Articolo metodologico

Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello SNC

DOI:

10.3791/57123

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8 maggio 2018

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1Department of Neurosurgery, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3The Spine and Spinal Cord Institute, Biomedical Center, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 4Columbia University College of Physicians and Surgeons

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo due nuove metodologie, psPACT e MPATTO, per raggiungere la massima trasparenza ottica e la successiva analisi microscopica del sistema vascolare del tessuto nel roditore intatto tutta CNS.

Abstract

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Poiché lo sviluppo di chiarezza, un bioelectrochemical tecniche di taglio che consente per la mappatura tridimensionale fenotipo all'interno dei tessuti trasparenti, una moltitudine di schiarimento romanzo metodologie tra cui CUBIC (imaging cerebrale chiaro, senza ostacoli cocktail e analisi computazionale), SWITCH (tutto il sistema di controllo del tempo di interazione) e cinetica di sostanze chimiche, mappa (ingrandita analisi del proteoma) e patto (tecnica passiva chiarezza), sono stati istituiti per espandere ulteriormente il toolkit esistente per l'analisi microscopica dei tessuti biologici. Il presente studio mira a migliorare e ottimizzare la procedura di patto originale per una matrice di tessuti roditore intatti, compreso l'intero sistema nervoso centrale (CNS), reni, milza ed embrioni del mouse intero. Denominato psPACT (Patto di processo-separi) e mPACT (Patto modificata), queste nuove tecniche forniscono altamente efficace mezzo di mappatura circuito di cella e la visualizzazione di strutture subcellulari nei tessuti normali e patologici intatti. Nel seguente protocollo, forniamo un contorno dettagliate su come raggiungere la distanza massima del tessuto con l'invasione minima della loro integrità strutturale tramite psPACT e mPACT.

Introduzione

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Un obiettivo fondamentale di indagine scientifica e clinica coinvolge il raggiungimento di una completa comprensione della struttura dell'organo e funzione; Tuttavia, la natura estremamente complessa di organi mammiferi spesso funge da barriera per realizzare pienamente questo obiettivo1. CHIAREZZA (chiaro del lipido-scambiati acrilamide-ibridato rigida Imaging-compatibile tessutale-idrogel)2,3,4, che prevede la costruzione di un ibrido di idrogel a base di acrilammide dai tessuti intatti, raggiunge gioco ottico di una varietà di organi, compreso il cervello, il fegato e la milza, preservando la loro integrità strutturale5. CHIAREZZA così ha permesso non solo la visualizzazione, ma anche la possibilità di sezionare finemente complesse reti cellulari e morfologie di tessuto senza l'esigenza di sezionamento.

Al fine di ottenere la liquidazione del tessuto, chiarezza impiega i metodi elettroforetici per rimuovere il contenuto lipidico del campione a portata di mano. Mentre la chiarezza è stato notato per la produzione di ibridi fisicamente stabile del tessuto-idrogel, studi hanno dimostrato che l'uso di metodi di schiarimento (ecc) di tessuto elettroforetica produce risultati variabili in termini di qualità dei tessuti, tra cui browning, epitopo danni, e proteina perdita5,6. Per risolvere questi problemi, protocolli modificati come patto (passivo chiarezza tecnica), che sostituisce il trattamento ecc con una tecnica passiva, ionico-detergente delipidizzazione base, sono stati sviluppati7,8,9. Malgrado il raggiungimento di una maggiore coerenza nei risultati, tuttavia, il patto richiede più tempo per ottenere la massima altezza. Inoltre, nessuna di queste tecniche sono ancora stata applicata per l'intero modulo di CNS, o nei modelli più grandi roditori quali ratti e cavie.

