In questo documento vengono forniti dettagli per i metodi di produzione e controllo di qualità di una proteina di fusione ricombinante IL4-10. Mostriamo anche come testare l'efficacia di questa proteina a risolvere il dolore in un modello murino di dolore infiammatorio.
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Articolo metodologico
Sviluppo di proteine ricombinanti per trattare il dolore cronico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dolore cronico è difficile da trattare e sono urgentemente necessari nuovi approcci per risolvere il dolore persistente. Citochine antinfiammatorie sono promettenti candidati per il trattamento di condizioni debilitanti di dolore a causa della loro capacità di regolare le interazioni neuro-immunitaria aberrante. Tuttavia, fisiologicamente lavorano in una rete di varie citochine, e di conseguenza il loro effetto terapeutico potrebbe non essere ottima quando usati come farmaci stand-alone. Per ovviare a questa limitazione, abbiamo sviluppato una proteina di fusione delle citochine antinfiammatorie IL4 e IL10. Qui, descriviamo i metodi di produzione e controllo di qualità della proteina di fusione ricombinante IL4-10 e testiamo l'efficacia della proteina di fusione IL4-10 a risolvere il dolore in un modello murino di dolore infiammatorio persistente.
Introduzione
Dolore cronico rimane uno dei problemi medici più debilitanti e sotto-trattata del XXI secolo, che interessano > 20% della popolazione adulta1,2. Tuttavia, trattamenti per fornire sollievo dal dolore cronico sono spesso inefficaci o devono essere interrotto a causa di gravi effetti collaterali3. Cosa importante, attualmente disponibili farmaci solo fornire sollievo sintomatico, ma non significativamente modificare o curare il dolore cronico. Anche se il dolore cronico sembra essere un disturbo neurologico, prova suggerisce la partecipazione del sistema immunitario nel dolore cronico svi....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alle linee guida internazionali e previa approvazione del comitato etico sperimentale locale. Sangue intero è stato ottenuto dal servizio donatore Mini (Mini donatore Dienst, MDD) presso University Medical Center Utrecht (UMCU) nei Paesi Bassi. MDD ha ricevuto l'approvazione positiva dal comitato di etica medica della UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) per il numero protocollo 07-125/C.
1. caratterizzazione e produzione di proteine
- Coltura cellulare
Nota: Vedere la Tabella materiali per mezzo di coltura utilizzato.
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Risultati
Un'immagine rappresentativa di un gel di SDS-PAGE che contiene diverse frazioni ottenute durante la purificazione di cromatografia di affinità è illustrata nella Figura 1A. Del carico (L) e il flusso attraverso le frazioni (FT), si osservano tutte le proteine presenti nel surnatante HEK293. Nessuna proteina è osservata nella frazione di lavaggio (W). Nella frazione di eluizione (E), due bande di kDa 35 e 37 sono osservate corrispondenti a due.......
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Discussione
Questo manoscritto descrive metodi per la produzione e la caratterizzazione di un recombinant della proteina di fusione di IL4-10 e i metodi per testare la sua efficacia nell'inibire la iperalgia infiammatoria in modelli murini di dolore infiammatorio persistente. La produzione e purificazione della proteina di fusione IL4-10 viene eseguita su piccola scala. Cellule HEK293 sono selezionate come un sistema di espressione per la produzione di proteine perché permettono modifiche post-traduzionali che non possono essere rea.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Parte di questo lavoro è stato finanziato da un Utrecht University Life Sciences concedere
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule FreeStyle 293-F | Invitrogen | R790-07 | Cellule renali embrionali umane |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Terreno di coltura |
| 293fectina Reagente | Invitrogen | 12347019 | Reagente di trasfezione |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life | 51985026 | Medium Siero ridotto per l'uso durante le trasfezioni lipidiche cationiche |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| Sefarosio attivato da CNBr 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | Terreno pre-attivato per l'accoppiamento di anticorpi o altre proteine di grandi dimensioni |
| Acido cloridrico fumante 37% | Merck | 1003171000 | |
| Cloruro di sodio | Sigma | S7653-1kg | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma | 31437 | |
| Trizma cloridrato | Sigma | T3253-500G | TRIS cloridrato |
| Acido acetico 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glicina-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Farmacia, soluzione | salina tamponata con fosfato | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer per elettroforesi |
| SDS Gel Mini-PROTEAN TGX | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS Gel prefabbricati |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Pacchetti di trasferimento Western blot |
| Colonna Yarra 3u SEC-2000 | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | pronto all'uso Colorazione proteica Coomassie per gel di poliacrilammide |
| Umano IL-10 DuoSet ELISA | R& D | DY217B | |
| TNF umano&alfa; ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| Kit di analisi delle proteine BCA Pierce | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carragenina | Sigma-Aldrich | 22049 | mucopolisaccaride vegetale |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | adiuvante del vaccino |
| siringa di Hamilton | Sigma-Aldrich | 20779 | siringa di vetro |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Recinto per animali |
| Von Frey supporto in rete | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey peli | Stoelting | 58011 | touch test sonde sensoriali |
| Test plantare (metodo Hargreaves) | IITC Life Science | 390G | test plantare con vetro riscaldato |
| Test dinamico di portanza | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | test del deficit posturale |
| Colonne Econo-Colonna in vetro, 1,5 & 30 cm | in vetro BIO-RAD | 7371532 | |
| Tubo per dialisi SnakeSkin | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Filtro per siringa | Sartorius | 16555-K | unità filtrante monouso, 0,45 &; |
| M CASY Contatore e analizzatore di celle | Roche |
Riferimenti
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widesp....
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Ristampe e permessi
