione

Ci sono due metodi comuni nella letteratura per l'isolamento delle isolotzioni pancreatiche. Uno richiede di eccitare il pancreas e dividerlo in piccoli pezzi usando forbici chirurgiche, e poi digerirlo in una soluzione collagenae^1,2,3. Un altro metodo più preciso è quello di utilizzare la rete di dotti presenti nel pancreas per introdurre l'enzima digestivo. I seguenti siti sono stati utilizzati per l'iniezione di enzimi digestivi: la giunzione della bile e del dotto cistico, la cistifellea nel dotto biliare comune, o il dotto biliare comune stesso^1,4,5. È noto che le isole non sono distribuite uniformemente nel pancreas; la regione splenica contiene la maggior parte degli isolotti⁶. Mentre il secondo metodo che utilizza percorsi anatomici per fornire enzimi digestivi consente una perfusione più completa del pancreas, compresa la regione splenica, questa procedura spesso richiede la bloccallatura o la sutura dell'ampulla del Vater tecnicamente impegnativo. In termini di purificazione dell'isolotto, sono stati utilizzati ceppi di densità multipla, così come ceppi cellulari e retrazione magnetica per purificare le isole^3,7. L'utilizzo di questi gradienti può richiedere molto tempo e le pendenze Ficoll possono causare danni tossici alle isole⁸.

Il protocollo attuale si basa sul metodo descritto da Li et al.⁷, con ulteriori modifiche aggiunte in base all'esperienza di noi stessi e degli altri^1,4. I passaggi più critici del nostro protocollo sono il bloccaggio del dotto biliare comune vicino alla fine del fegato, l'iniezione di collagenasi P attraverso l'ampulla di Vater per digerire il tessuto esocrino, e quindi utilizzando un bagno d'acqua accomodante per accelerare la digestione meccanicamente^{1, 4,7}. Successivamente, viene applicata una soluzione "STOP" per inibire un'ulteriore digestione delle isole; HBSS viene utilizzato per lavare via la restante soluzione collagenasi P e STOP. Quando il metodo Ficoll è stato utilizzato per purificare le isole umane, la resa è stata segnalata per essere due volte le isole con maggiore capacità funzionale (ad esempio, secrezione di insulina) rispetto all'uso di gradienti di Percoll⁹. Tuttavia, gli studi hanno messo in discussione l'uso del gradiente di Ficoll a causa del suo effetto tossico sulle isole^1,10. È stato riferito che il gradiente Histopaque fornisce una cinetica di purificazione ottimale per l'isolamento dell'isolotto del mouse, che produce una buona resa di isolotti di alta qualità con passaggi più semplici e costi inferiori¹. Nel nostro protocollo, Histopaque-1077 viene utilizzato per purificare le isole da altri tessuti residui^8,11. Le isole raccolte possono essere coltivate in supporti RPMI-1640 completi, o utilizzati direttamente nella quantificazione RNA/proteina.

Il nostro protocollo, utilizzando una combinazione di digestione di collageneP e una singola fase di purificazione del gradiente, è più semplice rispetto ad altri protocolli pubblicati. Il nostro metodo non richiede procedure chirurgiche impegnative e ha pochi semplici passi. Ancora più importante, questo protocollo produce costantemente una buona resa di isolotti funzionali di alta qualità (250-350/mouse) come abbiamo riportato¹².

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee (ACUC) della Texas A&M University. Gli strumenti chirurgici necessari sono illustrati nella Figura 1 e il diagramma schematico della procedura è illustrato nella Figura 2.

1. Soluzioni

1. Preparare Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) aggiungendo 100 mL di 10X HBSS (dal magazzino) a 900 mL di acqua distillata per fare 1 L HBSS (1X).
2. Preparare la soluzione STOP (deve essere fatta fresca e deve essere utilizzata entro 1 h) aggiungendo 50 mL di 100X siero bovino fetale (FBS) a 450 mL di ghiaccio freddo 1X HBSS; questo rende la soluzione 500 mL STOP. Mantenere la soluzione STOP a 4 gradi centigradi.
3. Preparare la soluzione collagenase P (deve essere fatta fresca entro 1 h dall'uso) aggiungendo 1 mg/mL di collagenae P al freddo ghiaccio 1X HBSS; utilizzare 6 mL/mouse.
   1. Aggiungere lo 0,05% (w/v) l'albumina del siero bovino (BSA) alla soluzione collagenase P (questo fornisce nutrienti alle isole isolate). Ad esempio, utilizzare 3 mg BSA in 6 mL collagenase P soluzione. Tenere il ghiaccio.
   2. Calcolare e preparare la quantità di collagenae P necessaria per tutti i topi in un tubo da 50 mL.
4. Preparare il mezzo RPMI 1640 completo aggiungendo il 10% di FBS, 100 U/mL penicillina, 100 g/mL streptomicina, integratore cellulare INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM di pydium pyruvate e 0,05 mM 2-mercaptoetanol) a 500 mL di per la cultura e l'incubazione durante la notte.

