Microdilution del brodo In Vitro Screening: un metodo facile e veloce per rilevare nuovi composti Antifungini

Sommario

Un metodo di microdilution del brodo facile e adattabile per lo screening di composti Antifungini ed estratti.

Abstract

Le infezioni fungine sono diventati un'importante condizione medica negli ultimi decenni, ma il numero di farmaci antifungini disponibili è limitato. In questo scenario, è necessaria la ricerca di nuovi farmaci antifungini. Il protocollo qui riportato i dettagli di un metodo a peptidi di schermo per le loro proprietà antifungine. Cui si basa il test di sensibilità di microdilution brodo dagli orientamenti Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 con modifiche per soddisfare la ricerca di peptidi antimicrobici come potenziale nuovi anti-fungine. Questo protocollo descrive un'analisi funzionale per valutare l'attività dei composti Antifungini e può essere facilmente modificato per soddisfare una particolare classe di molecole in esame. Poiché le analisi vengono eseguite in piastre da 96 pozzetti utilizzando piccoli volumi, uno screening su larga scala può essere completato in un breve lasso di tempo, soprattutto se effettuate in un contesto di automazione. Questa procedura illustra come un protocollo clinico standardizzato e regolabile può aiutare il banco di lavoro perseguimento di nuove molecole per migliorare la terapia di malattie fungine.

Introduzione

Le infezioni fungine sono diventati un'importante preoccupazione medica negli ultimi decenni, avendo aumentato considerevolmente principalmente a causa di un aumento del numero di individui immunocompromessi, come quelli sottoposti a trattamento del cancro e coloro che vivono con l'HIV/AIDS o trapiantati organi^1,2. Tuttavia, una gamma molto limitata di farmaci antifungini disponibili e il numero aumentante dei rapporti sulla resistenza fungina a loro contribuiscono ai grandi problemi per quanto riguarda la terapeutica di micosi sistemiche³.

Una potenziale fonte di nuovi composti antifungini sono peptidi antimicrobici (amp), piccoli peptidi cationici prodotte da molti organismi come parte della loro risposta immunitaria innata a infezione⁴. Tuttavia, il metodo di screening per testare questi composti contro i patogeni fungini non è standardizzato. Le procedure differenti sono state usate per valutare l'attività antifungina di ampere, a volte per il modello stesso microrganismo^5,6,7. Queste differenze e la mancanza di dettaglio in alcuni protocolli complicare i confronti tra composti e ostacola riproducibilità.

Un modo per standardizzare la sperimentazione di nuovi farmaci candidati è quello di seguire le linee guida utilizzate per definire antifungosa di predisposizione nelle regolazioni cliniche, quali la clinica e linee guida Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. Tuttavia, questi test di sensibilità antifungini sono troppo restrittivi e non prendono in variazione di considerazione nel metabolismo tra le specie, come essi sono stati stabiliti soltanto per alcuni agenti selezionare. Ad esempio, non prendono in considerazione le esigenze metaboliche dei lieviti non fermentanti.

Questo protocollo permette la valutazione dell'attività dei potenziali composti antifungine e viene implementato qui per la ricerca di peptidi antimicotici. Cui si basa il test di sensibilità di microdilution brodo dalle linee guida CLSI M27-A3 con modifiche che ottimizzano lo screening di nuovi composti^8,9. Queste modifiche consentono l'uso di piccole quantità di composto, variazioni di temperatura o inoculo iniziale e media diversi per la crescita ottimale di pre-test, standardizzando i risultati con l'uso di antimicotici di riferimento come controlli. Questo metodo, con l'uso di piastre multi-pozzetto cultura, rende possibile rapidamente e in modo affidabile a schermo un gran numero di composti.

Grazie alla sua flessibilità intrinseca, questo protocollo può essere usato con differenti classi chimiche dei composti e contro altri microrganismi, con alcuni adattamenti.

Protocollo

1. soluzioni e Media

1. Preparare 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medie, tamponato fosfato salino (PBS), brodo di Sabouraud destrosio e Sabouraud agar destrosio come da tabella 1.

