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Articolo metodologico

Isolamento di cellule dendritiche dal tratto riproduttivo femminile umano per studi fenotipici e funzionali

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DOI:

10.3791/57100

⸱

13 marzo 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth

In questo articolo

Sommario

Descriviamo qui un metodo per isolare e purificare le cellule dendritiche da diversi compartimenti anatomici nel tratto riproduttivo femminile umano per la valutazione delle loro caratteristiche fenotipiche e funzionali. Questo metodo può essere adattato per isolare altre cellule immuni o cellule dendritiche da altri tessuti mucosi.

Abstract

La caratterizzazione di umane cellule dendritiche (DCs) residente in tessuti mucosi è impegnativa a causa della difficoltà nell'ottenere i campioni, e i numeri bassi dei controller di dominio presentano al tessuto. Eppure, come il fenotipo e la funzione di controller di dominio viene modificato dall'ambiente del tessuto, è necessario analizzare le popolazioni residenti di DC del tessuto, poiché sangue derivati DCs in modo incompleto riflettere la complessità del DCs nei tessuti. Qui presentiamo un protocollo per isolare DCs da umano tratto riproduttivo femminile (FRT) utilizzando esemplari di isterectomia che permette analisi sia fenotipiche e funzionali. Il protocollo è costituito da digestione del tessuto per generare una singola cellula miscelati sospensione cellulare, seguita da una selezione positiva biglie magnetiche. Il nostro protocollo di digestione del tessuto non fendere gli indicatori di superficie, che permette l'analisi fenotipica e funzionale di DCs in regime stazionario, senza attivazione di incubazione o cella durante la notte. Questo protocollo può essere adattato per l'isolamento di altri tipi di cellule immunitarie o di DCs da altri tessuti.

Introduzione

La FRT ha la duplice funzione di protezione contro gli agenti patogeni consentendo l'impianto e la gravidanza1. A tale scopo, è suddiviso in compartimenti la FRT, con ogni regione anatomica visualizzati uniche caratteristiche istologiche, immunologiche e funzionale1.

Controller di dominio presenti alle superfici mucose prendere contatto con i microbi nel polmone, intestino e del tratto genitale e fornire sorveglianza immune per potenziali agenti patogeni2. Controller di dominio hanno la capacità unica di adescare ingenuo T-cellule e innescare risposte immunitarie3. Controller di dominio nella FRT sono specializzati anche per tollerare antigeni estranei, come quelli trovati in sperma e lo sviluppo del feto, per consentire la riuscita gravidanza4. Pertanto, a seconda della posizione, la DC fenotipo e la funzione sarà distinti. È noto che DCs sono fortemente influenzati dall'ambiente di tessuto, tale che il loro numero, il fenotipo e la funzionalità vengono modificate dall'ambiente del tessuto in cui risiedono3. Pertanto, per comprendere il ruolo nelle malattie infettive, gravidanza e cancro nella FRT FRT DCs, DCs residenti devono essere studiati, dal sangue e modelli derivati DC sono insufficienti ad affrontare le complessità normative trovate nei tessuti FRT.

La caratterizzazione di tessuti umani residenti DCs è impegnativo a causa del basso numero di cellule presenti nei tessuti mucosi e la difficoltà di ottenere campioni di tessuto umano. Controller di dominio sono stati studiati in FRT usando immunohistochemistry5,6, che informa circa la posizione di cella all'interno del tessuto, ma esclude gli studi funzionali e viene limitato il numero di identificazione di marcatori di cellule che possono essere analizzati in una sola volta. Inoltre, i protocolli di isolamento di singola cellula per l'analisi cytometric di flusso sono stati sviluppati7,8,9. Alcuni di questi protocolli approfitta della capacità migratoria del DCs per isolare quelle cellule che migrano. Questi metodi solitamente richiedono incubazioni overnight e selezione di DC attivate, ma non consentono per lo studio dei controller di dominio nello stato di stabilità.