Il presente studio cerca di affrontare queste limitazioni, proponendo nuove metodologie, psPACT (Patto di processo-separi) e mPACT (Patto modificata), per facilitare il gioco veloce del SNC intero e organi interni nel topo e ratto modelli10. In particolare, psPACT processi tessuti in 4% di acrilammide e 0,25% VA-044 in due passaggi separati durante la formazione di idrogel; MPATTO essenzialmente coinvolge la stessa procedura, ma integra la soluzione basata su SDS schiarimento con 0,5% α-thioglycerol come reagente chiave. Entrambe le tecniche sfruttano sistemi circolatorio sistemici e cerebrospinali endogeni per ridurre significativamente il tempo necessario per produrre gioco ottico. Come prova di principio, dimostriamo l'uso della microscopia confocale per analizzare modelli di vaso sanguigno nei tessuti sgomberati10.

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Protocollo

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Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico di ricerca appropriato presso Yonsei University College of Medicine. Tutti gli animali sperimentali sono sacrificati in conformità con le linee guida del Comitato di cura degli animali di laboratorio presso Yonsei University College of Medicine.

1. preparazione dei reagenti

Attenzione: Paraformaldeide (PFA), acrilammide e sodio dodecil solfato (SDS) sono irritanti tossici e quindi deve essere maneggiato in una cappa con appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE; camice da laboratorio, guanti, occhiali protettivi).

  1. soluzione di acrilammide (Agosta) 4% (A4P0): aggiungere 20 mL della soluzione di 40% di acrilammide a 180 mL di 0.1 M tampone fosfato salino (PBS).
  2. 0,25% VA-044 soluzione: aggiungere 0,5 g di 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dicloridrato (VA-044) polvere a 200 mL di 0.1 M tampone fosfato salino (PBS). Mentre la polvere VA-044 può essere conservata a temperatura ambiente, esso deve essere conservato a 4 ° C su solubilizzazione in PBS. Per risultati ottimali, è necessario preparare solo la quantità di soluzione necessaria per l'esperimento.
  3. Soluzione cocktail patto: aggiungere 10 g di acrilammide a 225 mL di soluzione al 4% paraformaldeide (PFA) e regolare il volume a 200 mL con 4% PFA. Prima dell'uso, aggiungere 100 mg di polvere di VA-044 a 40 mL della miscela in una provetta conica da 50 mL.
  4. PATTO di cancellazione soluzione buffer: aggiungere 40 g di sodio dodecil solfato (SDS) a 350 mL di PBS 0.1 M e regolare il volume a 500 mL con 0.1 M PBS. Per mPACT deselezionando la soluzione, aggiungere 0,5% α-thioglycerol il patto cancellazione soluzione buffer.
  5. I topi utilizzati in questo studio erano topi maschii di BALB 2-settimana-vecchio; i ratti utilizzati in questo studio erano SD-ratti maschii di 2 settimane di età.

2. anestesia e chirurgia di perfusione

Attenzione: PFA e acrilammide sono irritanti tossici e così deve essere gestite in una cappa aspirante con PPE appropriato.

  1. Anestetizzare l'animale in una stanza senza agente patogeno con 30 mg/kg di zoletil utilizzando una siringa da 1 mL con ago 26-gauge. Monitorare l'animale per 5-10 min.
  2. Una volta che l'animale ha raggiunto un aereo chirurgico di anestesia, è possibile utilizzare il metodo di risposta di punta-pizzico per determinare la profondità dell'anestesia. Confermare l'apatia.
    Nota: La seguente procedura che coinvolge la chirurgia di topo e di ratto seguire un simile protocollo usato in un precedente studio11.
  3. Fare un'incisione di 5-6 cm sotto la gabbia toracica, attraverso il tegumento e la parete addominale.
  4. Usare le forbici curve, smussate per fare un'incisione nel diaframma, palpare la zona toracica per individuare il sito di incisione in anticipo.
  5. Estendere l'incisione su tutta la lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica.
  6. Spostare con cautela i polmoni. Fare un taglio attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola. Utilizzando le forbici iris, praticare una piccola incisione all'estremità posteriore del ventricolo sinistro. Inserire un ago calibro 18 con punta blunt o d'oliva aspersione nell'aorta ascendente, passando attraverso il ventricolo di taglio.
  7. Fissare l'ago ed evitare dispersioni di bloccaggio il cuore con una pinza emostatica. In alternativa, utilizzare una pinza emostatica modificata per bloccare l'aorta intorno alla punta dell'ago.
  8. Fare una grande incisione nell'atrio di destra, avendo cura di assicurare il minimo danno all'aorta discendente. Il ratto è ora pronto per aspersione.