2. condizioni di crescita fungine inoculo

1. Memorizzare tutti i ceppi fungini come gli stock congelati in 35% glicerolo a-80 ° C, fino a quando necessario.
2. Attenersi alla seguente procedura prima di ogni esperimento.
   1. Per i ceppi di Candida albicans :
      1. Scongelare una fiala di magazzino e trasferire 200 µ l a 10 mL di brodo di Sabouraud destrosio in un tubo in polipropilene sterile 50 mL con tappo e coltura durante la notte a 30 ° C con agitazione (200 giri). Ricordarsi di inclinare il tubo e lasciare il coperchio leggermente aperto per una migliore areazione della cultura.
   2. Per i ceppi di Cryptococcus neoformans :
      1. Raschiare la superficie ghiacciata di un flaconcino stock. Piastra le cellule su piastre di agar Sabouraud destrosio e incubare per 48 h a 30 ° C. Dopo visibile crescita di colonie isolate, tenere le piastre in frigorifero (4 ° C) sigillato con la pellicola di paraffina per fino a 15 giorni.
      2. Raccogliere una colonia isolata di medie dimensioni dalla piastra utilizzando uno stuzzicadenti sterile o sterile ansa da inoculo e inoculare 10 mL di brodo di Sabouraud destrosio in una provetta conica sterile 50 mL. Incubare per circa 24 h a 30 ° C sotto agitazione (200 giri).
      3. Non superare le 24 ore di incubazione. Ricordarsi di inclinare il tubo e lasciare il coperchio leggermente aperto per una migliore areazione. È sempre buona standardizzare la fase di crescita delle cellule prima di ogni prova, poiché questo è un fattore importante che interessa la resistenza antimicrobica.
         Nota: Entrambi funghi sono stati coltivati a 30 ° C per propagazione rapida nei nostri esperimenti, ma la temperatura può essere modificata per riflettere gli obiettivi dello studio, il trattamento ad esempio clinico (37 ° C). La cosa più importante, questo tempo di incubazione iniziale dovrebbe essere stabilito in anticipo per ogni isolato fungina e mantenuto durante tutti i test per garantire la riproducibilità.
3. Dopo la crescita di funghi, raccogliere le cellule mediante centrifugazione le provette coniche a 1.200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e aggiungere 10 mL di PBS.
4. Risospendere le cellule e centrifugare nuovamente a 1.200 x g per 5 min a temperatura ambiente.
5. Ripetere il lavaggio con PBS e centrifugazione di altre due volte. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in 5 mL (secondo il formato della pallina) di 2 X RPMI-1640 medi.
6. Preparare 1 mL di una diluizione 1: 100 o 1:1,000 in un tubo del microcentrifuge (a seconda la torbidità della sospensione delle cellule).
7. Aliquotare 10 µ l di questa diluizione, metterlo in una camera di un emocitometro e contare il numero totale delle cellule nei quadranti quattro angolo sotto il microscopio. Calcolare la concentrazione dalla formula: (totale cella numero/4) x diluizione fattore x 10⁴ (costante di diluizione di camera).
   1. Considera una redditività del 100% se le condizioni di conteggi e crescita di redditività sono stati sistematicamente correlate per l'isolato oggetto di studio.
      Nota: La standardizzazione e il controllo di qualità dei conteggi di redditività può essere fatto da retro-placcatura in accordo con il Comitato europeo sul metodo di concentrazione inibitoria minima (MIC) antimicotico test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST) per lieviti¹⁰ .
   2. Se la correlazione di crescita/redditività non è stata stabilita per l'isolato sotto studio, misurare la redditività fungina contando le cellule vive in un emocitometro con l'ausilio di coloranti che colorano in modo selettivo le cellule morte, come Floxina B¹¹, trypan blu ¹², o Janus Green¹³. Utilizzare le cellule fungine per questo protocollo solo se la vitalità della popolazione a questo punto è 90% o superiore.
      Nota: Morti/vivi coloranti potrebbero non funzionare bene con il fungo di scelta. Si prega di testarli prima dell'uso. Ad esempio, il colorante trypan blu non funziona bene con c. neoformans.
8. Dopo di che, preparare le sospensioni delle cellule in 2 X RPMI-1640 medi (2 X regolata inoculo nel medium RPMI-1640). Per piastre da 96 pozzetti considera un volume di 5 mL per ogni piatto.
   1. Per tutti i ceppi di c. albicans , preparare una sospensione di cellule stock di 4 x 10³ cellule/mL. Questa concentrazione è di 2 volte della concentrazione finale delle cellule in ogni pozzetto (2 x 10³ cellule/mL).
   2. Per i ceppi di c. neoformans , preparare una cultura stock di cellule 2 x 10⁴ cellule/mL. Questa concentrazione è due volte la concentrazione di cella finale in ogni pozzetto (1 x 10⁴ cellule/mL).
   3. Per altri funghi, prova con un antimicotico noto che la concentrazione sarà ideale per studio particolare per quanto riguarda il tempo di incubazione. Prendere tempo metabolismo e duplicazione del fungo in considerazione.