Qui, utilizzando esemplari di isterectomia, abbiamo ottimizzato un protocollo per isolare DCs da diverse sedi anatomiche in FRT, l'endometrio (EM), l'endocervice (CX) e l'esocervice (ECX), che consente analisi sia fenotipiche e funzionali. Utilizza un protocollo non proteolitico digestione enzimatica, possiamo procedere immediatamente dopo la digestione del tessuto alla caratterizzazione di cella isolamento e flusso cytometric senza l'attivazione delle cellule. Mediante citometria a flusso multicolor e adattando gli studi funzionali per un basso numero di cellule, possiamo identificare e caratterizzare rare sottoinsiemi di controller di dominio in diversi siti della FRT

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Protocollo

Secondo i principi espressi nella dichiarazione di Helsinki sono stati condotti studi che coinvolgono soggetti umani. Gli studi sono stati approvati da Dartmouth College Institutional Review Board e il Comitato per la protezione di soggetti umani (CPHS). Consenso informato è stato ottenuto prima dell'intervento chirurgico da HIV-negativi donne sottoposte a isterectomia a Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Lebanon, NH). I patologi addestrati selezionati campioni di tessuto dal EM, CX ed ECX, privo di lesioni anatomo-patologiche e distante dai siti della patologia. I campioni di sangue sono stati ottenuti da donatori sani volontari reclutati al Dartmouth Hitchcock Medical Center. Donatori di sangue erano anonimi. Tessuti di EM, CX ed ECX recente isolati dalla sala operatoria sono stati trasferiti alla patologia per isolamento e classificazione preliminare per il trasferimento al nostro laboratorio in provette di polipropilene separati, sterile.

1. enzimatica digestione dei tessuti

Nota: Utilizzare materiali sterili e lavorare in una cappa di sicurezza biologica.

  1. Preparare un modificate di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) utilizzando 1 x HBSS con rosso fenolo, 100 U/mL penicillina-streptomicina, 0,35 g/L NaHCO3e 20 mM HEPES.
  2. Preparare il cocktail enzimatico (modificato desossiribonucleasi 0,01% [wt/vol] HBSS, 450 U/mL collagenasi IV, io e 2 mg/mL D-glucosio). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm sterile. Idealmente, preparare l'enzima della digestione il giorno di utilizzo, ma può essere congelato a-20 ° C per la conservazione. Evitare ripetuti di congelamento e scongelamento cicli.
  3. Sciacquare il tessuto con HBSS modificate e posto in una capsula di Petri2 100 x 15 mm. Regolare la dimensione di Petri dipende dalla quantità di tessuto disponibile e il volume di cocktail di enzimi utilizzati (Vedi punto 1.4.2 qui sotto).
    Nota: Tessuti variano nelle dimensioni a seconda del campione chirurgico ottenuto dalla patologia, che vanno da 1-10 g.
  4. Elaborazione fisica con bisturi monouso e pinze:
    1. Aggiungere circa 3 mL di cocktail di enzimi di digestione al tessuto per evitare l'essiccazione durante il taglio.
    2. Utilizzare pinze per stabilizzare il tessuto e tritateli con un bisturi per aumentare la superficie del tessuto esposto per il cocktail di enzimi di digestione. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi (< 2 mm su un lato). Aggiungere sufficiente digestione enzimatica cocktail per coprire tutti i pezzi di tessuto (5 mL/g di tessuto). Posizionare il coperchio sul piatto Petri.
    3. Incubare a 37 ° C con 5% CO2 in un rotatore a circa 80 rpm per 45 min. Accertarsi che la velocità di rotatore mescola accuratamente il cocktail di enzimi di digestione senza fuoriuscite o produrre bolle.
    4. Visualizzare la preparazione del tessuto con un microscopio ottico invertito da 4 X e 10 X gli obiettivi.
      Nota: Dopo la digestione, piccoli frammenti di tessuto e una sospensione di cellule miste tra cui ghiandole epiteliali visibile deve essere presente (Vedi Figura 1A).

