Scioltezza di cromatina sembra essere coinvolto nel potenziale inerente allo sviluppo dei blastomeri. Tuttavia, non è noto se scioltezza della cromatina può essere utilizzato come un indice affidabile per il potenziale di sviluppo per gli embrioni. Qui, è stato descritto un sistema sperimentale in cui zigoti scioltezza-valutata della cromatina possono sviluppare al termine completo.
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Articolo metodologico
Fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di Full-term
In questo articolo
Sommario
Abstract
La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l'analisi di eventi molecolari durante l'ontogenesi. Recentemente, la scioltezza della cromatina o apertura ha dimostrato di essere coinvolti nel potenziale differenziazione cellulare delle cellule staminali embrionali pluripotenti. Precedentemente è stato segnalato che confrontato con cellule staminali embrionali, zigoti harbor una struttura della cromatina estremamente allentata, suggerendo la sua associazione con la loro totipotenza. Tuttavia, fino ad ora, è non stato affrontato sia la struttura della cromatina estremamente allentata/Apri, è importante per il potenziale dello sviluppo embrionale. Nello studio presente, per esaminare questa ipotesi, è stato sviluppato un sistema sperimentale in cui zigoti che sono stati analizzati tramite fluorescenza recupero dopo lo sbiancamento foto può sviluppare a termine senza alcun danno significativo. D'importanza, questo sistema sperimentale deve solo thermos-piastra di riscaldamento oltre a un microscopio a scansione confocale del laser. I risultati di questo studio suggeriscono che il recupero fluorescenza dopo lo sbiancamento foto analisi (FRAP) analisi può essere utilizzato per studiare se gli eventi molecolari nella cromatina zygotic sono importanti per lo sviluppo di full-term.
Introduzione
Dopo la fecondazione, la struttura della cromatina è alterata in modo dinamico e struttura della cromatina zygotic è poi alla fine stabilito1,2. Durante questo periodo, nel paterni pronuclei, le proteine della cromatina dominante sono trasformata da protamina istone. La cromatina risultante è estremamente diversa da quella di spermatozoi e ovociti femminili in diversi punti (ad es., composizione variante dell'istone, modifica dell'istone). Così, formato della cromatina zygotic è pensata per essere importante per il successivo sviluppo embrionale. Tuttavia, nonostante gli sforzi per rivelare i dettagli....
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Protocollo
Questo studio è stato svolto in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dell'Università di Yamanashi. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico di esperimenti di animale dell'Università di Yamanashi (permesso numero: A24-50). Tutti gli interventi sono stati eseguiti in anestesia tribromoethanol, e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza. Una panoramica illustrata delle procedure e l'orario sono mostrati in Figura 1 e tabella 1, rispettivamente.
1. preparazione di RNA messaggero (In Vitro tr....
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Risultati
zFRAP analisi con eGFP-H2B
Prodotto correttamente mRNA codificante eGFP-H2B, che è visto come una band spostata causato da poli una coda (Figura 2A), è stato iniettato nel citoplasma degli zigoti con un 2 ° corpo polare a 1-3 h dopo l'inseminazione (Figura 2B). Otto a 12 h dopo l'inseminazione, zigoti con 2 pronuclei mostrando l'espressione di eGFP-H2B sono stati raccolti .......
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Discussione
Come rivelato in questo studio, l'analisi di zFRAP non causa danni critici al termine sviluppo, suggerendo che questo metodo è uno strumento molto utile per rivelare l'associazione tra eventi molecolari e il potenziale dello sviluppo embrionale. Durante la riprogrammazione, in due-cellula come stato di cellule ES, da cui il potenziale differenziale di quelle cellule diventa alto quanto quello di embrioni in fase bicellulare, scioltezza di cromatina cambia in quello paragonabile con fase bicellulare embrioni
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura e Kana Kishida per fornire supporto tecnico e commenti critici. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia programma per promuovere la riforma delle università nazionali al modus operandi; la società giapponese per la promozione della scienza (16h 02593), Asada Science Foundation e la Fondazione di scienza di Takeda a T.W. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio confocale a scansione laser | Olympus | FV1200 | FV1000 può essere utilizzato anche per l'analisi FRAP (riferimento #7) |
| Piastra termica | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Microscopio invertito | Olympus | IX71 | |
| Micro manipolatore | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipolatore | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| piastra di coltura da 35 mm | Falcom | 351008 | stile 35 x 100 mm; per FIV |
| piastra di coltura da 60 mm | Falcom | 351007 | stile 60 x 15 mm; per coltura di embrioni |
| piastra di coltura da 50 mm | Falcom | 351006 | stile 50 x 9 mm; per la manipolazione sul tavolino |
| piastra con fondo in vetro da 50 mm | Matsunami | D910400 | piastra da 50 mm, 27 mm φ dimensione del foro; per analisi FRAP |
| Olio minerale | Sostanze chimiche organiche per la spezialità | 625071 | Per l'analisi FRAP sulle piastre con fondo in vetro |
| Olio minerale | Sigma | M8410-1L | Per la fecondazione in vitro e la coltura di embrioni |
| capillare in vetro | Drummond | 1-000-1000 | Per la manipolazione di zigoti di topo |
| Vetro borosilicato | Prime tech | B100-75-10-PT | Per microiniezione di estrattore per |
| micropipette a mRNA | Strumento Sutter | P-97/IVF | Per la preparazione dell'iniezione o del neadle di tenuta (diametro esterno: 80 & micro; m, diametro interno: 10 µ m) |
| Microforgia | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Kit di trascrizione | Thermo Fisher scientific | AM1340 | |
| Kit di coda Poly (A) | Thermo Fisher scientific | AM1350 | |
| Soluzione PVP 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HTF tamponato HEPES contenente il 10% |
| di PVP Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Plasmide modello per l'mRNA di eGFP-H2B (riferimento #6) | ||
| Colorante di caricamento del campione NorthernMax Gly | Thermo Fisher scientific | AM8551 | Per l'elettroforesi di mRNA trascritto in vitro |
| Fenolo cloroformio isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Cloroformio | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Non I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Misuratore di potenza otico | Hioki | 3664 | Misuratore di potenza per |
| microscopio stereomico Olympus | SZX16 |
Riferimenti
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K.
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Ristampe e permessi