3. peptidi (agente sconosciuto)

1. Memorizzare i peptidi liofilizzati a-20 ° C e scioglierle in acqua deionizzata prima di ogni esperimento. Il tempo massimo di conservazione una volta dissolto in acqua dipenderà la natura di ciascun peptide.
2. Preparare le aliquote di due volte la più alta concentrazione finale nel test (2 X). Idealmente, preparare un piccolo numero di aliquote con abbastanza peptide per utilizzare una sola volta evitare cicli di gelo-disgelo.
   Nota: La scelta della concentrazione dovrebbe essere basata sulla letteratura e sulle proprietà del peptide. Si consiglia di iniziare le diluizioni seriali con circa 100 µM del peptide e quindi diminuire o aumentare la gamma di concentrazione a seconda dei risultati ottenuti.

4. riferimento antimicotici (controlli positivi)

1. Per quelli diluiti in acqua: preparare una soluzione di 2 X di più alta concentrazione di analisi (vedere sezione 5: saggio di antimicotico per i passaggi di diluizione).
   1. Per i ceppi di c. albicans , preparare una soluzione di 128 µ g/mL di fluconazolo o 128 µ g/mL di caspofungin. La concentrazione di piastra per entrambi sarà 64 µ g/mL.
   2. Per i ceppi di c. neoformans , preparare una soluzione di 32 µ g/mL di amfotericina B (soluzione solubile in acqua). La concentrazione di piastra sarà 16 µ g/mL.
      Nota: Normalmente la amfotericina B è diluita in dimetilsolfossido (DMSO), poiché questo Antifungini è scarsamente solubile in acqua. Tuttavia, ci sono preparazioni solubili in acqua amfotericina B disponibile in commercio.
2. Per gli antimicotici diluiti in un solvente organico: preparare una soluzione di riserva in DMSO a 100x, quindi diluirlo a 10 volte di acqua per uso.
   Nota: Così, nel pozzo, la concentrazione finale di DMSO non supererà 1%. Un pozzo dove il fungo crescerà in media che contengono 1% DMSO come controllo è obbligatorio, dato che alcuni funghi non tollerano bene questa concentrazione del solvente. Ricordate che DMSO è fotosensibile, quindi coprire la piastra con un foglio o posizionarlo in una camera oscura per tutta la durata del periodo d'incubazione.

5. antifungino Assay

Nota: In vitro Antifungini saggi vengono eseguite in base al test di suscettibilità di microdilution brodo da linee guida di Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 con alcune modifiche.

1. Preparare una diluizione seriale di duplice di ciascun peptide e antimicotico in piastre microtiter da 96 pozzetti polistirolo ad un volume finale di 50 µ l di controllo.
   1. Utilizzando una pipetta aggiungere 100 µ l di antimicotico/peptide nella concentrazione X 2 dei più alti desiderata concentrazione finale nelle colonne 1-3, in fila A.
   2. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 50 µ l di acqua sterile negli altri pozzetti, nelle righe B-H.
   3. Rimuovere 50 µ l di pozzi con la più alta concentrazione (riga A), trasferire a altro bene della concentrazione prossima (riga B) e omogeneizzare.
   4. Ripetere i passaggi precedenti fino al pozzo con la più bassa concentrazione e scartare 50 µ l di questo pozzo (fila H). Lasciare le colonne 11 e 12 (righe A, B, C) con solo acqua per controllo vuoto o controllo negativo/crescita.
   5. Aggiungere 50 µ l di 2x regolato inoculo nel medium RPMI-1640 ad ogni pozzetto (colonne 1-3 più colonna 11 (controllo negativo/crescita)); la concentrazione finale per c. albicans sarà 2 x 10³ cellule/mL e la concentrazione finale di ceppi di c. neoformans sarà 10⁴ cellule/mL.
   6. Preparare i controlli vuoti (50 µ l acqua + 50 µ l 2 medium RPMI-1640 X senza cellule) controllo negativo/crescita (50 µ l acqua + 50 µ l regolata inoculo 2 X RPMI-1640 medium senza antimicotico) e carico nella piastra ben come descritto sopra.
2. Ripetere la procedura per ogni composto da testare e selezionato controllo antimicotico (colonne 4-10).
   Nota: Le diluizioni seriali possono essere fatto verticalmente come l'esperimento qui sotto, o orizzontalmente nella piastra (cioè, se il numero di diluizioni del composto/estratto dato che deve essere testato è otto o più).
   1. Se i composti, fare riferimento a farmaci, o ad uno qualsiasi dei suoi componenti sono fotosensibili, eseguire l'analisi in luce ridotta, coprire le piastre con un foglio o posto in una camera oscura durante le incubazioni.
3. Considerare le seguenti raccomandazioni opzionale.
   1. Sigillare la piastra con un coperchio trasparente che consente lo scambio di gas, come questo aiuta a ridurre l'evaporazione.
   2. Posizionare la piastra in una camera umida; aiuterà anche a ridurre l'evaporazione.
4. Incubare le piastre a 37 ° C per 24 ore o 48 ore per tutti i ceppi di c. albicans e per 48 h con 200 giri/min agitazione per c. neoformans. Il volume finale inferiore (100 µ l) garantisce che nessuna ricaduta si verifica.
   Nota: Nessuna differenza significativa è stata osservata fra MIC letture a h 24 e 48 ore per i ceppi di c. albicans . Ciò nonostante, letture a 48 h sono più facili da visualizzare.
5. Osservare tutti i pozzetti, con l'aiuto di un microscopio ottico invertito, prima del periodo di incubazione e dopo per verificare i cambiamenti nella morfologia anche per verificare eventuali segni di contaminazione.
   Nota: Le letture possono essere fare visivamente e fotografate alla fine dell'esperimento. Prima di ogni lettura, omogeneizzare leggermente la piastra. Le letture possono essere eseguite anche misurando la sua OD a 600 nm, se cella ciuffi e filamentazione non vengano rispettate.
6. Eseguire gli esperimenti almeno tre volte in date separate.