2. fisica separazione delle singole cellule

  1. In un ambiente sterile, posizionare una mesh teso 250 µm con titolare in una capsula di Petri2 150 x 15 mm. Garantire che la maglia è di circa 0,5 cm sopra la superficie del piatto Petri.
  2. Inumidire la rete con 2 mL di HBSS modificate e trasferire il tessuto digerito sulla maglia.
  3. Utilizzando la superficie piana di un pistone della siringa 10 mL, delicatamente ma con fermezza, macinare il tessuto macinato digerito attraverso la maglia.
    Attenzione: Rettifica troppo aggressivamente danneggerà la mesh e aumentare la mortalità delle cellule. Questo passaggio si separerà le cellule epiteliali e stromali (tra cui le cellule immunitarie) dal tessuto connettivo e muco.
  4. Una volta i frammenti di tessuto sono state accuratamente disperse, elevare la mesh e titolare del 2-3 centimetri sopra la piastra di Petri e risciacquare con 3 mL di per volta HBSS per recuperare altre celle.
  5. Raccogliere la sospensione cellulare. Posizionare la maglia di 20 µm con titolare in una capsula di Petri e bagnarlo con 2 mL di HBSS modificate. Versare la sospensione cellulare attraverso la maglia che tiene la maglia 2-3 cm sopra la piastra di Petri e sciacquare con 6 mL di HBSS modificate.
    Nota: Questo passaggio si separerà i fogli epiteliali, che vengono mantenuti in alto a sinistra, da singole cellule che passano attraverso la rete. Il flusso continuo è una sospensione di cellule miste, che comprende le cellule immuni e fibroblasti stromal.
  6. Raccogliere la sospensione cellulare mista e centrifugare a 500 x g per 10 min. aspirato il liquido e risospendere il pellet in 4 mL di HBSS modificate per centrifugazione in gradiente di densità.
  7. Strato la sospensione di cellule miste oltre 3 mL di soluzione di polysucrose e centrifuga a temperatura ambiente a 500 x g per 30 min con nessun freno. Raccogliere la fascia bianca dalla parte superiore della soluzione polysucrose e lavare con PBS.
    Nota: Questa frazione è la sospensione di cellule miste arricchito, che è ricco di cellule immunitarie e contiene alcuni fibroblasti stromal.

3. guasto delle cellule rimozione

Nota: Se una grande percentuale di cellule morte (> 20%) è presente in una sospensione cellulare mista arricchita dopo centrifugazione in gradiente di densità, rimozione di cellule morte con biglie magnetiche è raccomandato. Le cellule morte devono essere rimossi poiché potrebbero interferire con il processo di selezione positiva biglie magnetiche.

  1. Contare le celle utilizzando un emocitometro su un microscopio ottico con l'obiettivo 10x. Rotazione verso il basso tutte le celle nella sospensione delle cellule miste arricchito (500 x g, 10 min, 4 ° C). Completamente aspirare e scartare il surnatante. Aggiungere 100 µ l di cellule morte rimozione perline per 1 x 107 cellule totali (vivi e morte), secondo le istruzioni del produttore. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  2. Posizionare un filtro 30 µm sulla colonna magnetica, applicare la sospensione cellulare e permettono alle cellule di tallone-etichettato di cadere attraverso la colonna magnetica.
  3. Lavare la colonna con buffer di rimozione di cellule morte come consigliato (3 mL). Raccogliere il flusso continuo contenente cellule vive. L'intervallo di recupero delle cellule dopo la rimozione di cellule morte è presentato in Figura 1B.
    Nota: Queste cellule consente di eseguire il flusso cytometry macchiatura per studi fenotipici (sezione 5) o continuare con isolamento DC (sezione 4).

