Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Summary

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Abstract

Microglia, le cellule immunitarie residente nel cervello, sono i primi soccorritori per infiammazione o lesioni nel sistema nervoso centrale. La ricerca recente ha rivelato microglia di essere dinamico, capace di assumere fenotipi sia pro-infiammatorie e anti-infiammatori. Sia M1 (pro-infiammatori) e M2 (pro-riparativa) fenotipi giocare un ruolo importante in condizioni neuroinfiammatorie come lesione cerebrale perinatale e mostre differenti funzioni in risposta a determinati stimoli ambientali. La modulazione dell'attivazione microglial è stata notata per conferire neuroprotezione suggerendo le microglia possono avere potenziale terapeutico nella ferita di cervello. Tuttavia, più ricerca è necessaria per comprendere meglio il ruolo della microglia nella malattia, e questo protocollo che facilita. Il protocollo descritto sotto combina un processo di centrifugazione su gradiente di densità per ridurre i detriti cellulari, con separazione magnetica, produrre un campione altamente puro di cellule microgliali primario che può essere utilizzato per la sperimentazione in vitro , senza la bisogno per 2-3 settimane di coltura. Inoltre, le operazioni di caratterizzazione resa solida funzionale dei dati sulla microglia, aiutando gli studi per migliorare la nostra comprensione della polarizzazione e l'innesco di queste cellule, che ha forti implicazioni nel campo della medicina rigenerativa.

Introduction

Danni acquisiti durante il periodo perinatale da infiammazione, ipossia-ischemia ed emorragia possono avere una serie di conseguenze a lungo termine. La patofisiologia complessa di lesione cerebrale perinatale è teorizzata per coinvolgere l'infiammazione e ischemia con conseguente morte neuronale ed assonale¹. La risposta immunitaria innata svolge un ruolo importante nella cascata di eventi che portano a lesioni².

Microglia, le cellule immunitarie residente all'interno del sistema nervoso centrale (CNS), sono i primi soccorritori a lesioni³. Le microglia sono tipi di ce....

Protocol

Le procedure seguenti sono state approvate dal comitato di etica animale presso l'Università di Monash. Topi C57Bl6/J P3-6 neonato in buona salute non trattati sono stati utilizzati per generare i risultati rappresentativi.

1. enzimatica digestione

Nota: È importante considerare la sterilità quando isolamento e coltura di cellule primarie. Garantendo nel contempo che l'ambiente è come sterile come possibile, la dissezione iniziale e la raccolta del cervello murino può essere completati di fuori di una cappa a flusso laminare, con tutti i successivi passaggi eseguiti all'interno di una cappa a flusso laminare.

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Results

Utilizzando i metodi descritti qui, puri popolazioni di microglia possono essere isolati e possono essere pronti per la caratterizzazione utilizzando in vitro e analisi al FACS. Per cominciare, fino a 18 animali possono essere utilizzati per abbattimento, con un rendimento atteso di circa 450.000-600.000 cellule microglial. È fondamentale per confermare la purezza delle cellule isolate, e per farlo in quanto l'analisi Citofluorimetrica è stata eseguita dalla macchiatura per due m.......

Discussion

Microglia hanno la capacità di essere sia pro - e anti-infiammatori, alterato da stimoli di ambiente. Studi precedenti hanno dimostrato che la modulazione dell'attivazione di microglia può conferire neuroprotezione. Loro capacità di fornire protezione ai neuroni e riparare lesioni richiede ulteriori ricerche per favorire la comprensione corrente di queste cellule complesse. Così, l'isolamento di elevata purezza primaria microglia è una tecnica importante ed utile. Si tratta di un metodo relativamente rapido per ottenere .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, basso glucosio, piruvato	Gibco	11885084
antibiotico-antimicotico (100X)	Gibco	15240062
DNaseI grado II da pancreas bovino	Sigma-Aldrich	10104159001
Papaina da lattice di papaia, soluzione acquatica tamponata	Sigma-Aldrich	P3125-100mg
Siero fetale bovino, qualificato, inattivato a caldo	Gibco	16140071
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Soluzione salina bilanciata di Hank (1X)	Gibco	14175-103
Soluzione salina bilanciata di Hank (10X)	Gibco	14185052
EasySep Mouse CD11b	StemCell Technologies	18770	Variante
del magnete EasySepMagnete EasySep	StemCell Technologies	18000
EasySep Buffer	StemCell Technologies	20144
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco	Gibco	14040182
Tripsina (2,5%) (10X)	Gibco	15090-046
Ratto purificato Anti-Topo CD16/CD32 (Topo BD Fc Block™)	BD Biosciences	553141
Provetta in PP ad alta trasparenza Falcon 5mL a fondo tondo, con tappo a scatto,	352063		corning
175cm² Pallone per colture cellulari con collo angolato con tappo di sfiato	Corning	431080
Lipopolisaccaridi da Escherichia coli O127:B8	Sigma-Aldrich	L5024
96 micropiastre trattate con TC a 96 pozzetti, trasparenti, polistirene, fondo rotondo	Corning	CLS3799
Paraformaldeide (polvere, 95%)	Sigma-Aldrich	158127
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100
Coniglio Anti-IBA1	Wako	01919741
Capra Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077<
strong>FACS Anticorpi	Azienda	Numero di catalogo
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO	BD Biosciences	560501
PerCP-Cy5.5 CD11b	eBiosciences	45-0112-82
ZombieNIR	Biolegend	423105
pHrodo Red E. coli BioParticelle coniugato	Thermo Fisher Scientific	P35361
Annexin.V_FITC	Miltenyi Biotech	130-093-060
Propodium Soluzione di ioduro	Miltenyi Biotech	130-093-233