Qui, presentiamo due nuove metodologie, psPACT e MPATTO, per raggiungere la massima trasparenza ottica e la successiva analisi microscopica del sistema vascolare del tessuto nel roditore intatto tutta CNS.
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Articolo metodologico
Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello SNC
In questo articolo
Sommario
Abstract
Poiché lo sviluppo di chiarezza, un bioelectrochemical tecniche di taglio che consente per la mappatura tridimensionale fenotipo all'interno dei tessuti trasparenti, una moltitudine di schiarimento romanzo metodologie tra cui CUBIC (imaging cerebrale chiaro, senza ostacoli cocktail e analisi computazionale), SWITCH (tutto il sistema di controllo del tempo di interazione) e cinetica di sostanze chimiche, mappa (ingrandita analisi del proteoma) e patto (tecnica passiva chiarezza), sono stati istituiti per espandere ulteriormente il toolkit esistente per l'analisi microscopica dei tessuti biologici. Il presente studio mira a migliorare e ottimizzare la procedura di patto originale per una matrice di tessuti roditore intatti, compreso l'intero sistema nervoso centrale (CNS), reni, milza ed embrioni del mouse intero. Denominato psPACT (Patto di processo-separi) e mPACT (Patto modificata), queste nuove tecniche forniscono altamente efficace mezzo di mappatura circuito di cella e la visualizzazione di strutture subcellulari nei tessuti normali e patologici intatti. Nel seguente protocollo, forniamo un contorno dettagliate su come raggiungere la distanza massima del tessuto con l'invasione minima della loro integrità strutturale tramite psPACT e mPACT.
Introduzione
Un obiettivo fondamentale di indagine scientifica e clinica coinvolge il raggiungimento di una completa comprensione della struttura dell'organo e funzione; Tuttavia, la natura estremamente complessa di organi mammiferi spesso funge da barriera per realizzare pienamente questo obiettivo1. CHIAREZZA (chiaro del lipido-scambiati acrilamide-ibridato rigida Imaging-compatibile tessutale-idrogel)2,3,4, che prevede la costruzione di un ibrido di idrogel a base di acrilammide dai tessuti intatti, raggiunge gioco ottico di una varietà di organi, compreso il ce....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico di ricerca appropriato presso Yonsei University College of Medicine. Tutti gli animali sperimentali sono sacrificati in conformità con le linee guida del Comitato di cura degli animali di laboratorio presso Yonsei University College of Medicine.
1. preparazione dei reagenti
Attenzione: Paraformaldeide (PFA), acrilammide e sodio dodecil solfato (SDS) sono irritanti tossici e quindi deve essere maneggiato in una cappa con appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE; camice da laboratorio, guanti, occhiali protettivi).
- soluzione di acril....
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Risultati
Generazione di un modello trasparente dello SNC intero utilizzando tecniche di compensazione passiva ottimizzata
Ottica clearance di topo e ratto tessuti dello SNC interi rapidamente è stata ottenuta utilizzando varie tecniche di compensazione passiva (Figura 1). Un disegno schematico del tessuto di compensazione nel corso del tempo è mostrato nella Figura 2A
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Discussione
Mentre i metodi di estrazione passivo, elettroforesi-impiegato nel patto ha migliorato significativamente la consistenza realizzata con tessuto precedente schiarimento metodi ad esempio chiarezza2,3,4,7 , 8, la tecnica porta ancora varie carenze, la più urgente delle quali è la lunghezza del tempo necessario per raggiungere il tessuto massima chiarezza
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal progetto cervello Corea 21 PLUS per la scienza medica, Università di Yonsei. Inoltre, questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione ricerca nazionale di Corea (NRF-2017R1D1A1B03030315).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sodio Dodecil Solfato (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Soluzione di pulizia |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | soluzione nRIMS |
| 40% soluzione di acrilammide | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polimerizzazione (A4P0) |
| 2,2&acuto;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] Dicloridrato | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polimerizzazione (VA-044) |
| 1-Tioglicerina | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Soluzione di chiarificazione (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | Soluzione nRIMS |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Colorazione |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Bovogen | BSA100 | Eparina immunocolorante |
| Merck Millipore | 375095 | Perfusione (PBS) | |
| Sodio azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | Soluzione nRIMS |
| Anticorpo PECAM-CD31 Santa | Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Colorazione |
| Capra anti-coniglio-IgG Cy3 coniugato fluorescente | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Colorazione |
| 4% Paraformaldeide | Tech & Innovazione | BPP-9004 | Perfusione, Polimerizzazione |
| 20X Soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,4) | Tech & Innovazione | BPB-9121 | Perfusione, tampone |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Trasferimento di soluzione |
| Provetta da 50 mL | Falcon | 352070 | Tubo di compensazione |
| 35 mm Piatto per coltura cellulare | SPL | 20035 | Imaging |
| Piatto confocale | SPL | 211350 | Imaging |
| Siringa da 1 mL | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anestetizzare |
| Siringa da 50 ml | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusione |
| Acrilammide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polimerizzazione (A4P0) |
| Carta Whatman 3MM | Sigma-Aldrich | Z270849 | Carta assorbente per la rimozione del gel |
| Microscopio confocale | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Pompa peristaltica | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Sistema di ibridazione su gel tissutale |
Riferimenti
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (201....
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Ristampe e permessi
