Articolo metodologico

Coltura delle cellule epiteliali del pigmento retinico su un modello Ex Vivo della membrana di Bruch umano invecchiato

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DOI:

10.3791/57084

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12 aprile 2018

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1Department of Ophthalmology and Visual Science, Yale School of Medicine, 2Edward S. Harkness Eye Institute, Columbia University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo del presente protocollo è quello di dimostrare alla coltura delle cellule (RPE) epiteliale del pigmento retinico sulla membrana di Bruch umano invecchiato e/o malate. Questo metodo è adatto per studiare il comportamento delle cellule RPE su una matrice extracellulare compromessa.

Abstract

Oltre a vitamine e antiossidanti consigliati dallo studio di malattia dell'occhio relativa all'età, non esiste nessuna terapia efficace per "secca" o atrofica età degenerazione maculare senile (AMD) che rappresenta il 90% dei casi. Sono necessarie terapie per rallentare o ritardare lo sviluppo di atrofia geografica (GA), e capire la patologia della membrana di Bruch è parte di questo processo. Alterazioni nella membrana di Bruch umano precedono la progressione di AMD contribuendo al danno di epiteliale del pigmento retinico (RPE) cellule. Data la mancanza di sufficienti modelli animali per lo studio di AMD, modelli ex vivo della membrana di Bruch umano invecchiato servono come un utile strumento per studiare il comportamento delle cellule RPE da immortalato e linee cellulari primarie come pure RPE linee derivate da staminali pluripotenti indotte cellule (iPSCs). Qui, presentiamo un metodo dettagliato che permette di determinare gli effetti del comportamento delle cellule RPE seminate su espianti di membrana di Bruch umano raccolto da donatori umani, compreso l'allegato, apoptosi e proliferazione, capacità di phagocytize del fotoricettore esterno segmenti, istituzione di polarità e l'espressione genica. Questo test fornisce un modello ex vivo della membrana di Bruch invecchiato per valutare le caratteristiche funzionali delle cellule RPE quando seminato sulla matrice extracellulare invecchiato/compromessa.

Introduzione

Età-correlate cambiamenti strutturali alla membrana di Bruch umana, che è causata da molti fattori, tra cui nitrosativo e stress ossidativo, esercita molteplici effetti deleteri sulla funzione del pigmento retinico epiteliale (RPE) cellule e contribuisce alla patologia di degenerazione maculare senile (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Quando si considera la terapia sostitutiva delle cellule per avanzate AMD atrofica o atrofia geografica, trattamento richiederà probabilmente il trapianto di cellule su un letto di atrofia delle cellule RPE. Cambiamenti età-correlati all'interno della membrana di Bruch umana possono influenzare negativamente il successo degli innesti di cellule RPE trapiantati, dato il danno alla matrice extracellulare6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Investigating umani biologia della membrana di Bruch e come i mutamenti strutturali all'interno della matrice contribuire alla progressione di AMD sono fondamentali per comprendere la patologia della malattia. Così, c'è una necessità critica per gli investigatori nel campo degli occhi legate all'età di sviluppare protocolli che descrivono la raccolta di ex vivo della membrana di Bruch umano invecchiato e/o malate.

Storicamente, è stato difficile ai disordini relativi all'età di modello quali atrofia geografica e membrana di Bruch umana a un invecchiato in animali23. Questa difficoltà nasce da molteplici fattori tra cui la longevità degli esseri umani rispetto ai roditori e altre specie frequentemente utilizzato per malattia di modellazione, come pure la mancanza di un macula nella maggior parte dei vertebrati24. Il vantaggio del metodo descritto qui è che le cellule possono essere testate direttamente sulla membrana di Bruch estratta dal post mortem occhi di persone malate o invecchiati. L'obiettivo generale di questo articolo è fornire una metodologia dettagliata per un modello ex vivo della membrana di Bruch umano invecchiato e/o malati, tra cui l'isolamento di umano di Bruch membrana espianti da donatori umani e la semina di RPE cellule per esperimenti a valle. Questo modello può servire come un modello pertinente di studiare il contributo di danni di matrice extracellulare RPE cellulare funzione e patologia20,25,26,27,28.

Protocollo

Il seguente protocollo viene eseguito in aderenza ai principi della dichiarazione di Helsinki e le linee guida del Comitato di etica umana ricerca di Yale University.