3. intera aspersione e dissezione del ratto

Attenzione: PFA e acrilammide sono irritanti tossici e così deve essere gestite in una cappa aspirante con PPE appropriato.

Nota: I seguenti passaggi di aspersione intero sono un simile a un protocollo utilizzato in uno studio precedente di Woo et al. (2016) 10 , 11.

  1. Collegare l'atrio destro del cuore a un ago calibro 18, avendo cura di non introdurre eventuali bolle d'aria.
  2. Usando una siringa da 50 mL, rapidamente e in modo uniforme pompa 50 mL di soluzione di PBS 0.1 M fredda contenente eparina (10 unità/mL).
  3. Collegare l'ago calibro 18 al tubo della pompa peristaltica.
  4. Lavare con 200 mL di soluzione di PBS 0.1 M fredda contenente eparina (10 unità/mL) ad una velocità di circolazione di 10 mL/min.
  5. Difficoltà con 250 mL di soluzione fredda di PFA 4% ad una velocità di circolazione di 10 mL/min. In questa fase, il topo deve essere rigido.
  6. Raccogliamo e memorizziamo la soluzione rimanente PFA per lo smaltimento.
  7. Per patto, irrorare i tessuti con una soluzione di cocktail patto refrigerato di 4% PFA, 4% di acrilammide e 0,25% VA-044 polvere con un ago calibro 18 e quindi rimuovere la testa e la spina dorsale. Esporre il cranio con un'incisione del midline dal collo al naso. Questo passaggio aggiuntivo aspersione è inutile per i metodi psPACT e mPACT; Dopo la fissazione, immediatamente isolare la testa e la colonna vertebrale e il cranio di esporre.
  8. Esporre la base del cranio, eliminando qualsiasi residuo collo e muscoli della colonna vertebrale.
  9. Utilizzare Pinze ossivore e forbici per staccarsi il cranio. Rimuovere il cervello e il midollo spinale.
  10. Conservare il tessuto in 4% PFA a 4 ° C; tessuti possono essere memorizzati fino a 1 settimana.

4. idrogel monomero infusione e polimerizzazione del Mouse e del ratto SNC

Attenzione: Acrilamide, SDS, α-thioglycerol e PFA sono irritanti e così deve essere gestito in una cappa aspirante e con la pipì appropriato.