Risultati

Il MIC è definito come la più bassa concentrazione di composta antimicrobici che inibisce completamente la crescita fungina visibile alla fine del periodo d'incubazione. Poiché l'obiettivo del presente protocollo è quello di avere un metodo veloce per potenziali antimicotici schermo, qualsiasi bene con Chiara media simili ai pozzetti del bianco è considerato un risultato positivo, considerando che qualsiasi bene con torbidità analoga per i pozzetti di controllo negativo/crescita è conside...

Discussione

Test di microdilution può analizzare le potenziali attività antifungina di un target composto utilizzando piccole quantità del composto e allo stesso tempo testarlo in un intervallo di concentrazioni. Di conseguenza, questo protocollo è consigliato come un primo passo nello screening per potenziali nuovi composti antifungini. Il protocollo qui presentato è basato sul protocollo M27-A3, inizialmente progettato per aiutare nella selezione della terapia antifungosa in cliniche e può essere adattato ad una varietà di nuovi c...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Terreni e reagenti
RPMI 1640 terreno con l-glutammina, senza bicarbonato di sodio	Thermo Fisher	31800-022
3-(N-morpholino) acido propano solfonico (MOPS) (o que a gente usa tem um só dio, completa o nome dele please)	Sigma-Aldrich		Utilizzare per tamponare 2X RPMI medio
Cloruro di sodio (NaCl)	Dinâ mica	1528-1	137 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
Cloruro di potassio (KCl)	J.T.Baker	3040-01	2.7 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	V000129	10 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
Diidrogeno fosfato di potassio (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	60230	2 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
BD Difco Sabouraud brodo di destrosio	BD	238230
BD Difco Sabouraud destrosio agar	BD	210950
glicerolo	Sigma-Aldrich	V000123	35% per (soluç ã o de estoque? Criopreservaç ã o?)
Acqua			Para diluiç ã o das drogas na diluiç ã o seriada
Farmaci antifungini
Amfotericina B	Sigma-Aldrich	A2942
Fluconazolo	Sigma-Aldrich	F8929
Caspofungin	Sigma-Aldrich	PHR1160
Plastics
50 mL provetta	conicaSarstedt	62.547.254
Piatto petri	J.Prolab	0304-5
Piastra a 96 pozzetti	Corning	3595
Serbatoio soluzione sterile	KASVI	K30-208	Utilizzare per pippet le soluzioni utilizzando il multicanale pippet
Equipment e altri materiali
Microscopio ottico	Nikon	E200MV
Centrifuga	Thermo Fisher	MegaFuge 16R
Incubatore	Ethik Technology	403-3D	Impostato a 37° C
Agitatore	New Brunswick Scientific	Excella E25	impostato a 37° C, 200 RPM
Camera di conteggio delle cellule, Neubauer	BOECO Germany	BOE 13
Pipetta multicanale	HTL	5123