Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Daniel Villarreal; Geetali Pradhan; Chia-Shan Wu; Clinton D Allred; Shaodong Guo; Yuxiang Sun

doi:10.3791/57048

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Articolo metodologico

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

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DOI:

10.3791/57048

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30 agosto 2019

Daniel Villarreal¹ , Geetali Pradhan² , Chia-Shan Wu¹^,² , Clinton D Allred¹ , Shaodong Guo¹ , Yuxiang Sun¹^,²

¹Department of Nutrition and Food Science, Texas A&M University, ²Children's Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Abstract

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che produce ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Le isole sono costituite principalmente da cinque tipi di cellule che secernono l'ormone: le cellule secernono glucagone, le cellule secernono insulina, cellule che sortostatine, le cellule secernono la grelina e le cellule PP secernono la polipeptide pancreatica. Il sessanta-80% delle cellule nelle isole sono cellule z, che sono la popolazione cellulare più importante per studiare la secrezione di insulina. Le isole pancreatiche sono un sistema modello cruciale per studiare la secrezione di insulina ex vivo. Acquisire isocchi di alta qualità è di grande importanza per la ricerca sul diabete. La maggior parte delle procedure di isolamento dell'isolotto richiedono tecnicamente difficile accedere al sito di iniezione di collagenase, procedure di digestione dure e complesse e più fasi di purificazione del gradiente di densità. Questo documento presenta un semplice metodo di isolamento dell'isolotto del mouse ad alto rendimento con descrizioni dettagliate e dimostrazioni realistiche, che mostra i seguenti passaggi specifici: 1) iniezione di collagene P all'ampulla di Vater, una piccola area che unisce il condotto pancreatico e il dotto biliare comune, 2) la digestione enzimatica e la separazione meccanica del pancreas esocrino, e 3) un singolo passo di purificazione del gradiente. I vantaggi di questo metodo sono l'iniezione di enzima digestivo utilizzando l'ampulla più accessibile di Vater, una digestione più completa utilizzando la combinazione di approcci enzimatici e meccanici e una fase di purificazione a singolo gradiente più semplice. Questo protocollo produce circa 250-350 isolotti per mouse; e isolotti sono adatti per vari studi ex vivo. Possibili avvertenze di questa procedura sono potenzialmente danneggiate isole a causa di digestione enzimatica e/o incubazione del gradiente prolungata, che possono essere evitati in gran parte con un'attenta giustificazione pubblicitaria del tempo di incubazione.

Introduzione

Ci sono due metodi comuni nella letteratura per l'isolamento delle isolotzioni pancreatiche. Uno richiede di eccitare il pancreas e dividerlo in piccoli pezzi usando forbici chirurgiche, e poi digerirlo in una soluzione collagenae¹^,²^,³. Un altro metodo più preciso è quello di utilizzare la rete di dotti presenti nel pancreas per introdurre l'enzima digestivo. I seguenti siti sono stati utilizzati per l'iniezione di enzimi digestivi: la giunzione della bile e del dotto cistico, la cistifellea nel dotto biliare comune, o il dotto biliare comune stesso¹