  1. PATTO (passivo tecniche di taglio)
    1. Isolare e cultura SNC intero (cervello e midollo spinale) da fissi topi e ratti a un tubo da 50 mL contenente una soluzione di cocktail patto refrigerata di 4% PFA, 4% di acrilammide e 0,25% VA-044 polvere e conservare a 4 ° C per 24 h. Assicurarsi che il tessuto è completamente immerso nella s oluzione.
    2. Incorporare il campione in gas di azoto per 10 min utilizzando un tessuto gel sistema di ibridazione collegato ad un serbatoio di azoto: impostare il sistema a 37 ° C. Transfer tessuti a un tubo da 50 mL contenente freddo fresco (4 ° C) patto soluzione cocktail e connetterti con cappuccio del tubo, quindi applicare il vuoto.
    3. Per polimerizzare l'idrogel, posto nella provetta contenente il campione in un incubatore d'agitazione (150 giri/min, 37 ° C) per 3 ore, o fino a quando la polimerizzazione è completa.
    4. Utilizzando la carta assorbente (Vedi Tabella materiali), Rimuovi il restante idrogelo polimerizzato i tessuti circostanti.
    5. Trasferire il tessuto a un tubo da 50 mL contenente soluzione di schiarimento (8% SDS in 0.1 M PBS, pH 8.0).
    6. Il campione viene posto in un'incubatrice agitazione impostata a 37 ° C e 150 giri/min fino a quando il tessuto è stato cancellato. In media, ci vogliono circa 20 giorni per il mouse CNS per raggiungere piena chiarezza.
  2. psPACT (tecnica di compensazione passiva separata di processo)
    1. Isolare l'intero CNS (cervello e midollo spinale) con osso cutter e forbici da PFA-fisso di topi e ratti su un banco pulito.
    2. Tessuti di trasferimento di un tubo da 50 mL contenente 4% PFA e conservare a 4 ° C per 24 h. garantire che il tessuto è completamente immerso nel fissativo.
    3. Lavare il tessuto fisso per 1 h in 0.1 M PBS e poi il trasferimento a A4P0 soluzione (4% di acrilammide in 0.1 M PBS). Negozio a 37 ° C per 24 h.
    4. Lavare il tessuto per 5 min in 0.1 M PBS.
    5. Immergere il tessuto in 0,25% VA-044 in 0.1 M PBS. Conservare a 37 ° C per 6-24 ore e poi il trasferimento al soluzione fresca di VA-044/PBS 0,25%.
    6. Incorporare il campione in gas di azoto per 10 min utilizzando un tessuto di ibridazione del gel sistema (Vedi Tabella materiali) collegato ad un serbatoio di azoto: Transfer tessuti a un tubo da 50 mL contenente freddo fresco (4 ° C) 0,25% soluzione VA-044/PBS e connetterti con tappo della provetta. Applicare il vuoto.
    7. Trasferire il tessuto a compensazione soluzione (8% SDS in 0.1 M PBS, pH 8.0).
    8. Incubare il campione in un incubatore agitazione impostato a 37 ° C e 150 giri/min fino a quando il tessuto è stato cancellato. In media, ci vogliono circa 17 giorni per mouse SNC a raggiungere piena chiarezza.
  3. MPATTO (tecnica di compensazione passiva modificata)
    1. Isolare l'intero CNS (cervello e midollo spinale) con osso cutter e forbici da PFA-fisso di topi e ratti su un banco pulito.
    2. Seguire i passaggi 4.2.2 - 4.2.8 del protocollo psPACT.
    3. Trasferire la soluzione di compensazione il tessuto. Si noti che, diversamente dai protocolli di patto e psPACT, mPACT richiede una soluzione di schiarimento composto da 0,5% α-thioglycerol oltre 8% SDS in 0.1 M PBS, pH 8.0. Α-thioglycerol è un agente delle Nazioni Unite-doratura più rapido ed efficace nell'eliminazione del tessuto. Assicurarsi che il tessuto è completamente immerso nella soluzione.
    4. Il campione viene posto in un'incubatrice agitazione impostata a 37 ° C e 150 giri/min fino a quando il tessuto è stato cancellato. In media, ci vogliono circa 2 settimane per mouse SNC a raggiungere piena chiarezza.

5. indice di rifrazione di corrispondenza e Immunostaining del CNS deselezionata

Nota: cerchi n(soluzione basata su Nycodenz indice di rifrazione di corrispondenza) è composto di 0,8 g/mL Nycodenz polvere sciolta in 30 mL di tampone di base (0,01% sodio azide e Tween-20 in PBS di 0,1 M, pH 8.0). È consigliabile che la soluzione sia collocata in un 37 ° C in agitazione incubatore per consentire adeguata solvatazione della polvere.

  1. Incubare tessuti nello 0,1% Triton X-100 in 0.1 M PBS per 2 h, quindi bloccare con 2% di albumina di siero bovino (BSA) in 0.1 M PBS per 6 h.
  2. Lavare sezioni tre volte in PBST (0.1% Tween-20 in 0.1 M PBS) per 2 h. macchia sezioni con gli anticorpi primari (in questo caso, un anticorpo anti-coniglio PECAM-CD31, che le macchie di vasi sanguigni) per 2 giorni.
  3. Macchia di sezioni con anticorpi secondari (in questo caso, un capra anti-coniglio Cy3 IgG coniugato fluorescente) nel 2% BSA per 2 giorni.
  4. Lavare con etichetta tessuti tre volte in PBST per 2 h e negozio in 15 mL ncerchi per 2-10 giorni.
  5. Prima di formazione immagine, spostare con etichettate tessuti una piccola quantità di ncerchi su piastre di coltura del tessuto di 35 o 60 mm. Difficoltà con il silicone intorno al bordo inferiore del piatto.
  6. Aggiungere 1,5-2 mL di fresco ncerchi.

