Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la cellula--cellula trasferimento di informazioni oscillatori di optogenetica controllo e monitoraggio dell'espressione genica live. Questo approccio fornisce una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Abstract

Cellule devono rispondere correttamente a cambiare temporaneamente gli ambienti, che sono influenzati da vari fattori da cellule circostanti. Il via di segnalazione di Notch è uno di tali macchinari molecolari essenziali per le comunicazioni cellula--cellula, che svolge ruoli chiave nello sviluppo normale degli embrioni. Questa via comporta un trasferimento di cellula--cellula di informazioni oscillatorie con Oscillazioni ultradiane, ma nonostante i progressi nelle tecniche di biologia molecolare, è stato impegnativo per delucidare l'impatto delle interazioni multicellulari sul gene oscillatoria dinamica. Qui, presentiamo un protocollo che consente la gestione di optogenetica e monitoraggio in tempo reale di espressione genica in modo temporale preciso. Questo metodo con successo ha rivelato che intracellulari e intercellulari ingressi periodici della tacca di segnalazione entrain oscillazioni intrinseche di frequenza di sintonizzazione e fase spostando la risoluzione di singole cellule. Questo metodo è applicabile per l'analisi delle caratteristiche dinamiche delle varie vie di segnalazione, fornendo una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Introduction

Comunicazione della cellula--cellula giocano un ruolo critico nel patterning embrionale in processi di sviluppo. In embrioni vertebrati, le strutture metamerica chiamate somiti si formano lungo l'asse antero-posteriore corpo con una precisione temporale precisa sotto il controllo di un orologio di tempo di mantenimento, chiamato la segmentazione dell'orologio¹. Durante questo processo, un gruppo di cellule del mesoderma presomitic (PSM) periodicamente vengono convertiti in somiti in modo sincrono. Questo processo coinvolge l'espressione genica di oscillatori sincronizzati e cellule PSM che oscillano in fase formano dei metameri stessi. Il perio....

Protocol

1. generazione di linee cellulari stabili dal sistema Tol2

1. Transfect vettori plasmidici (Figura 1A) di moduli basati su Tol2 optogenetica insieme con il vettore di espressione transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) in cellule C2C12. In tutte le fasi, le cellule di cultura con medium DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina-streptomicina a 37 ° C (tabella 1), in presenza di 5% CO₂, altrimenti indicato.
   1. Contare tripsinizzate con un contatore di cellule e piastra 5x10⁴ C2C12 cellule per pozzetto in un piatto di 12-pozzetti un giorno prima di transfezione.
   ....

Results

Abbiamo adattato il LightOn sistema^11,12, che consente l'espressione genica di foto-indotta in cellule di mammifero, allo studio della genetiche oscillatori con periodicità di 2 - 3 h. Questo sistema è composto da due parti: il hGAVPO foto-inducible attivatore trascrizionale e una cassetta di UAS-promotore alla trascrizione di unità di arbitrari geni di interesse. Per accelerare la cinetica pulsatile di espressione genica indotta .......

Discussion

Abbiamo mostrato un metodo per controllare le dinamiche di espressione genica con una periodicità di h 2 o 3. Questa scala temporale è molto più breve rispetto a quelle di altri sistemi convenzionali, tra cui il sistema Tet-On e il sistema LightOn originale. Parametri chiave per raggiungere le scale temporali ultradiane sono emivite di prodotti molecolari indotti da foto, mRNA e proteine. Questi parametri cinetici possono dipendere di specie e tipi di cellule. Per la sintonizzazione la cinetica, sostituendo sequenze Hes1.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACS	Becton, Dickinson e società	FACSAriaII SORP
Camera	Andor	iKon M-934
Microscopio	Olympus	IX-81 ZDC
PMT dispositivo	Churitsu eletric corp.	CL24B-LIC/B
Illuminatore LED Blu	OptoCode	LEDB-SBOXH
DMEM	Nacalai	08459-35
Penicillina-streptomicina	Nacalai	26253-84
Siero fetale bovino	Sigma	172012
KRYSTAL24 (piastra nera a 24 pozzetti)	Hi-tech	303012
D-Luciferina Potassio Sale	Nacalai	20028-24
Esposimetro	LI-COR Biosciences	LI-250A
anticorpo anti-HA-perossidasi	Clone Roche	3F10
anticorpo anti-actina-perossidasi	Wako	clone 2F3