2. Preparazione

1. Riempire tre tubi da 50 mL da 25 mL soluzione inibitoria rem, 70% etanolo o distillato H₂O. Queste soluzioni saranno utilizzate per la pulizia di utensili chirurgici prima e durante la procedura.
2. Immergere le punte degli strumenti in RNase inibitore soluzione per 30 min prima di iniziare il protocollo; questo elimina qualsiasi potenziale RNase sugli strumenti.
3. Pre-taglio cuscinetti assorbenti a 6 in x 6 dimensioni per l'uso durante l'intervento chirurgico.
4. Preparare in anticipo 1X della soluzione HBSS e conservare a 4 gradi centigradi. Preparare la soluzione STOP prima dell'intervento. Conservare a 4 gradi centigradi.
5. Preparare la soluzione collagenase P immediatamente prima dell'intervento chirurgico e conservare sul ghiaccio.
   NOTA: Questo deve essere utilizzato entro 2 h dalla preparazione.
6. Etichettare tubi da 50 mL per la digestione e la purificazione; preparare 2 tubi per ogni topo, uno per la digestione e l'altro per la purificazione dell'isolotto. Assicurarsi che l'ID animale sia su entrambi i tubi.
7. Aggiungere 3 mL di soluzione collagene P nel primo tubo da 50 mL. I restanti 3 mL di collagene P saranno iniettati.
8. Disegnare i restanti 3 mL di soluzione di collagenasi in una siringa da 3 mL montata con 30 G 1/2 nell'ago. Mettere la siringa sul ghiaccio.

