Analisi del comportamento di crescita di Arabidopsis thaliana in diverse qualità di luce

Arabidopsis thaliana è stato l'organismo modello per i ricercatori di pianta dell'era molecolare per più di due decenni. Diverse caratteristiche rendono questo piccolo rappresentante della famiglia del Brassica un candidato ideale per studi genetici e molecolari: ha un genoma relativamente piccolo con solo cinque cromosomi (rispetto ad es. Nicotiana tabacum con 24 cromosomi) e il suo genoma è stato completamente sequenziato nel 2000¹. A. thaliana può essere facilmente geneticamente modificato da Agrobacterium infezione² ed è favorevole alla anche i più recenti strumenti genetici quali CRISPR/Cas³. Anche se piccolo, il ciclo di crescita è abbastanza veloce per fare esperimenti biochimici fattibili dove è necessaria una maggiore quantità di materiale. Le piante crescono su piastre di agar o sul suolo e possono anche essere coltivate come colture liquide⁴. Arabidopsis possono essere coltivate in armadi climaticamente controllati, ad esempio da Percival, in camere climatiche o in serre. Per essere in grado di confrontare il comportamento di sviluppo e analizzare fenotipi mutanti è fondamentale per fornire riproducibile e al tempo stesso flessibile crescita condizioni⁵. A seconda del problema scientifico che deve essere affrontato uno potrebbe essere necessario diverse temperature e condizioni di luce costante, diverse intensità di luce o diverse qualità di luce alla stessa temperatura. Luce è un parametro molto critico nella crescita delle piante e la sua influenza è spesso studiata in diversi approcci⁶. Per garantire la riproducibilità e comparabilità dei dati ottenuti è cruciale assicurare una produzione stabile e applica lo stesso tipo di sorgenti luminose.

Le fonti di luce usuale in serre e camere climatiche sono costituiti da vapori di sodio o lampade fluorescenti, che promuovono la crescita soddisfacente delle piante ma hanno diversi svantaggi. In primo luogo, invecchiano nel tempo che cambia lo spettro d'emissione non solo in intensità ma di qualità (proprie osservazioni). Tuttavia, solo l'intensità è solitamente controllata continuamente affinché un cambiamento nella qualità della luce potrebbe passare inosservato ma ancora avere effetti significativi. In secondo luogo, entrambi i tipi di lampade generano calore a più alta intensità di luce, che a sua volta ha una profonda influenza fisiologica sulla crescita delle piante e potrebbero mascherare qualsiasi effetto luce-dipendente. In terzo luogo, lo spettro d'emissione di queste fonti di luce è invariabile e abbastanza a differenza della luce naturale del sole⁷. Tutti questi inconvenienti sono stati superati in caso di LED)^8,9,10,11. Hanno una lunga durata con a malapena qualsiasi cambiamento in emissione, non producono calore di scarto anche ad altissima intensità di luce e sono molto flessibile riguardo il loro spettro d'emissione.

Qui illustriamo come impostare una camera climatica con luci a LED separati per rosso, blu e luce bianca e seguire diversi parametri di crescita delle piante nel corso del tempo. Misuriamo il peso fresco, area fogliare, densità di stomi e rendimento fotosintetico. Allo stesso tempo, dimostriamo l'importanza di istituire correttamente valutazioni statistiche.

Questo protocollo contiene alcuni esempi di come analizzare il comportamento di crescita delle piante di a. thaliana .

1. preparazione

1. Prima di iniziare, assicurarsi un attento piano su quante piante saranno necessari per fare un'analisi statistica attendibile degli esperimenti e poi preparano la quantità appropriata di pentole.
   Nota: Attendere sempre la possibilità che alcuni semi non potrebbero germinare.
2. Utilizzare una camera climatica con diversi livelli di LED programmabili individualmente per confrontare la crescita delle piante nelle stesse condizioni ambientali generali (materiali tavolo).

2. pianta crescita e set-up delle luci a LED

1. Preparare il numero appropriato (a seconda delle diverse condizioni e/o mutanti per essere analizzati) di vasi di cm 6 x 7 con terreno e piantare un seme singolo in ognuna di esse.
   Nota: In questo caso, sono stati seminati 36 piante per condizioni.
2. Vernalizzare per due giorni a 4 ° C.
3. Impostare l'umidità relativa dell'aria di 65% e alla temperatura di 22 ° C/16 ° C per un giorno di 16 h / h 8 ciclo notte. Regolare la luce di tutti i livelli per un'intensità di 200 µM/cm2/s¹. Fare questo inserendo i rispettivi valori in un programma tramite il touch screen nella parte anteriore della camera climatica. Per confrontare i quattro diverse qualità di luce è possibile impostare i LED per i seguenti parametri come previsto nella tabella 1.

Tabella 1: composizione di intensità di luce emessa dai LED

4. Monitorare lo spettro d'emissione continuamente, ad esempio utilizzando uno spettrometro calibrato incorporato.
5. Disporre le piante in camera climatica su diversi livelli e tenerli coperti con un top trasparente fino a ben sviluppati cotiledoni sono visibili. Assicurarsi che le piante sono sufficientemente innaffiate.
6. Monitor e documento piante dall'occhio e fotograficamente come spesso come appropriato, a seconda di quanto velocemente le piante crescono nelle condizioni selezionate, ad esempio ogni due giorni. Assicurarsi di utilizzare un treppiede per la macchina fotografica per garantire l'uguale distanza tra fotocamera e oggetti per tutte le immagini e quindi abilitare i confronti. Utilizzare una barra di scala quando appropriato.
   Nota: Il termine DAS (giorni dopo la semina) si riferisce alla effettiva piantando i semi tra cui vernalizzazione.