4. DC purificazione da selezione positiva biglie magnetiche

  1. Dopo la rimozione di cellule morte (punto 3.2), le cellule si sono fermati, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 80 µ l di tampone di selezione magnetica per 1 x 107 cellule (PBS, 0,5% inattivati AB siero umano (HS), 2 mM EDTA).
  2. Per la selezione positiva delle popolazioni di DC, aggiungere CD1a o CD14 biglie magnetiche secondo le istruzioni del produttore (20 biglie magnetiche µ l per 1 x 107 cellule). Incubare per 15 min a 4° C.
  3. Lavare le cellule con il buffer di selezione magnetica, rotazione verso il basso e rimuovere completamente il tampone. Risospendere le cellule in un minimo di 500 µ l di buffer di selezione magnetica.
  4. Fissare la colonna alla calamita e aggiungere un filtro 30 µm nella parte superiore della colonna di mantenere qualsiasi grumi di cellule rimanenti. Risciacquare il filtro e la colonna con buffer di selezione magnetica come consigliato.
  5. Applicare la sospensione cellulare alla colonna. Lavare 3 volte con buffer di selezione magnetica.
  6. Trasferire la colonna in una provetta 15 mL, aggiungere 5 mL di buffer di selezione magnetica e applicare lo stantuffo per rilasciare le celle selezionate dalla colonna.
  7. Per aumentare la purezza, ripetere i passaggi 4.4-4.6 con le cellule recuperate utilizzando una nuova colonna. L'intervallo di recupero delle cellule dopo la selezione di biglie magnetiche è presentato in Figura 1.

5. valutazione della purezza delle cellule: citometria a flusso e microscopia

  1. Anticorpo che macchia per citometria a flusso:
    1. Risospendere fino a 1 x 106 cellule in 100 µ l di PBS contenente 20% calore-inattivati HS per bloccare i recettori Fc e incubare per 10 minuti in ghiaccio.
    2. Aggiungere il desiderato con l'etichetta fluorescente anticorpi e il reagente per l'identificazione di cellule morte (per un esempio, vedere sezione 6.5). Impostare fluorescenza meno uno (FMO) controlli per stabilire i cancelli e utilizzare perle di compensazione per preparare singola macchia controlli per compensazione. Esempi di anticorpi utilizzati sono riportati nella tabella 1. Incubare per 20 min a 4 ° C, al riparo dalla luce.
    3. Lavare le cellule con 2 mL di buffer di selezione magnetica.
      Nota: La presenza di EDTA è importante per evitare la formazione di grumi per analisi cytometric di flusso delle cellule. Rotazione verso il basso e scartare il surnatante.
    4. Fissare le cellule aggiungendo 100 µ l di soluzione di paraformaldeide del 2% per ogni provetta.
    5. Analizzare i campioni in un cytometer di flusso10,11.
  2. Spin la colonna (ad esempio, cytospin) e usano Giemsa colorazione per analizzare la morfologia:
    1. Risospendere le cellule in 200 µ l di buffer di selezione magnetica.
    2. Caricare in una colonna di spin e spin per 5 min. Lasciare asciugare completamente la diapositiva.
    3. Difficoltà la diapositiva mediante immersione in 100% di metanolo per 2 min. Sciacquare il vetrino con acqua deionizzata e lasciare asciugare all'aria.
    4. Eseguire una colorazione di Wright-Giemsa standard. Coprire le cellule con eosina e incubare per 10 minuti, risciacquare con acqua deionizzata e lasciarlo asciugare. Coprire le cellule con la macchia di Wrights-Geimsa, incubare per 1 min, sciacquare con acqua deionizzata e asciugare all'aria.
    5. Esaminare i preparativi con un microscopio invertito (Figura 2A, obiettivo 40x).