3. Procedura

1. Rimuovere tutti gli strumenti dalla soluzione inibitore di RNase, quindi immergerli prima nel tubo con il 70% di etanolo, poi nel tubo contenente distillato H₂O, quindi asciugare all'aria su un asciugamano di carta pulita.
2. Posizionare il mouse in una camera contenente 0,5 mL di isoflurane fino a quando il topo non è profondamente anatetizzato.
3. Togliere il mouse dalla camera e controllare lo stato di anestesia pizzicando un piede con pinze. L'anestesizzazione profonda si basa sull'osservazione che la respirazione diventa costantemente lenta e il mouse non è reattivo al pizzicamento del piede. Dopo aver confermato che il mouse è profondamente anestesizzato, eutanasia il mouse con dislocazione cervicale, e quindi posizionare il mouse sul pad assorbente.
   1. Posizionare il topo anasetizzato sullo stomaco, applicando pressione al collo e dislocando la colonna vertebrale dal cervello tirando la coda.
4. Nastro gli arti del topo in posizione supina al pad assorbente, spruzzare il corpo con 70% di etanolo, e pulire l'eccesso di etanolo in eccesso.
5. Utilizzare pinze di vetro di copertura e forbici chirurgiche curve per fare incisioni. In primo luogo fare un'incisione orizzontale sulla pelle della zona addominale (3 cm), tirare la pelle spalancata per esporre la parete addominale. Quindi fare un'incisione verticale (3-4 cm) sul peritoneo addominale per esporre completamente il pancreas nella cavità addominale (Figura 3).
6. Spingere i lobi del fegato in modo superiore per esporre il dotto biliare, apparirà come un tubo rosa pallido (Figura 3).
7. Spostare con attenzione l'intestino dalla regione lombare/iliaca destra della cavità addominale a destra, esponendo il dotto biliare e l'arteria epatica (Figura 3).
8. Bloccare con attenzione il dotto biliare comune utilizzando le micro serrefini Schwartz (Figura 1) il più vicino possibile al fegato.
9. Identificare l'ampulla di Vater, che si trova nella papilla duodenale, formata dall'unione del dotto pancreatico e del dotto biliare comune. L'ampulla di Vater appare gonfio quando viene visualizzato al microscopio di dissezione, che è il punto di ingresso al dotto biliare comune (Figura 4).
   NOTA: Regolare l'intensità/angolo di luce del microscopio di dissezione può facilitare l'individuazione.
10. Inserire la siringa con 3 mL della soluzione collagene P nell'ampulla di Vater. Spingere l'ago nel condotto per circa 1/4 della lunghezza del dotto biliare comune (ampulla conduce nel condotto) come mostrato nella Figura 5.
11. Una volta che l'ago è nell'ampulla, assicurarsi che l'orientamento dell'ago sia tale che sia parallelo al condotto.
12. Stabilizzare l'ago bloccando con micro pinze Adson per evitare che fori il condotto (Figura 5).
13. Lentamente e costantemente iniettare 3 mL della soluzione collagenae P dalla siringa nel dotto biliare comune (abbastanza per sentire resistenza) come mostrato Figura 6. L'obiettivo è quello di creare pressione di ridisposizione per costringere il collagenae a entrare nel condotto pancreatico. L'iniezione è considerata riuscita se la regione della testa, del collo, del corpo e della coda del pancreas sono tutte completamente gonfiate.
    NOTA: La resa dell'isola sarà bassa se il pancreas non è completamente gonfiato o se l'area della milza non è completamente gonfiata. L'area di splenica contiene il maggior numero di isolotti⁶. L'inflazione può essere confermata dalla comparsa di spazi aperti tra il tessuto pancreatico che sono pieni di soluzione.
14. Sezionare con attenzione il pancreas gonfiato e metterlo in un tubo di digestione di 50 mL contenente 3 mL di soluzione di collagenae P ghiacciata.
    1. Rimuovere il pancreas con 2 pinze (curvo e Micro Adson; Vedere la Figura 1): (a partire dalla milza, allontanare il pancreas dalla milza e continuare a rimuovere dallo stomaco e lungo il duodenum.
       NOTA: non sono necessarie incisioni.
    2. Tritare il pancreas per 3-5 s nel tubo di digestione con 3 mL di soluzione collagenae P ghiacciata utilizzando forbici chirurgiche fini (Figura 7A).
15. Fissare il tubo su un rack in bagnomaria a 37 gradi centigradi e agitare a 100–120 giri/mper per circa 12-13 min.
16. Dopo l'incubazione, scuotere delicatamente i tubi a mano per interrompere il tessuto fino a quando la soluzione di digestione del collagenasi P diventa omogenea (Figura 7B). L'omogeneità è confermata da un aspetto simile alla sabbia di particelle fini di pancreas. Di solito sono sufficienti circa 30 s di dolce scossa alle mani. Tenere il tubo fino alla luce per esaminare se il tessuto è ben omogeneizzato; agitare per altri 15 s se necessario.
17. Una volta digerito, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio e aggiungere 40 mL di soluzione STOP ghiacciata per terminare la digestione enzimatica.
    NOTA: A questo punto i tubi di digestione possono essere lasciati sul ghiaccio fino a 2 h, se si lavora su più topi.
18. Centrifugare il tubo in una centrifuga oscillante-secchio a 300 x g per 30 s (temperatura di centrifuga è flessibile).
    NOTA: Utilizzare una centrifuga oscillante in modo che il pellet di tessuto si formi nella parte inferiore del tubo da 50 mL e non sulla parete del tubo; questo è fondamentale per una migliore resa delle isolotto.
19. Decant e ripetere la centrifugazione con soluzione STOP altre 2 volte, decantando la soluzione dopo ogni giro. Utilizzare 20 mL di soluzione STOP per ogni lavaggio successivo.