1. gli occhi erogatori umani di sourcing

  1. Ottenere globi donatore umano dalla nazionale ricerca malattia Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). A seconda del progetto, è necessario preparare non meno di tre paia di occhi di donatore per ogni gruppo sperimentale.
  2. Enucleare gli occhi erogatori all'interno di 10 h e nave entro 48h post-mortem. Quindi trasportare gli occhi al laboratorio in modificato Eagle medium (DMEM) terreno di coltura sterile di Dulbecco su ghiaccio. Precedentemente segnalati studi hanno dimostrato che gli occhi donatore raccolgono e trasportati in questo modo di preservare le caratteristiche biologiche e le attività di membrana25,26,29 di Bruch.

2. raccolta della membrana di Bruch umano espianti

  1. Luogo ogni occhio su una garza di 1,5 x 1,5 pollici imbevuto con anidride carbonica-indipendente DMEM media in una piastra di coltura di 100 mm e uso lama fine forbici per fare un'incisione attraverso la sclera 3 mm posteriormente al limbus ed estendere circonferenzialmente in entrambe le direzioni.
  2. Fare un incisione circonferenziale di pieno-spessore (penetrando vitroso) 1 mm posteriore per l' ora serrata. Rimuovere e gettare il segmento anteriore (cornea, lente e iris), il vitreo e retina.
  3. Utilizzare forbici chirurgiche bene fare quattro incisioni radiali tra la sclera e la coroide e staccarsi la sclera la periferia al nervo ottico, avendo cura di evitare di strappare la membrana di Bruch/coroide complesse.
  4. Successivamente, praticare un'incisione circonferenza attraverso lo spazio suprachoroidal lungo l' ora serrata e sbucciare complesso coroide membrana di Bruch RPE posteriormente dalla sclera.
  5. Rimuovere cellule RPE native bagnando l'espianto con 0,02 M idrossido di ammonio in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) in un polistirolo 60 x 15 mm di Petri per 20 min a temperatura ambiente, seguita da lavare tre volte in DPBS (Figura 1).
  6. Float espianto di complesso membrana di Bruch in media senza anidride carbonica su una membrana di 65 µm di spessore politetrafluoroetilene unlaminated, idrofobo con 0,2 µm pori, con lo strato di lamina basale di ogni espianto rivolto verso la membrana.
  7. Inserire una membrana di politetrafluoroetilene con espianto della membrana di Bruch su un supporto di vetro sinterizzato in un sistema di vuoto portafiltro microanalisi di vetro.
  8. Appiattire i bordi arricciati dal lato della coroide con una pinzetta rivestita con Teflon, facendo attenzione a non per toccare il lato di laminina basale membrana di Bruch.
  9. 15 mL di agarosio (4% in DPBS) di calore e quindi raffreddarlo a 37 ° C. Poi versare 15 mL di gel frullato sul complesso coroide membrana di Bruch dal lato coroidica esercitando una leggera aspirazione per garantire che l'espianto rimarrà piatta. Mantenere il tessuto a 4 ° C per 2-3 min solidificare l'agarosio e poi sbucciare la membrana di politetrafluoroetilene distanza.
  10. Mettere espianto di membrana di Bruch (1,5 pollici di diametro, all'interno di gel di agarosio solidificato) in un 60 x 15 mm polistirolo cella cultura piatto (con la membrana di Bruch si è rivolto verso l'alto) che è stato rivestito con agarosio caldo liquido sul fondo del piatto per fissare la membrana di Bruch explant sul fondo del pozzo con lo strato basale laminina explant rivolto verso l'alto.
  11. L'agarosio solidificherà entro 2-3 min a temperatura ambiente per stabilizzare espianti di membrana di Bruch nella piastra di coltura. Coperchio della membrana di Bruch espianti nella cultura piatto con DPBS e memorizzare il piatto a 4 ° C per un uso futuro. Figura 2A dimostra che la membrana di Bruch isolato espianti in una piastra di coltura 60 x 15 mm.
  12. Se il sistema di coltura desiderata si trova in una piastra a 96 pozzetti, espianto di membrana di Bruch (1,5 pollici di diametro, con gel di agarosio solidificato) posto su un foglio di Teflon con il laminin-lato in su.
  13. Utilizzando un trapano, tagliata cinque o sei, 6 mm-circolare pulsanti dalla membrana di Bruch complesso explant e inserire ciascuno su agarosio al 4% a 37 ° C in un polistirolo non trattata bene di una piastra a 96 pozzetti. L'agarosio solidificherà entro 2-3 min a temperatura ambiente per Difficoltà espianti di membrana di Bruch (pulsanti) sul fondo di ciascun pozzetto.
    Nota: Nella figura 2B dimostra pulsanti a membrana di Bruch trephined in una piastra a 96 pozzetti. In genere, 9-11 pulsanti o espianti possono essere raccolto da ogni occhio.

