Articolo metodologico

Esaminando monosinaptica connessioni in Drosophila utilizzando i canali di sodio tetrodotossina resistenti

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DOI:

10.3791/57052

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14 febbraio 2018

 , 
1Department of Biology, University of Maryland

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un metodo per verificare le connessioni monosinaptica tra neuroni impiegando tetrodotossina e il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac.

Abstract

Qui, una nuova tecnica chiamata Tetrotoxin (TTX) Engineered resistenza per sondare le sinapsi (TERPS) viene applicata per verificare monosinaptica connessioni tra i neuroni bersaglio. Il metodo si basa sulla co-espressione di un attivatore transgenico con il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac, in un neurone presinaptico specifico. Connessioni con presunto partner post-sinaptico sono determinate dalle cellule intere registrazioni in presenza di TTX, che blocca l'attività elettrica nei neuroni che non esprimono NaChBac. Questo approccio può essere modificato per funzionare con qualsiasi attivatore o l'imaging del calcio come un reporter di connessioni. TERPS aggiunge il set crescente di strumenti disponibili per determinare la connettività all'interno di reti. Tuttavia, TERPS è unico in quanto segnala anche attendibilmente massa o volume trasmissione e trasmissione di spillover.

Introduzione

Degli obiettivi principali delle neuroscienze è quello di mappare le connessioni tra i neuroni a comprendere il fluiscono di informazioni attraverso circuiti. Numerosi approcci e risorse sono diventati disponibili per testare la connettività funzionale tra neuroni in una gamma di sistemi modello1,2. Per generare gli schemi di collegamento più precisi utilizzando elettrofisiologia, è importante risolvere se osservate connessioni tra due cellule sono diretti e monosinaptica versus indiretto e polisinaptici. Un gold standard per fare questa distinzione nei neuroni dei mammiferi è di misurare la latenza tra singolo action potentials nelle cellule presinaptiche e l'insorgenza di correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) nel secondo neurone. Monosinaptica connessioni dovrebbero avere brevi latenze di pochi millisecondi e bassa variabilità3. Questo approccio può essere complicato in neuroni invertebrati poiché sinapsi possono verificarsi nel loro dendriti lontano dal sito di registrazione somatico, causando ritardi nel rilevamento a causa di distanze lungo elettrotoniche tra conduttanze postsinaptiche e la registrazione elettrodo. Tali ritardi possono introdurre ambiguità riguardo poli-versus monosinaptici contributi. Inoltre, piccoli eventi sinaptici può decadere prima di raggiungere il sito di registrazioni somatiche e guidano l'attività presinaptica più forte, è probabili reclutare polisinaptici eventi.

Varie tecniche sono state sviluppate per verificare le connessioni monosinaptica negli invertebrati. Un approccio utilizza soluzioni alta catione bivalente (Hi-Di) che contengono in eccesso Mg ++ e Ca+ +. Questa soluzione blocca le connessioni polisinaptici di riduzione probabilità di rilascio e crescente potenziale di azione soglia per favorire il rilevamento di monosinaptica ingresso4,5. Determinare il rapporto preciso di Mg Ca ++ ++ necessaria, tuttavia, non è banale e polisinaptici contributi possono persistere per stimolazione anche modesto6. Un approccio alternativo chiamato GFP ricostituzione attraverso partner sinaptica (stretta) sfrutta la vicinanza tra membrane pre- e postsinaptiche trovato alle sinapsi di dedurre una connessione monosinaptica 7. Qui, un componente della proteina fluorescente verde (GFP) è espresso in un neurone, e il frammento complementare della molecola è espressa in un presunto partner postsinaptico. La presenza di fluorescenza indica che i due neuroni sono nelle vicinanze per consentire la ricostituzione della molecola GFP e implica l'esistenza di una sinapsi. STRETTA può segnalare sinapsi falsamente, però, se due cellule strettamente hanno apposto membrane, come in un nervo o fascicolo. Varianti di impugnare eliminano tali falsi positivi tramite il tethering il frammento presinaptico della GFP direttamente alla sinaptobrevina, permettendo così la ricostituzione solo alle sinapsi attivo8. Mentre stretta e le sue varianti sono stati strumentali nel determinare la connettività funzionale in Drosophila CNS, alcuni collegamenti potrebbero non essere reso visibili da afferrare se le distanze tra i partner di pre- e postsinaptici è relativamente grande. Questo è particolarmente pertinente nella valutazione della trasmissione volume associato neuromodulation9 o di inibizione GABAergica10.

