Il manoscritto descrive un chip digitale test PCR per rilevare una variante rara di trascrizione CDH1 (CDH1a) nel normale fresco-congelato e tessuti del tumore ottenuti da pazienti con cancro gastrico.
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Articolo metodologico
Rilevamento di una variante rara trascrizione CDH1 in tessuti di cancro gastrico fresco congelato mediante PCR digitale basata su Chip
In questo articolo
Sommario
Abstract
CDH1a, una non-canonica trascrizione del gene CDH1 , è stato trovato per essere espresso in alcune linee cellulari di cancro gastrico (CG), mentre è assente nel mucosa gastrico normale. Recentemente, abbiamo rilevato la variante di trascrizione di CDH1a nei tessuti di fresco-congelato del tumore ottenuti da pazienti con GC. L'approccio PCR (dPCR) digitale basata su chip qui presentata è stata studiata l'espressione di questa variante nei campioni di tessuto. dPCR offre il potenziale per una misurazione accurata, robusto e altamente sensibile degli acidi nucleici ed è sempre più utilizzata per molte applicazioni in diversi campi. dPCR è in grado di rilevare gli obiettivi rari; Inoltre, dPCR offre la possibilità di assoluta e precisa quantificazione degli acidi nucleici senza la necessità di calibratori e curve standard. Infatti, la reazione di partizionamento arricchisce la destinazione dallo sfondo, che migliora l'efficienza di amplificazione e tolleranza agli inibitori. Tali caratteristiche rendono dPCR uno strumento ottimo per la rilevazione della trascrizione rara CDH1a .
Introduzione
Il gene CDH1 codifica per E-caderina, un fattore chiave coinvolti nel mantenimento dell'epitelio gastrico normale attraverso il regolamento di adesione, sopravvivenza, proliferazione e migrazione delle cellule1. Perdita della proteina di E-caderina a seguito di germline deleteri o alterazioni somatiche del CDH1 sono state associate con lo sviluppo di GC2,3. Trascritti non canonici derivanti da introne 2 del gene inoltre sono stati supposti per svolgere un ruolo nella carcinogenesi gastrica4,5. In particolare, u....
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Protocollo
Il protocollo segue le linee guida del Comitato di etica IRST umana ricerca.
Nota: Questa procedura è specificamente progettata per il rilevamento di un basso numero di molecole di cDNA in tessuti umani fresco-congelato. Le sezioni di tessuto sono state tagliate il ghiaccio secco, mentre ancora congelato, da tumore gastrico paziente-derivato precedentemente convalidato o campioni di tessuto normale.
1. RNA isolamento e purificazione
-
Estrazione del RNA
Nota: Isolamento del RNA viene eseguita sotto il cofano usando un prodotto specifico (Vedi Tabella materiali). Tutta....
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Risultati
Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo controllato per l'espressione della variante rara trascrizione CDH1a in tessuti gastrici fresco-congelato. L'analisi di dPCR è stato effettuato su campioni 21-accoppiato di tessuto normali e tumorali e in 11 campioni tumorali aggiuntive. CDH1a era rilevabile nei tumori 15 su 32 (47%), mentre nessun campioni di tessuto normali hanno mostrato la presenza di questa rara trascrizione5. Nella nostra anal.......
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Discussione
dPCR è stato originariamente sviluppato per DNA molecolare misure10,11,12,13 e nel tempo che questa tecnologia è stata adattata per la quantificazione dei microRNA e RNA trascrizioni5, 14,15. In questo protocollo abbiamo esteso l'elenco delle applicazioni per includere il rilevamento delle rare trascr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non segnalano conflitti di interesse per questo lavoro.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Gráinne Tierney per assistenza editoriale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente TRIazol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glicogeno 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Kit di pulizia | QIAGEN | 74204 | |
| Kit di sintesi iScript cDNA | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT test progettato su misura | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [concentrazioni del test ottimizzate per dPCR: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| campione a doppio blocco piatto | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio 3D Tilt Base per sistema PCR GeneAmp a doppio blocco piatto 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| Kit adattatore per chip PCR digitale 3D QuantStudio per termociclatore a blocco piatto | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| Caricatore di chip PCR digitale QuantStudio 3D | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| Strumento PCR digitale 3D QuantStudio con cavo di alimentazione | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
Riferimenti
- van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
- Carneiro, P., et al. E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions. FEBS Le....
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Ristampe e permessi