3. coltura delle cellule epiteliali (RPE) del pigmento retinico sulla membrana di Bruch umano espianti

  1. Al ricevimento degli occhi dei donatori, pulire il tessuto extraoculare con DPBS. Praticare un'incisione circonferenza 5 mm sotto l'iride-sclera tocco punto (pars plana) nello spazio subretinal. Scartare il segmento anteriore, vitreo e retina.
  2. Lavare l'oculare, che contiene la membrana di Bruch e foglio di RPE, con DPBS freddo. Dissociare le cellule RPE con 5 mL di tripsina 0,25% per non più di 10 min per ciascun campione di occhio. Placare la reazione di tripsina con 25 mL di terreno completo DMEM con 15% siero bovino fetale (FBS) riscaldato a 37 ° C in un tubo da 50 mL.
  3. Centrifugare le cellule a 200 × g per 10 min a 24 ° C e risospendere il pellet in 5 mL di terreno completo DMEM (con 15% FBS).
  4. Contare le celle e 15.000 cellule RPE vitali sulla lamina basale di espianti di ogni Bruch invecchiato vari membrana (pulsanti) in una piastra a 96 pozzetti in 200 µ l di media senza siero minimo essenziale (MEM) contenenti antibiotici di seme (100 IU/mL di penicillina G, 100 mg / mL di streptomicina, gentamicina 5 mg/mL e 2,5 mg/mL anfotericina B). Supponendo un diametro delle cellule di 20 µm, placcatura a questa densità vi permetterà di cellule RPE coprire circa il 15% della zona di placcatura.
  5. Piastra le cellule sul pulsante, per cui la densità delle cellule può quindi essere aumentata gradualmente fino a confluenza di 100% a seconda dell'effetto di ogni parametro sul comportamento delle cellule.
  6. Permettono alle cellule di fissare per l'espianto per 24 h in atmosfera umidificata di 95% air/5% CO2 a 37 ° C. Delicatamente sostituire il terreno con DMEM completo caldo.

Risultati

Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, si possono determinare gli effetti della membrana di Bruch umano invecchiato e/o malati sulla funzione delle cellule RPE dalla definizione di polarità e la barriera della retina esterna sangue, secrezione polarizzata di fattori di crescita e citochine, e la fagocitosi dei segmenti esterni del fotoricettore della barretta.

Abbiamo generato i dati che dimostrano un fenotipo di malattia sulla membrana di Bruch umano invecchiato. Ad esempio, coltura delle cellule RPE su invecchiato membrana espianti diminuzioni RPE cella il reattachment di Bruch umano (Figura 3). Cellule RPE coltivate su membrana di Bruch umano invecchiato diminuisce la capacità di queste cellule di phagocytize segmenti esterni della barretta (ROS), una funzione critica di RPE (Figura 4). Inoltre, cellule apoptotiche possono essere identificate e confrontate su questi espianti di pulsante utilizzando un terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick d'etichettatura (TUNEL) macchia come descritto nel precedente lavoro26. Gli effetti di un invecchiato e/o malato umano la membrana di Bruch, il profilo di espressione genica delle cellule RPE possono essere determinati mediante tecnologia microarray. Abbiamo dimostrato che l'espressione genica delle cellule RPE è alterato quando coltivate sulla membrana di Bruch umana da individui più anziani rispetto a espianti da più giovani individui (Figura 5)27. Per l'analisi statistica, espianti di donatori umani almeno 3-5 sono utilizzati per ogni gruppo.