Qui, una tecnica complementare e romanzo è dimostrata per test connessioni dirette monosinaptica in Drosophila CNS. Questo metodo, chiamato tetrodotossina Engineered resistenza per sondare le sinapsi (TERPS), opera di co-espressione di tetrodotossina (TTX)-canale del sodio resistente, NaChBac e un attivatore di optogenetica in una cellula presinaptica durante la registrazione da presunti postsinaptica partner9. In presenza di TTX, tutte le attività di potenziale di azione-mediata è soppressa in cellule diverse da quelle che esprimono NaChBac. Il canale di NaChBac Ripristina selettivamente eccitabilità nelle celle presinaptiche mirate, permettendo la trasmissione sinaptica luce-evocati. Questo metodo consente la forte attivazione dei neuroni presinaptici, tale che le connessioni possono essere risolti postsynaptically registrando somatico, riducendo la probabilità di reclutamento circuiti polisinaptici. D'importanza, questa tecnica permette lo studio della trasmissione di volume e rivela la diffusione del trasmettitore liberato da un singolo neurone in tutto un circuito. Inoltre, TERPS può rivelare la natura chimica della connessione attraverso farmacologia convenzionale. TERPS è adatto ad uso in qualsiasi sistema di modello che permette l'espressione transgenica dei canali del sodio TTX-insensibile.

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Protocollo

1. preparare mosche e identificare GAL4 promotore linee

  1. Selezionare una linea di promotore GAL4 e attraversarlo con mosche che trasportano il transgene UAS-NaChBac sia un transgene optogenetica per l'attivazione.
    Nota: UAS-CsChrimson11 è selezionata a causa della sua alta conduttanza e la facilità con cui si attiva NaChBac-mediata dei potenziali di azione. UAS-NaChBac sia UAS-CsChrimson sono disponibili dal Repository di scorte di Bloomington.
  2. Preparare tutto-trans retinico come una soluzione in etanolo (35 mM) e conservare la soluzione in congelatore a-20 ° C.
  3. µ L di mix 28 di questo stock in circa 5 mL di patata reidratata fiocco cibo e aggiungere questa miscela alla parte superiore di una fiala di convenzionale media della drosofila .
  4. Sollevare le mosche adulte esprimendo csChrimson sul cibo contenente 0,2 mM all-trans-retinale per 1 – 3 giorni11.

2. preparare il brodo di TTX

  1. Creare una soluzione di riserva di 1mm TTX in acqua distillata o deionizzata. Conservare questa soluzione in un frigorifero di laboratorio per diversi mesi. Controllare le politiche di istituzioni per quanto riguarda lo stoccaggio di TTX come molte istituzioni classificano TTX come una sostanza pericolosa o controllata.

3. preparare mosche per elettrofisiologia

  1. Raccogliere 1 – 3 giorni adulto anziano mosche che vengono generati sul cibo con all-trans-retinale.
    Nota: Consultare Murthy e Turner nel 2013 per una descrizione dettagliata della patch di bloccaggio della drosofila neuroni12,13.
  2. Mettere le mosche in una fialetta di scintillazione. Posizionare la fiala sul ghiaccio per 1 min immobilizzare le mosche.
  3. Utilizzare pinze grossolane per inserire una Mosca in una camera di registrazione su misura. La camera è costituito da un 3 ½" cerchio taglio laser da 1/16" acrilico. Taglio un foro ¾" è il centro cui è collegato un foglio personalizzato con epossidica a 2 componenti. La pellicola contiene un triangolare a forma di speranza che viene inserito al volo.
  4. Applicare cera o resina epossidica curabile UV intorno all'animale di fissare saldamente all'interno della camera di registrazione.
  5. Illuminare la preparazione con una fibra ottica a collo di cigno per la visualizzazione sotto un microscopio stereoscopico. Impostare le fibre a collo di cigno per illuminazione obliqua regolandoli in modo che essi illuminano al volo direttamente dal lato.
  6. Regolare il livello di luce al più basso possibile che ancora permette la chiara visualizzazione della Mosca. Questa intensità luminosa varierà da singoli esperimenti.
    Nota bene: Questo protocollo può essere adattato utilizzando un in situ cervello explant metodo14.
  7. Recuperare la registrazione esterna salino. La soluzione salina contiene in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (idrossimetil) metil-2-aminoethane-solfonici, 8 trealosio, glucosio 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2e 4 MgCl2 (regolata a mΩ 270 – 275). La soluzione salina viene fatto gorgogliare con 95% O25% CO2 (carbogen) e ha un pH regolato a 7,315.
  8. Posto 4-6 gocce di soluzione fisiologica registrazione extracellulare sopra la preparazione vola. A questo punto, aumentare il livello di luce al microscopio di dissezione per una migliore visibilità.
  9. Affilare un filo di tungsteno mediante elettrolisi. Per rendere il filo, preparare una soluzione satura di KNO3 e applicare circa 20 V di AC corrente mentre la punta del filo nella soluzione 20 volte per 100 ms ogni di immersione fino a quando la punta è nitida. Utilizzare il filo di tungsteno affilata per rimuovere la cuticola sulla testa al volo ed esponendo così il cervello.
  10. Inoltre espone il cervello rimuovendo la trachea e corpi grassi che lo circondano. Se l'accesso ai lobi antennali, utilizzare un filo di tungsteno piegato o un attrezzo simile per infilare delicatamente antenne sotto il foglio di registrazione camera per aumentare la visibilità. Utilizzare pinze taglienti per strappare delicatamente la guaina glial che copre l'area di interesse in cui verranno effettuate registrazioni.
  11. Trasferire la camera di registrazione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia. Immediatamente inizio perfusione con soluzione fisiologica registrazione esterna gorgogliare con carbogen per preservare il cervello. Il serbatoio di soluzione salina è posizionato sopra il tavolino del microscopio e gravità-è alimentato alla preparazione. Utilizzare una linea del vuoto e un matraccio di Erlenmeyer 2L per raccogliere le saline dei rifiuti.

