Un metodo di microdilution del brodo facile e adattabile per lo screening di composti Antifungini ed estratti.
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Articolo metodologico
Microdilution del brodo In Vitro Screening: un metodo facile e veloce per rilevare nuovi composti Antifungini
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le infezioni fungine sono diventati un'importante condizione medica negli ultimi decenni, ma il numero di farmaci antifungini disponibili è limitato. In questo scenario, è necessaria la ricerca di nuovi farmaci antifungini. Il protocollo qui riportato i dettagli di un metodo a peptidi di schermo per le loro proprietà antifungine. Cui si basa il test di sensibilità di microdilution brodo dagli orientamenti Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 con modifiche per soddisfare la ricerca di peptidi antimicrobici come potenziale nuovi anti-fungine. Questo protocollo descrive un'analisi funzionale per valutare l'attività dei composti Antifungini e può essere facilmente modificato per soddisfare una particolare classe di molecole in esame. Poiché le analisi vengono eseguite in piastre da 96 pozzetti utilizzando piccoli volumi, uno screening su larga scala può essere completato in un breve lasso di tempo, soprattutto se effettuate in un contesto di automazione. Questa procedura illustra come un protocollo clinico standardizzato e regolabile può aiutare il banco di lavoro perseguimento di nuove molecole per migliorare la terapia di malattie fungine.
Introduzione
Le infezioni fungine sono diventati un'importante preoccupazione medica negli ultimi decenni, avendo aumentato considerevolmente principalmente a causa di un aumento del numero di individui immunocompromessi, come quelli sottoposti a trattamento del cancro e coloro che vivono con l'HIV/AIDS o trapiantati organi1,2. Tuttavia, una gamma molto limitata di farmaci antifungini disponibili e il numero aumentante dei rapporti sulla resistenza fungina a loro contribuiscono ai grandi problemi per quanto riguarda la terapeutica di micosi sistemiche3.
Una potenziale fon....
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Protocollo
1. soluzioni e Media
- Preparare 2 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medie, tamponato fosfato salino (PBS), brodo di Sabouraud destrosio e Sabouraud agar destrosio come da tabella 1.
2. condizioni di crescita fungine inoculo
- Memorizzare tutti i ceppi fungini come gli stock congelati in 35% glicerolo a-80 ° C, fino a quando necessario.
- Attenersi alla seguente procedura prima di ogni esperimento.
- Per i ceppi di Candida albicans :
- Scongelare una fiala di magazzino e trasferire 200 µ l a 10 mL di brodo di Sabouraud destrosio in un tubo in polipropilene steri....
- Per i ceppi di Candida albicans :
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Risultati
Il MIC è definito come la più bassa concentrazione di composta antimicrobici che inibisce completamente la crescita fungina visibile alla fine del periodo d'incubazione. Poiché l'obiettivo del presente protocollo è quello di avere un metodo veloce per potenziali antimicotici schermo, qualsiasi bene con Chiara media simili ai pozzetti del bianco è considerato un risultato positivo, considerando che qualsiasi bene con torbidità analoga per i pozzetti di controllo negativo/crescita è conside.......
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Discussione
Test di microdilution può analizzare le potenziali attività antifungina di un target composto utilizzando piccole quantità del composto e allo stesso tempo testarlo in un intervallo di concentrazioni. Di conseguenza, questo protocollo è consigliato come un primo passo nello screening per potenziali nuovi composti antifungini. Il protocollo qui presentato è basato sul protocollo M27-A3, inizialmente progettato per aiutare nella selezione della terapia antifungosa in cliniche e può essere adattato ad una varietà di nuovi c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo CAPES-Brasile, CNPq-Brasile, FAP/DF per il sostegno finanziario. Siamo grati al Dr. Hugo Costa Paes di revisione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Terreni e reagenti | |||
| RPMI 1640 terreno con l-glutammina, senza bicarbonato di sodio | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) acido propano solfonico (MOPS) (o que a gente usa tem um só dio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Utilizzare per tamponare 2X RPMI medio | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Dinâ mica | 1528-1 | 137 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) |
| Cloruro di potassio (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) |
| Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) |
| Diidrogeno fosfato di potassio (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM per soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) |
| BD Difco Sabouraud brodo di destrosio | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud destrosio agar | BD | 210950 | |
| glicerolo | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% per (soluç ã o de estoque? Criopreservaç ã o?) |
| Acqua | Para diluiç ã o das drogas na diluiç ã o seriada | ||
| Farmaci antifungini | |||
| Amfotericina B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazolo | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL provetta | conicaSarstedt | 62.547.254 | |
| Piatto petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| Piastra a 96 pozzetti | Corning | 3595 | |
| Serbatoio soluzione sterile | KASVI | K30-208 | Utilizzare per pippet le soluzioni utilizzando il multicanale pippet |
| Equipment e altri materiali | |||
| Microscopio ottico | Nikon | E200MV | |
| Centrifuga | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubatore | Ethik Technology | 403-3D | Impostato a 37° C |
| Agitatore | New Brunswick Scientific | Excella E25 | impostato a 37° C, 200 RPM |
| Camera di conteggio delle cellule, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Pipetta multicanale | HTL | 5123 |
Riferimenti
- Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
- Pfaller, M. A.
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Ristampe e permessi