6. image processing

  1. Acquisire immagini dei tessuti sgomberati con mattonelle scansione utilizzando un ingrandimento di 10x microscopewith scansione laser confocale (Vedi Tabella materiali). Del tessuto Cy3-etichetta, utilizzare lunghezze d'onda di 550-600 nm.

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Risultati

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Generazione di un modello trasparente dello SNC intero utilizzando tecniche di compensazione passiva ottimizzata

Ottica clearance di topo e ratto tessuti dello SNC interi rapidamente è stata ottenuta utilizzando varie tecniche di compensazione passiva (Figura 1). Un disegno schematico del tessuto di compensazione nel corso del tempo è mostrato nella Figura 2A

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Discussione

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Mentre i metodi di estrazione passivo, elettroforesi-impiegato nel patto ha migliorato significativamente la consistenza realizzata con tessuto precedente schiarimento metodi ad esempio chiarezza2,3,4,7 , 8, la tecnica porta ancora varie carenze, la più urgente delle quali è la lunghezza del tempo necessario per raggiungere il tessuto massima chiarezza

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal progetto cervello Corea 21 PLUS per la scienza medica, Università di Yonsei. Inoltre, questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione ricerca nazionale di Corea (NRF-2017R1D1A1B03030315).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sodio Dodecil Solfato (SDS)Affymetrix, Inc.75819Soluzione di pulizia
NycodenzAxia-Shield1002424soluzione nRIMS
40% soluzione di acrilammideBio Rad Laboratories, Inc.161-0140Polimerizzazione (A4P0)
2,2&acuto;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] DicloridratoWako Pure Chemical Industries, Ltd.017-19362Polimerizzazione (VA-044)
1-TioglicerinaSigma-AldrichM1753-100MLSoluzione di chiarificazione (mPACT)
Tween-20Georgiachem9005-64-5Soluzione nRIMS
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50MLImmuno Colorazione
Albumina sierica bovina (BSA)BovogenBSA100Eparina immunocolorante
Merck Millipore375095Perfusione (PBS)
Sodio azideSigma-AldrichS2002-25GSoluzione nRIMS
Anticorpo PECAM-CD31 SantaCruz Biotechnology Inc.sc-28188Immuno Colorazione
Capra anti-coniglio-IgG Cy3 coniugato fluorescenteJackson ImmunoResearch Inc.111-165-003Immuno Colorazione
4% ParaformaldeideTech & InnovazioneBPP-9004Perfusione, Polimerizzazione
20X Soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,4)Tech & InnovazioneBPB-9121Perfusione, tampone
10 mL stripetteCoatar4488Trasferimento di soluzione
Provetta da 50 mLFalcon352070Tubo di compensazione
35 mm Piatto per coltura cellulareSPL20035Imaging
Piatto confocaleSPL211350Imaging
Siringa da 1 mLKorea vaccine Co., Ltd26G 1/2Anestetizzare 
Siringa da 50 mlKorea vaccine Co., Ltd21G1 1/4Perfusione
AcrilammideSigma-AldrichA3553Polimerizzazione (A4P0)
Carta Whatman 3MMSigma-AldrichZ270849Carta assorbente per la rimozione del gel
Microscopio confocaleZeissLSM780Imaging
ZEN lite SoftwareZeissZEN 2012Imaging
Pompa peristalticaLongerpumpBT100-1FPerfusion
EasyGelLifecanvas TechnologiesEasyGelSistema di ibridazione su gel tissutale

Riferimenti

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