4. ottenere cellule intere registrazione

  1. Tirare pipette patch un estrattore commerciale pipetta. Consultare il manuale per le impostazioni ottenere un'appropriato pipetta con una resistenza di punta vicino a 7 mΩ.
  2. Aggiungere 4 µ l di soluzione di registrazione interna in una pipetta patch. La soluzione salina interna è costituito da 140 potassio aspartato, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA e 1 KCl in mM.
  3. Impostare il patch clamp amplificatore per registrazione di cellule intere. Zero offset dell'amplificatore e impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova. Qui, viene utilizzato un amplificatore del morsetto di Patch dei sistemi AM 2.400.
  4. Applicare pressione positiva attraverso la pipetta e avvicinarsi alla cella. Utilizzare un micromanipolatore per indirizzare la pipetta e contattare la cella. Rilascio di pressione positiva. Insieme il potenziale della holding della membrana a -60 mV. La pipetta deve formare un sigillo gigaohm con membrana delle cellule come evidenziato da un sub-picoamp bassa corrente di tenuta.
    Nota: Se usando GFP guidato delle cellule il targeting, tenta di ridurre al minimo utilizzo della luce epifluorescente per impedire l'attivazione ChR2 e potenziale depressione sinaptica. Attendere alcuni minuti prima di applicare il passaggio 5.
  5. Impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova da -50 mV a -60 mV. Questa impostazione è standard su amplificatori di patch-clamp. Impulsi di prova rivelerà un grande transitorio capacitivo che rappresenta la corrente necessaria per ricaricare la pipetta di patch. Rimuovere capacitivi transitori regolando le manopole di compensazione di capacità su AM 2400 o simili amplificatore.
  6. Applicare brevi impulsi di pressione negativa a rottura della membrana cellulare e ottenere la configurazione di cellule intere.
    Nota: Una configurazione di cellule intere è osservata quando c'è un grande aumento nei transienti capacitivi che mostra la capacità del neurone. Un piccolo aumento della corrente di mantenimento (baseline) sarà probabilmente anche osservato. Impostare l'amplificatore corrente morsetto modalità e regolare il potenziale della cella a -50 a -60 mV.