    1. Prima di ogni rotazione, interrompere il pellet scuotendo delicatamente il pellet di tessuto nel tubo da 50 mL in una soluzione DI 20 mL STOP.
20. Sospendere nuovamente il pellet di tessuto con 40 mL di ghiaccio freddo HBSS e centrifugare a 300 x g per 30 s.
21. Decant e ripetere la centrifuga zione utilizzando una centrifuga oscillante-secchio con soluzione HBSS altre due volte, decantando la soluzione dopo ogni giro. Utilizzare 20 mL di HBSS per ogni lavaggio.
    1. Prima di ogni rotazione, interrompere il pellet, per staccarlo dal fondo del tubo agitando delicatamente il tubo contenente soluzione HBSS 20 mL.
22. Dopo l'ultima centrifugazione rimuovere tutti hbSS.
23. Aggiungere quindi 5 mL di gradiente di densità di temperatura ambiente al tubo da 50 mL contenente il pellet. Vortice brevemente a bassa velocità fino a omogeneizzato.
24. Aggiungere altri 5 mL del gradiente di densità di temperatura ambiente al tubo da 50 mL. Non vortice/mix.
    NOTA: È fondamentale rimanere fermi e fermi in modo da consentire una migliore forma del gradiente senza interruzioni.
25. Pipetta 10 mL di temperatura ambiente HBSS tampone nel tubo (contenente il gradiente di densità), gocciolamento per goccia delicatamente e lentamente per consentire la formazione di un gradiente. Utilizzare una pistola pipetta con una pipetta da 10 mL per aggiungere il dropwise HBSS.
26. Utilizzando una centrifuga a oscillazione, i tubi di spin a 1700 x g per 15 min. Assicurarsi di modificare la velocità di entrambe le accelerazioni / decelerazioni per l'impostazione più bassa (Figura 7C).
27. Dopo la rotazione, rimuovere con attenzione i tubi senza disturbare il gradiente. Utilizzando un cannone pipetta pre-bagnato con HBSS freddo (pipette HBSS su e giù), pipetta fuori lo strato di isolotti (5-10 mL) formato tra il gradiente di densità e HBSS nel nuovo tubo di raccolta di isole 50 mL.
    NOTA: È utile bagnare la pipetta con HBSS freddo prima di pipettare le isole per evitare che le isole si attacchino alle pareti interne della pipetta.
    1. Nel caso in cui la separazione sia incompleta, le isole sarebbero visibili nel livello del gradiente di densità, pipette fuori l'intero 10 mL del gradiente di densità (strato inferiore) insieme allo strato di isolotto formato sull'interfaccia (solo per lasciare circa 8-10 mL dello strato superiore HBSS dietro).
       NOTA: la raccolta sia dello strato di isolotto che dello strato di gradiente di densità (strato inferiore) può comportare la raccolta di detriti che possono allungare il tempo di raccolta dell'isolotto, ma non verranno modificati altri passaggi. La raccolta di entrambi questi strati non è necessaria quando lo strato di isolotto è ben formato.
28. Aggiungere 20 mL di HBSS ghiacciato al nuovo tubo da 50 mL contenente le isole, quindi centrifugare a 350 x g per 3 min in una centrifuga oscillante-secchio.
29. Dopo lo spin, pipetta con attenzione (non decantare) fuori il supernatante (lasciare 3 mL in basso) senza disturbare il pellet contenente le isole nella parte inferiore. Scartare il super-attardato.
30. Ripetere il lavaggio e la centrifuga almeno 3 volte. Aggiungere ogni volta 20 mL di HBSS e assicurarsi di sospendere il pellet prima di ogni rotazione.
31. Riscaldare la bottiglia multimediale completa RPMI-1640 in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi prima dell'uso. Dopo l'ultima centrifugazione, rimuovere tutti gli HBSS e aggiungere 4 mL di supporti RPMI-1640 completi precedentemente preparati (contenenti FBS, integratore cellulare INS-1 e penicillina/streptomicina) al pellet.
32. Slogare il pellet ruotando delicatamente il tubo e versare immediatamente il supporto RPMI-1640 in una parabola Petri da 100 mm. Aggiungere altri 5 mL di supporto RPMI-1640 al tubo e ruotarlo delicatamente per lavare le isole rimanenti, quindi versare anche il supporto nella stessa parabola Petri.
    1. Al microscopio di dissezione, raccogliere le isole sane della piastra Petri utilizzando una pipetta da 20 luna e metterle in una nuova parabola Petri contenente 10 mL di supporti RPMI 1640 completi. Se osservati al microscopio di dissezione, le isole dovrebbero apparire di colore sferico/oblungo e marrone dorato con una superficie liscia rispetto al tessuto esocrino relativamente trasparente e squallido.
       NOTA: L'ingrandimento del microscopio di dissezione è solitamente impostato a 12,5–16x. La resa dell'istole varia a seconda di vari fattori, tra cui la tensione, l'età e il sesso del topo. Questo protocollo produce in genere 250-350 isole sane da C57BL/6J mouse sano di età compresa tra 4 e 10 mesi.
33. Incubare le isole in un'incubatrice sterile a 37 gradi centigradi con 5% di infusione di CO₂ e 95% di aria umidificata durante la notte per gli esperimenti il giorno successivo, o congelare le isole per l'analisi desiderata in un secondo momento.
    1. Una volta che le isole sono congelate, non possono essere utilizzate per saggi di secrezione, solo la quantificazione dell'RNA o delle proteine. Per raccogliere le celle da congelare, metterle nel buffer HBSS, raccogliere tutte le isolotti in 200-500 l di buffer, trasferire a 1,5 mL tubo, centrifuga350 x g per 1–2 min, rimuovere il supernatante lasciando non più di 30-40 soluzione L, mettere in -20 c per l'immagazzinamento breve breve ( diversi giorni) o -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.

