Articolo metodologico

Analisi quantitativa di un neurone Arborization dentritico complessità in Drosophila

DOI:

10.3791/57139

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7 gennaio 2019

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1Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Mass General Institute of Neurodegenerative Disease, 2Department of Geriatric Neurology, Nanlou Clinical Division, PLA General Hospital

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo è centrato sull'analisi quantitativa della complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila, che può essere utilizzato per gli studi della morfogenesi dendritica.

Abstract

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Dendriti sono le proiezioni ramificate di un neurone e morfologia dentritica riflette l'organizzazione sinaptica durante lo sviluppo del sistema nervoso. Drosophila larvale arborization dentritico neuronale (da) è un modello ideale per studiare la morfogenesi di dendriti neurali e funzione del gene nello sviluppo del sistema nervoso. Ci sono quattro classi di neuroni da. Classe IV è la più complessa con un modello di ramificazione che copre quasi l'intera superficie della parete del corpo larvale. Precedentemente abbiamo caratterizzato l'effetto di mettere a tacere l'ortologo di Drosophila di SOX5 classe di complessità di un neurone arborization dentritico IV (NDAC) utilizzando quattro parametri: la lunghezza dei dendriti, l'area della superficie di copertura dendrite, il numero totale di rami e la struttura ad albero. Questo protocollo presenta il flusso di lavoro di analisi quantitativa NDAC, composto da dissezione larvale, microscopia confocale e procedure di analisi di immagine utilizzando il software ImageJ. Ulteriore comprensione da sviluppo neuronale e dei suoi meccanismi sottostanti migliorerà la comprensione della funzione di un neurone e fornire indizi circa le cause fondamentali di neurologici e disturbi dello sviluppo neurologico.

Introduzione

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Dendriti, che sono le proiezioni ramificate di un neurone, coprono il settore che comprende ingressi di neurone sensoriale sinaptica da altri neuroni1,2. Dendriti sono una componente importante della formazione della sinapsi e svolgono un ruolo critico nella integrazione sinaptici ingressi, così come la stimolazione elettrochimica in un neurone di moltiplicazione. Arborization dentritico (da) è un processo mediante il quale i neuroni formano nuovi alberi dendritiche e rami per creare nuove sinapsi. Lo sviluppo e la morfologia da, come la densità di ramo e modelli di raggruppamento, risultato di processi biolog....

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Protocollo

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1. preparazione sperimentale

  1. Preparare i seguenti reagenti: tampone fosfato di Dulbecco (PBS); Triton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldeide (PFA), diluita in 4% prima dell'uso; base di elastomero di silicone e dell'agente indurente; mezzo di montaggio Antifade (ad es., prolungare oro); e smalto per unghie.
  2. Preparare la seguente attrezzatura: microscopio di dissezione, due taglienti forcipe e un paio di forbici per microdissezione, un numero di pin per microdissezione, una capsula di Petri per fare il piatto di dissezione, vetrini da microscopio e coprioggetto, un microscopio confocale e un computer con installato ....

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Risultati

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I dendriti dei neuroni da sono stati etichettati da co-overexpressing GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) da soma neurale e dendritiche pergole per analisi di imaging di fluorescenza di GFP. La morfologia dei dendriti del neurone da è stato ripreso da un microscopio confocale invertito (Figura 2).

I dendriti dei neuroni da sono stati rintracciati usando il software ImageJ Fiji. Il file è stato utilizzato per st.......

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Discussione

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Dendriti che innervano l'epidermide sono le regioni ingresso dei neuroni e loro morfologie determinano come informazioni viene ricevuti ed elaborati da singoli neuroni. Morfologia del dendrite di sviluppo riflette la modulazione genica dell'organizzazione di dendrite. Il Drosophila larvale da neurone del sistema nervoso periferico è un modello importante per studiare lo sviluppo di dendrite causa di: 1) la somiglianza funzionale con mammiferi11,12; 2) qu.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare William A. Eimer per l'assistenza tecnica di imaging. Quest'opera è stata sostenuta da fondo cura morbo di Alzheimer [per R.E.T], il National Institute of Health [R01AG014713 e R01MH60009 a R.E.T; R03AR063271 e R15EB019704 di A.L.] e la National Science Foundation [NSF1455613 a A.L.].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione salina tamponata con fosfato(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldeide(PFA)Microscopia elettronicaSciences 15714-S
Sylgard 184 base di elastomero siliconico e agente indurenteDow Corning Corportation3097366-0516; 3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Smalto per unghie CVS72180
StereomicroscopioNikonSMZ800
Microscopio confocaleNikonEclipse Ti-E
Piastra di PetriFalcon353001
PinzaDumont11255-20
Forbici Roboz Strumento Chirurgico CoRS-5611
Perni per insettiRoboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Vetrini e vetrini coprioggettiFisher Scientific15-188-52

Riferimenti

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  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K.,....

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Morfologia neuronalelarve di Drosophilamicroscopia confocaleanalisi con ImageJmisurazione della lunghezza dei dendriticalcolo dell area superficialeanalisi della struttura di ramificazionesilenziamento del gene SOX5imaging a serie Z

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