5. Verifica della connettività sinaptica

  1. Configurare il sistema di acquisizione dati per attivare un driver LED per generare impulsi di luce. Qui, un sistema DAQ di National Instruments è usato con Matlab per fornire un segnale analogico a un driver LED. L'intensità del LED è regolato tramite il segnale analogico per il driver. Il LED è una lunghezza d'onda di 620-630 nm LED.
  2. Posizionare il LED rosso ad alta potenza direttamente sotto la preparazione. Regolare l'intensità della luce in modo che 0,238 mW/mm2 raggiunge al volo.
  3. Attivare i neuroni presinaptici durante la registrazione dalla cellula postsinaptica di interesse. Raggiungere la cella attivazione optogenetically, pharmacogentically, o tramite la stimolazione del nervo. Qui, vengono applicati csChrimson e brevi impulsi di luce rossa.
    Nota: Connessioni sinaptiche possono essere monitorate sia in tensione oppure morsetto corrente come EPSPs come EPSC. Una connessione sinaptica dovrebbe essere visibile prima di applicare TTX in risposta ad un impulso di luce di 40 ms. Se nessuna connessione è osservata, è improbabile che i neuroni sono sinapticamente connessi sia mono - o polysynaptically. L'azienda potenziale può essere regolata per sottolineare le connessioni eccitatori o inibitori di conseguenza.
  4. Se una connessione è osservata in salino normale, aggiungere TTX per il sistema di perfusione per ottenere una concentrazione finale di 1 µM. utilizzare una pompa di ricircolo per acquisire e riutilizzare la soluzione fisiologica per conservare TTX. La pompa peristaltica sarà disegnare la soluzione salina dalla vasca e restituirlo al serbatoio salino.
  5. Regolare la velocità della pompa per fornire un forte vuoto costante che non consente tale livello salino nel bagno a salire e scendere.
    Nota: L'applicazione di TTX dovrebbe comportare la cessazione di chiodare l'attività nel neurone che viene monitorato in cellule intere. Questo conferma che abbastanza TTX è stato aggiunto per la soluzione fisiologica.
  6. Applicare di nuovo brevi impulsi di luce rossa (40 ms per ogni impulso). A questo punto, qualsiasi connessione sinaptica che rimane è probabile monosinaptica. Aggiungere farmacologici antagonisti per le saline a ricircolo per testare la natura chimica delle connessioni sinaptiche che rimangono in TTX.
    Nota: Quando si combinano optogenetica e targeting fluorescente dei neuroni, può essere importante non attivare con insistenza la popolazione presinaptica dei neuroni durante il tentativo di ottenere una registrazione. Questo può portare alla depressione sinaptica e rende difficile vedere le connessioni. Perché csChrimson ha una banda di eccitazione lunga che si estende in linea di massima nella gamma della proteina fluorescente verde, un fluoroforo rosso può essere utilizzato per visualizzare i neuroni e channel2rhodopsin (Ch2R) possono essere usati per eccitare le popolazioni delle cellule. Questa operazione richiede specifica genetica e un cubo di filtro personalizzato. Per generare mosche adatti, è possibile rendere mosche che esprimono il fluoroforo rosso (RFP o mCherry) nell'ambito dei sistemi di espressione binaria sistema LexA o Q. Questi dovranno essere incrociate con le mosche che esprimono un promotore Gal4 e geni effettori UAS-Ch2R e UAS-NaChBac. Il cubo di filtro ottimale per epifluorescenza avrà una gamma stretta di eccitazione per eccitare il fluoroforo rosso, ma non eccitare Ch2R. Inoltre, il set di filtri deve includere un filtro di emissione di passaggio lungo per raccogliere più luce emessa. Abbiamo usato un filtro personalizzato impostato da Chroma che comprendeva parte numeri et580/25 x e t600lpxr (dal set 49306), ma con un filtro di barriera/emissione di et610lp.

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Risultati

TERPS è utilizzato per distinguere tra mono - e polisinaptici contributi in connessioni sinaptiche tra i neuroni. Mentre la stimolazione debole di una cella può essere utilizzata per verificare le connessioni dirette, guidando una maggiore attività presinaptiche spesso reclute polisinaptici connessioni (Figura 1A). TERPS funziona cheesprimono il canale del sodio TTX-insensibile NaChBac e un attivatore di optogenetica e test delle connessioni in presenza di TT...