6. test di stimolazione allogenica per valutare la funzione delle cellule DC

  1. Scongelare le cellule mononucleari di sangue periferico congelato (PBMCs)
    1. Scaldare i terreni di coltura delle cellule con 10% HS a 37 ° C.
    2. Scongelare i PBMCs posizionando lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA in bagnomaria a 37 ° C, fino a quando una piccola quantità di media delle cellule congelate rimane nello stoccaggio provette criogenia. In un ambiente sterile, trasferire il contenuto dello stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA a 10 mL di terreni di coltura delle cellule pre-riscaldato con 10% HS in un tubo di 15mL.
    3. Centrifugare a ~ 500 x g per 7 minuti rimuovere il supporto, disperdere il pellet, risospendere il PBMCs in 10 mL di terreni di coltura delle cellule con 10% HS e centrifugare le cellule.
    4. Ripetere la fase di lavaggio per la terza volta. Contare le celle.
  2. Selezione della T-cellula di Naïve:
    1. Utilizzare un kit di selezione selezione negativa delle cellule anticorpo magnetico per isolare le cellule T naive secondo il protocollo del produttore.
    2. Dopo l'isolamento, verificare la purezza utilizzando anticorpi CD45RA e CCR7.
      Nota: Purezza tipica è > 99% ingenuo T-cellule.
  3. Naïve T-cellula proliferazione colorante colorazione:
    1. Preparare 600 µ l di soluzione di 2 x di tintura di proliferazione delle cellule, proteggendo la tintura dall'esposizione alla luce.
    2. Lavare l'ingenuo T-cellule 2 x con PBS. Risospendere le cellule in 500 µ l PBS.
    3. Mentre delicatamente nel Vortex le cellule nella cappa di biosicurezza, aggiungere 500 µ l di colorante di proliferazione per l'ingenuo T-cellule.
    4. Incubare le cellule per 10 min a 37° C.
    5. Interrompere l'etichettatura cella aggiungendo 5 mL di terreno di coltura delle cellule con 10% HS alle cellule. Incubare in ghiaccio per 5 min, al riparo dalla luce.
    6. Centrifugare le cellule a ~ 500 x g per 7 min, aspirare i media e risospendere le cellule in 4 ° C di terreni di coltura delle cellule con 10% HS. Ripetere altre due volte per un totale di 3 lavaggi. Prendere un'aliquota di celle da contare prima l'ultima centrifugazione.
      Nota: In genere, ingenuo finale numeri di T-cellula sarà compreso tra 5% e 15% del conteggio delle cellule PBMC iniziale.
    7. Risospendere le cellule con i terreni di coltura delle cellule con 10% HS alla concentrazione cella desiderata.
  4. DC-allogenico ingenuo cellula T co-cultura:
    1. Piastra l'isolato DCs e ingenuo T-cellule in una piastra 96 pozzetti, fondo tondo, presso un 01:15 rapporto di DCs alle cellule T. Assicurarsi che il numero ottimale per DCs è compresa tra 3.000 e 5.000 cellule per pozzetto.
    2. Centrifugare la piastra a ~ 500 x g per 3 min affinché le cellule si trovano al centro del pozzo. Contatto cellula--cellula è importante per la segnalazione adeguata a verificarsi.
    3. Incubare a 37 ° C per 6 giorni. Monitorare il cluster di cellule, che appaiono nei pozzetti come proliferazione si verifica, con microscopia (Figura 3A).
  5. Il flusso cytometry per valutare la proliferazione di colorazione:
    1. Dopo 6 giorni, le cellule possono essere esaminate tramite flusso cytometry. Macchia la co-cultura per citometria a flusso.
    2. Preparare una soluzione di 2 x di colorante giallo vitalità (massima emissione 572 nm) in PBS.
      Nota: L'uso di PBS senza siero è importante, come siero proteine interferiscano con la tintura).
    3. Centrifugare la piastra con le cellule a ~ 500 x g per 5 min.
    4. Rimuovere 100 µ l del surnatante.
      Nota: A questo punto raccogliamo e memorizziamo il surnatante per analisi separata di fattori solubili.
    5. Lavare le cellule due volte con PBS: aggiungere 150 µ l/pozzetto di PBS, centrifugare a ~ 500 x g per 5 minuti, rimuovere 150 µ l del surnatante con una pipetta. Assicurarsi che vi sia 50 µ l di supernatante restanti in ciascun pozzetto.
    6. Aggiungere 50 µ l di colorante di attuabilità x 2 in ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 10 min, al riparo dalla luce.
    7. Durante l'incubazione, preparare un master di marcatori di anticorpo desiderato. Ad esempio: CD3 APC/Cy7, PE di CD4, CD8 FITC, ecc.
    8. Aggiungere la miscela di anticorpi ad ogni pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 10 min, al riparo dalla luce.
    9. Lavare le cellule 2 x con PBS + 2% HS: aggiungere 150 µ l/pozzetto di PBS + 2% HS. Centrifugare a ~ 500 x g per 5 min. rimuovere 150 µ l del surnatante con una pipetta.
    10. Fissare le cellule con l'aggiunta di 100 µ l/pozzetto di 2% para-formaldeide. Se necessario: trasferire le cellule e supporti per tubi di cytometry di flusso in polipropilene. Tubi possono essere conservati a 4 ° C e protetto dalla luce, fino a quando l'analisi cytometric di flusso.
    11. Tubi di lettura in un citometro a flusso.

