Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.
Articolo metodologico
Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.
Identificazione di ligandi naturali dei chemocettori e studi strutturali mirati a delucidazione delle basi molecolari della specificità ligando può essere notevolmente facilitata mediante la produzione di quantità di milligrammo di domini di legame del ligando puro, piegato. Tentativi di heterologously express domini di legame del ligando periplasmico di chemocettori batteriche in Escherichia coli (Escherichia coli) spesso provocare mirati nei corpi di inclusione. Qui, un metodo è presentato per recupero di proteina da corpi di inclusione, suo ripiegamento e purificazione, utilizzando il dominio di legame del ligando dCACHE periplasmico di jejuni del campilobatterio (c. jejuni) del chemocettore Tlp3 come esempio. L'approccio implica espressione della proteina di interesse con un spaccabili sua6-tag, isolamento e urea-mediata solubilizzazione dei corpi di inclusione, proteina ripiegamento di esaurimento dell'urea e la purificazione mediante cromatografia di affinità seguita da cromatografia di rimozione e di esclusione dimensionale di tag. La spettroscopia di dicroismo circolare viene utilizzata per confermare il ripiegamento della proteina pura. È stato dimostrato che questo protocollo è in genere utile per la produzione di quantità di milligrammo di domini di legame ligando periplasmico dCACHE di altri chemocettori batteriche in forma solubile e cristallizzabili.
Chemiotassi e motilità hanno dimostrati di svolgere i ruoli importanti nella patogenesi di jejuni del campilobatterio promuovendo la colonizzazione batterica e l'invasione dei host1,2,3. Chemiotassi permette ai batteri di muoversi verso un ambiente ottimale per la crescita, come guidati da segnali chimici. Questo processo prevede il riconoscimento dei segnali chimici intracellulari ed ambientale da un insieme di proteine chiamati chemocettori, o simil-trasduttore (TLP). Maggior parte dei chemocettori sono proteine di membrana incorporato con un extracitoplasmatico li....
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1. espressione dei suoi6-Tlp3-LBD in e. coli
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L'espressione ricombinante di suo6-Tlp3-LBD dentro e. coli ha provocato la deposizione di proteine in corpi di inclusione. La resa di espressione da 1 L di coltura batterica calcolata al punto 2.13 era circa 100 mg di sua6-Tlp3-LBD depositato in corpi di inclusione. La procedura di isolamento di proteine, qui descritta e illustrata in Figura 1, è costituito dalla solubilizzazione dei corpi di inclusione, il ripiegamento proteico.......
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Una procedura semplice per espressione e ripiegamento dai corpi di inclusione di LBD periplasmico della chemoreceptor batterica Tlp3 è presentata. Preparazione della proteina pura coinvolge sovra-espressione del gene codificato con animali-plasmide in Escherichia coli, la purificazione e la solubilizzazione dei corpi di inclusione, di ripiegamento della proteina denaturata e sua purificazione di affinità consecutivi e passaggi di cromatografia di esclusione dimensionale. La denaturazione dell'urea-facilitato e d.......
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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamo Yu C. Liu per i suoi primi lavori sulla produzione Tlp3-LBD. Mayra A. Machuca è in debito con Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS per una borsa di dottorato.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillina | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropil β-D-tiogalattoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | ||
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Ditiotreitolo | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginina monocloridrato | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| L-glutatione ridotto | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| L-glutatione ossidato | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico disidratato (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazolo | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glicerolo | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | ||
| Cloruro di nichel (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glicina | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Scala proteica non colorata, ampia Gamma (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Concentratore centrifugo Amicon Ultracel (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| Provetta Falcon da 50 mL Tubo | |||
| Tubo per dialisi | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialisi | |
| pelle di serpente | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Colonna HP chelante HiTrap preconfezionata | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| Omogeneizzatore ad alta pressione EmulsiFlex-C5 | AVESTIN | EmulsiFlex™ - Pompa | |
| P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Colonna Superdex 200 HiLoad 26/60 ad esclusione dimensionale | |||
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