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Figura 1. Rappresentazione schematica della separazione della membrana di Bruch umana dagli occhi di donatore. Membrana di Bruch umano si raccolgono rimuovendo la sclera, segmento anteriore, retina, vitreo ed epiteliale (RPE) cellule del pigmento retinico nativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Isolato la membrana di Bruch umano (BM) in una piastra di coltura. (A) schema degli espianti di membrana di Bruch umano (ogni 1,5 pollici di diametro, con gel di agarosio solidificato) collocati in un 60 × 15 mm polistirolo cella cultura piatto (BM scoperte) riempito con liquido caldo agarosio sul fondo del piatto. Espianto di membrana di Bruch un umano (B) che è stato trephined in pochi pulsanti circolari a 6 mm (espianti), ogni portata che veniva riposto su agarosio al 4% a 37 ° C in un polistirolo non trattata bene di una piastra a 96 pozzetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Cellula epiteliale del pigmento retinico (RPE) Tasso di riattacco sulla membrana di Bruch umano giovani e meno giovani (BM). Cellule RPE primarie sono state seminate su umani della membrana di Bruch espianti da giovani (< 50-year-old, n = 3) o più anziani (> 70 anni, n = 5) occhi donatore per tre settimane. Tasso di attacco delle cellule è stata misurata dall'analisi di attuabilità delle cellule MTT. Membrana di Bruch umano più vecchio ridotto il tasso di attacco delle cellule RPE di 24% (giovane BM 100 + 8,54 S.E. vs vecchi BM 76,65 + /-1,44 S.E.). p < 0,05, S.E. = errore standard.

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Figura 4. Fagocitosi di cella (RPE) epiteliale del pigmento retinico sono influenzata dall'età della membrana di Bruch umano (BM). Cellule primarie di RPE coltivate su umani più anziani della membrana di Bruch espianti avevano una ridotta capacità di phagocytize segmenti esterni della barretta (ROS) (giovane BM 873 + /-9.3 S.E., n = 5 vs vecchi BM 608 + /-25.4 S.E., n = 5). p < 0.01, S.E. = errore standard.

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Figura 5. Numero di retinico del pigmento epiteliali geni di cellule (RPE) espressi in ogni campione coltivate su young o membrana di Bruch umano più vecchio espianti. Non c'era più dispersione nel numero di geni espressi in cellule primarie di RPE seminate su vecchi contro la membrana di Bruch umano più giovane (6201 ± 388 vs 6439 ± 80, rispettivamente); cinque espianti sono stati testati per ogni gruppo di età. Ha presentato con l'autorizzazione completa di tutti gli autori del Cai, H et al. 27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Membrana di Bruch umano invecchiato (matrice extracellulare) contribuisce alla progressione della malattia di AMD e così c'è una necessità di capire come questa matrice alterata contribuisce alla disfunzione delle cellule RPE. Data la mancanza di sufficienti modelli animali per studiare i cambiamenti relativi all'età in AMD, ex vivo sistemi modello che imitano gli effetti della malattia possono servire come uno strumento prezioso per capire la patofisiologia. La metodologia descritta in questo manoscritto può essere utilizzata per isolare costantemente umano espianti di membrana di Bruch e cultura RPE cellule, tra cui linee di cellule RPE primarie, immortalate o derivati da cellule staminali.

Come accennato in precedenza, espianti di membrana di Bruch umano provengono dal NDRI. Un protocollo è stabilito con NDRI che specifica i criteri stabiliti per gli occhi del donatore essere accettabile. Ad esempio, i donatori non devono avere nessun malattie conosciute della retina degli occhi, occhi/globi vengono recuperati all'interno di 10 h dopo la morte e globi arrivano in laboratorio entro 48 h dopo la morte (tramite consegna pacchetto durante la notte sul ghiaccio). Specificare la fascia di età appropriata e il numero di occhi necessari per l'analisi statistica dello studio, ad es., cinque paia di globi da donatori fra le età di 20-49 anni e cinque paia di globo da donatori di età compresa tra i 50-89 anni.

La disponibilità dei globi occhio varia, generalmente una media di dieci paia di globi disponibili ogni mese. Il pacchetto di occhio arriva con informazioni di base, de-identificato donatore: età, razza, tempo di morte, causa di morte e breve anamnesi passata (profilo di malattia o comorbidità).