Risultati

Il corretto completamento di questa procedura richiede una certa comprensione dell'anatomia del topo nella cavità addominale. Ciò consente una corretta identificazione dell'ampulla di Vater e il bloccaggio del dotto biliare comune. L'intera procedura normalmente richiede 1–2 h. È più efficiente isolare le isole da 4-6 topi contemporaneamente, quindi diversi campioni possono essere centrifugati insieme. Il tempo per la raccolta delle isole varia a seconda del numero di isolotti e dell'efficienza della digestione; potrebbe...

Discussione

Questo protocollo include la perfusione di collagenae e la digestione, seguita dalla purificazione delle isole. I passaggi più critici di questo protocollo sono l'iniezione efficace e la perfusione completa del pancreas^1,4,7. Il metodo di consegna di questo protocollo permette all'enzima di attraversare le vie anatomiche per digerire meglio il tessuto esocrino che circonda le isole¹. Inoltre, questa tecni...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 3 mL	BD	309657	Collagenasi P
Hoding Pinze per vetri coprioggetto	VWR	82027-396	Tenere la pelle del topo per facilitare la procedura di incisione
Pinze curve	Sigma-Aldrich	Z168696	Trattenere i tessuti durante la rimozione del pancreas
Isoflurano	Piramal	B13B16A	Per anestetizzare i topi prima di un intervento chirurgico
Piastre di Petri da 100 mm	VWR	30-2041	Utilizzato per la coltura delle isole 30
G. ½ ago BD		305106	Per la penetrazione dell'ampolla di vater per fornire collagenasi P - questo calibro viene utilizzato in quanto si adatta bene alla maggior parte dei CBD Tubo
50 ml	VWR	89039-658	Contiene tessuto pancreatico digerito, collagenasi P e isole purificate
Cuscinetti assorbenti con barriera all'umidità impermeabile	VWR	82020-845	Per assorbire il sangue dai processi chirurgici
Centrifuga 5810R con secchio oscillante e capacità di decelerazione	Eppendorf	5811FJ478114	Utilizzare per la pellettatura di tessuti, il pellet si forma sul fondo del tubo conico - è necessaria una centrifuga a secchio oscillante. Anche la funzione di decelerazione è importante per formare i livelli di gradiente.
Collagenasi P- 1g	Roche Diagnostics	11249002001	Per la digestione del pancreas esocrino
Forbici chirurgiche curve	Fisher-Scientific	13-804-21	Per tagliare l'addome aperto del topo
Microscopio per dissezione	Olympus	SZX16	Utilizzato per l'identificazione delle strutture anatomiche chiave per fornire con precisione la collagenasi nel pancreas
salina bilanciata di Hank 10x	Corning	20-023-CV	Celle di lavaggio
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	Per la formazione
Sorgente luminosa	Leeds	LR92240	Miglioramento della visibilità del microscopio
RNaseZap	Fisher-Scientific	AM9780	Per la rimozione di RNasi
RPMI-1640 Media senza L-glutammina	Corning	15-040-CV	Isole di coltura
Schwartz micro serrefines (morsetto microvascolare)	Fine Science Tools	18052-01	Clampaggio del dotto biliare comune e dell'arteria epatica
Agitazione del bagno d'acqua	Boekel/Grant	8R0534008	Importante per la digestione meccanica del tessuto esocrino
Piccole forbici chirurgiche	VWR	82027-578	Tessuto di taglio che si attacca al pancreas