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Discussione

Analisi TERPS complimenti attuale tecniche utilizzate per circuito cracking attivando il rilevamento delle sinapsi tra neuroni identificati. In particolare, l'approccio rivela connessioni monosinaptica largamente silenziamento potenziali di azione con TTX durante il ripristino di eccitabilità in una popolazione di seleziona dei neuroni con il canale del sodio TTX-insensibile NaChBac. Rilascio sinaptico è tratta da stimolo optogenetica mentre eventi postsinaptici sono monitorati con cellule intere registrazioni. TERPS si ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Joshua Singer, Jonathan Schenk, come pure gli ospiti premurosi per i commenti sul manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Ben White e Harold Zakon per discussioni sulla tecnica. Jonathan Schenk ha fornito i dati per la Figura 3A. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione Whitehall e un R21 NIH al QG.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
UAS-csChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55135Utilizzato come attivatore neurale
UAS-NaChBacBloomington Drosophila Stock Center9466Resotores eccitabilità nelle cellule in TTX
TetrodotossinaTochris1078Potrebbe essere necessaria un'autorizzazione speciale per l'acquisto di TTX in quanto è una sostanza controllata
tutta trans-retinicaSigma-Aldrichall trans-RetinalR2500Richiede co-fattore per la canalrodopsina
Acciaio inossidabile 321 saldabile  Foglio,  0,002"  Spesso,  10"  Largo McMaster Carr3254K7Utilizzato per realizzare portamosche personalizzato. La pellicola personalizzata può essere tagliata al laser a pololu.com dal file PDF fornito
Microscopio di dissezioneZeissStemi 2000-CUtilizzato per la dissezione della preparazione
CeraAlmoreEectra Waxer 66000Utilizzato durante la dissezione per fissare la mosca in lamina
Cera di paraffinaJoann4917217 Utilizzato con la
ceratrice Numero 5 pinzeStrumenti per la scienza#5COUtilizzato per la dissezione e la guaina
Forbici da dissezioneStrumenti per la scienza fine15001-08Utilizzato per rimuovere parti della cuticola durante la dissezione
Filo di tungstenoA-M Systems797500Utilizzare con l'elettrolisi per realizzare aghi affilati per la dissezione
Pompa peristaltica circolantePompe semplicemente (Amazon)PM200Sper il ricircolo TTX
Regolatore di velocità per pompa peristalticaZitrades (Amazon)N / APWM per luci a LED o nastro, 12 Volt 8 Amp, interruttore luce a luminosità regolabile Dimmer Controller DC12V 8A 96W per striscia luminosa a led B
Versa-Mount  Regolatore di aria compressa di precisioneMcMaster Carr1804T1Per l'applicazione di una pressione positiva durante il patching
Capilari in vetroPrecision InstrumentsTW150F-3Per pipette per patch
Manometro multiusoMcMaster Carr3846K431Manometro per regolatore
di pressione Elettrofisiologia CameraDage MTI IR-1000Qualsiasi telecamera che funzioni nella gamma IR (850 nm) funzionerà. Non si desidera utilizzare l'illuminazione rossa in quanto ciò può attivare csChrimson
IR LEDThorlabs M850F2Per fibra ottica di illuminazione obliqua
per IR LEDThorlabsM89L01Coppie a IR
LED Obiettivo lente Olympus 40XLUMPlanFLNPuò essere utilizzato sulla maggior parte delle microscienze e funziona bene per la visualizzazione dei neuroni delle mosche.
LED ambraThorlabsM590L3dPer la visualizzazione di RFP e
mCherry Blue LEDThorlabsM470L3dPer la visualizzazione del
GFP Chroma49011Per la visualizzazione di GFP o la stimolazione del canale2rodopsina
Set di filtri mCherry personalizzatoChroma  ET580/25X e T600LPXR (dal set 49306) ma con un'ottica di barriera/emissione ET610LPUtilizzare solo se si desidera applicare patch ai neuroni identificati con channel2rhodopsin
Dichroic per combinare LED ambra e bluThorlabs DMLP550RUtilizzare solo il cerotto sotto mCherry ed eccitare channel2rhodopsin con luce blu.
rossiLEDSupplyCree XPE 620 - 630 nmUtilizzato per pilotare csChrimson
LED DriverLEDSupply3021-D-E-1000Utilizzato per pilotare LED per stimolazione optogenetica
ManipolatoreSutter InstrumentsMP-225Utilizzato per posizionare la pipetta durante le registrazioni
Amplificatore PatchclampA-M SystemsModello 2400È adatto
Bessel FilterWarner Instruments LPF 202AFiltro ausiliario utilizzato per filtrare la traccia di corrente all'oscilloscopio durante il patching.
Sistema di acquisizione dati National InstrumentsNI PCIe-6321            781044-01Utilizzato per registrare dati dall'amplificatore al computer
Blocco connettore - Terminale BNC BNC-2090ANational Instruments779556-01Utilizzato per collegare l'amplificatore alla scheda DAQ.
Lamina d'acciaio McMaster Carr3254K7Lamina d'acciaio per camera di registrazione personalizzata
MagnetiK& J MagneticsD42Per fissare la camera di registrazione al supporto ad anello
1/16" Cell Cast Acrylic ClearPololuUtilizzato per realizzare una camera di registrazione personalizzata. L'acrilico può essere tagliato al laser con pololu.com dal file PDF fornito
Controller dimmer World set di filtri GFPLED un amplificatore equivalente

Riferimenti

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