La cosa più importante, raccolta espianti di membrana di Bruch umana richiede la rimozione del segmento anteriore dell'occhio e vitreo, permettendo per l'isolamento del complesso coroide membrana di Bruch RPE. Una volta isolata la membrana di Bruch, cellule RPE possono essere seminate sugli espianti acellulare alle concentrazioni variabili e coltivate per esperimenti a valle. La preparazione e la manipolazione procedurali come descritto nel presente documento è critica, prestando attenzione all'orientamento della membrana di Bruch isolato per assicurarsi che la superficie laminare è rivolto-up pur non toccando la superficie meccanicamente per evitare di danneggiare il struttura di superficie della matrice extracellulare.

Si deve anche osservare che quando si utilizzano sistemi di espianto della membrana di Bruch, ci sono alcune variabili che potrebbero influenzare i risultati di esperimenti a valle come sfondo genomica dei donatori individuali, età della membrana di Bruch, o tempo post mortem di Bruch membrana e la posizione della membrana di Bruch, vale a dire., centrale o periferico parte degli espianti di membrana di Bruch. Come con qualsiasi altro studio di tessuti umani, uno deve reclutare il numero di esempio appropriato donatore occhio per avere la necessaria potenza statistica e abbinare età dell'occhio donatore se appropriato. Stabilire criteri rigorosi per l'accettazione di occhi da banche degli occhi è un parametro critico. Accettano solo gli occhi che sono enucleated meno di 10 h post mortem e che preparazione della membrana di Bruch possa essere raccolte entro 24-48 h dopo la morte. Il sito del nervo ottico può essere utilizzato come un indicatore per l'orientamento e utilizzare le stesse posizioni per sperimentale e di controllo di gruppi di studio. Attraverso queste misure, uno può ridurre al minimo la variabilità sperimentale.

In sintesi, comprensione del complesso coroide membrana di Bruch RPE e come essa è influenzata dall'età e la malattia è fondamentale per comprendere il suo contributo alla patofisiologia di AMD. Sistemi di modello che impiegano tecniche di ex vivo sono uno strumento prezioso per studiare questi effetti utilizzando tessuto umano. Qui, descriviamo una metodologia che si avvale di espianti di donatore umano come un modello di rilevanti ex vivo della membrana di Bruch invecchiato. Questa tecnica permette di utilizzare la membrana di Bruch umano invecchiato e/o malato come uno strumento di ricerca per studiare come i mutamenti strutturali all'interno della matrice può influenzare sovrapponendo RPE comportamento cellulare compreso di espressione genica, la proliferazione e allegato25 , 27. lo sviluppo di sistemi simili ex vivo modello sarà avanzare la nostra comprensione di AMD e facilitare lo sviluppo di nuove opzioni terapeutiche.

Dichiarazioni

Nessuno degli autori hanno qualsiasi divulgazione commerciale di dichiarare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è supportata dalla ricerca per prevenire la cecità, New York, www.rpbusa.org e il maggiore centro di New York per retinica degenerativa malattia Foundation Fighting cecità, www.blindness.org. Gli autori vorrei ringraziare Luanna Bartholomew, pH.d., per la sua revisione critica di questo manoscritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Globi donatori umani NationalDisease Research Interchange, NDRI
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995-065
Carbon-dioxide independent mediaThermo Fisher Scientific18045-088
Piastra di Petri in polistirene da 60 mmCorning Inc.
soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, PBSThermo Fisher Scientific14190144
Hydrophobic 65 & micro; membrana in politetrafluoroetilene di spessore m con 0,2 µ m poriMerck MilliporeJGWP04700
Fisherbrand sistema di supporto per filtro sottovuoto per microanalisi in vetro Thermo Fisher Scientific09-753-102
AgarosioSigma-AldrichA2576-5G
35 & 10mm piastra di colturaVWR International25373-041
TrephineAccutomeAM0570 60
96 pozzettipiastra Corning Inc.3595
Supporti minimi essenziali (MEM) Thermo Fisher Scientific11095-080 
Penicillina GSigma-AldrichP3032-1MU
StreptomicinaSigma-AldrichS6501
GentamicinaSigma-AldrichG1914
Amfotericina BSigma-Aldrich1397-89-3
Soluzione di idrossido di ammonioSigma-Aldrich1336-21-6
 
351007

Riferimenti

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