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Risultati

Seguente digestione del tessuto, il rilascio di strati epiteliali e ghiandole può essere osservata, come mostrato in Figura 1A; si tratta di un controllo positivo che indica che la digestione enzimatica è stata completata. Il numero di cellule vitali totale e DCs recuperato per grammo di tessuto è anche mostrato in Figura 1B e Figura 1, rispettivamente. Cellule del sistema immunitario rappresentano t...

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Discussione

DCs mucoso sono una popolazione di cellule rare fortemente influenzata dall'ambiente del tessuto, che cambia il loro fenotipo e la funzione una volta entrati i tessuti3. Mentre il sangue derivate DCs sono un modello molto utile, non rappresentano pienamente la diversità delle popolazioni DC trovati nei tessuti. Pertanto, per capire le caratteristiche uniche del DCs mucoso, isolamento di cellule primarie da tessuti è necessario. Isolamento di DCs da diverse sedi anatomiche nella FRT offre l'opportu...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Ringraziamenti

I borse di studio supportato da NIH AI102838 e AI117739 (CRW). Si ringrazia Richard Rossoll per assistenza tecnica. L'analisi cytometric di flusso è stato effettuato in DartLab, la risorsa condivisa alle Dartmouthsupported di (P30CA023108-37) e (P30GM103415-15).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)CloneSH30015.03
Penicillina-streptomicinaCloneSV30010
HEPES (1M)Clone15630-080
Collagenasi IVSigmaC5138
Desossiribonucleasi IWorthington BiochemicalLS002140
D-glucosioFiltro Sigma Aldritch50-99-7
0,22 um Stericup 500 mL MilliporeSCGPU05RE
piastra di Petri in polistirene 100 mm x 15 mmFisherbrandFB0875712
piastra di Petri in polistirene 150 mm x 15 mmFisherbrandFB0875714
piastra in polistirene 150 mm x 25 mmCorning430599Piastra
Incubatore IsotempFisher ScientificFICO3500TABB5,0% CO2
American Rotator VAmerican DADER4140
250 um rete di nylonSefar03-250/50
20 um rete di nylonSefar03-20/14
Beckman GS-6R CentrifugaBeckman358702
X-VIVO 15 con Gentamicina L-Gln, rosso fenolo, 1 LLonza04-418Q
Human AB SerumValley BiomedicalHP1022
Histopaque-1077Sigma Aldritch10771
Soluzione tampone fosfato (PBS)National DiagnosticsCL-253pH 7.4
Kit di rimozione delle cellule morteMiltenyi Biotec130-090-101
Filtro di pre-separazione (30um)Colonna Miltenyi Biotec130-041-407
LSMiltenyi Biotec130-042-410
Separatore Quadro MACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS multi-standMiltenyi Biotec130-042-303
EDTAUSB15694
CD1a Microsfere, umanoMiltenyi Biotec130-051-001
Microsfere CD14, umanoMiltenyi Biotec130-050-201
eFluor 670 colorante di proliferazione cellulareeBiosciences65-0840-85
96 pozzetti piastra inferiore rotondaFalcon9/8/2866
Colorante di vitalità giallo zombieBiolegend423104
CD3 APC/Cy7, anti-umanoTonbo Biosciences25-0038-T100
CD4 PE, anti-umanoeBiosciences12-0048-42
CD8a FITC, anti-umanoTonbo Biosciences35-0086-T100
Gallios Citometro a flussoBeckman Coulter Life SciencesB4361810 colori, VBR
MACSquant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-3438 colori, VBR
per colture cellulari trattate

Riferimenti

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