3. determinazione del rendimento PSII

1. Utilizzare un fluorimetro impulso-modulato. Impostare la testa di macchina fotografica a una distanza adeguata dalla pianta affinché il rosone completo può essere visto sulla finestra live.
2. All'avvio del software viene visualizzata una finestra di "selezionare l'unità". Barrare la casella "MINI" e poi "ok". Scegliere colore "blu" nella finestra a comparsa successiva. Fare clic su "ok".
   Nota: La fluorescenza di impulso-modulato misura la luce si accende automaticamente. Sul monitor, la finestra immagine viene visualizzata con il parametro di fluorescenza Ft. Una pianta posta sotto la fotocamera ora può essere visto come un'immagine arancia.
3. Per mettere a fuoco l'immagine e/o scegliere regioni specifiche della pianta, passare a Live Video spuntando la casella "video live" e ruotare l'anello di regolazione della lente dell'obiettivo. Chiudere la finestra LIVE Video facendo clic sulla casella di uscita in alto a destra.
4. Per misurare i parametri fotosintetici, definire un'area di interesse (AOI). Utilizzare l'impostazione predefinita per questo, che è un cerchio che appare automaticamente al centro dello schermo. La casella rossa al lato di esso rappresenta il valore medio di Ft di tutti i pixel all'interno l'AOI. Definire l'AOI appropriato scegliendo dalla casella AOI al pannello di destra, dove sono disponibili diverse forme. Fare clic su "Aggiungi" nella scheda AOI e posizionare il cerchio all'interno dell'area di foglia. Ripetere cinque volte per anta.
5. Mantenere le impostazioni (scheda a destra) presso i valori predefiniti forniti dal produttore (tabella 2).

Tabella 2: impostazioni predefinite per le misurazioni di PAM come fornito dal produttore.

6. Applicare un lampo di luce saturante per eseguire una misurazione di parametri fotosintetici da fluorescente tempra analisi (impulso di saturazione). Prima di ciò, è necessario determinare i coefficienti di tempra misurando la resa massima e minima di fluorescenza di una pianta scuro-adattata. A tal fine, è necessario collocare la pianta al buio (ad es. in un cassetto o scatola scuro) per qualche minuto. Poi mettere la pianta sotto la testa della fotocamera, selezionare le caselle misura e ML (misura la luce), nella riga sotto l'immagine scegliere "Fv/Fm" facendo segnare nel cerchio e scegliere Fo, Fm nella parte inferiore dello schermo.
   Nota: Fo/Fm rappresenta il rendimento PSII di una pianta scuro-adattato. Così, è il valore a cui la misurazione dopo l'applicazione di luce è normalizzata. La misurazione di Fo/Fm corrente rimarrà fino a quando viene attivato il nuovo Record. Tutti i F e Fm' valori determinati da impulsi di saturazione sono legati alla Fo/Fm e dissetante parametri sono calcolati di conseguenza.
7. Trovare questi risultati nella scheda report e selezionare tutte le caselle sul lato destro che sono rilevanti per l'esperimento (ad es. Y (II), qP, qN, ecc.).
8. Esportare i risultati in un software di analisi ad es. Di Excel facendo clic sul pulsante Esporta in alto a sinistra e salvare con nome di file appropriato. Generare almeno cinque AOIs per anta e misurare molte foglie della stessa pianta (non dimenticate di poco scuro adattare l'impianto dopo ogni misurazione), così come parecchie piante da una condizione, che può quindi essere valutati statisticamente.
9. Per l'analisi statistica generare valori medi e deviazioni standard da tutti AOIs e almeno tre impianti indipendenti per tutti tempo punti/condizioni ed eseguire t-test di uno studente per valutare se i dati sono significativi¹². I dati vengono valutati come significativamente differenti quando i valori di p sono inferiori a 0,05.

4. la determinazione della densità di stomi

1. Raccogliere tre foglie rosetta completamente espansi da tre piante individuali per condizione in etanolo al 70% in una capsula di Petri vetro e per estrarre la clorofilla. Incubare in questo solvente durante la notte a temperatura ambiente o conservare a 4 ° C.
2. Per lo sdoganamento completo da pigmenti, Incubare in soluzione di idrato di cloralio (cloralio idrato: acqua: glicerolo = 8: 2: 1 w/v/w) fino a quando le foglie appaiono completamente bianchi.
3. Prendere immagini di microscopia (DIC) della superficie abbagliai interferenza differenziale a 40 ingrandimenti. Contare gli stomi nel campo di visibilità ed estrapolare con l'aiuto della barra della scala di stomi a mm ². Ripetere che questa procedura per almeno 4 foglie per condizioni. Effettuare analisi statistiche, calcolando il valore medio per tutte le foglie di una circostanza e da questo calcolare l'errore medio.

5. determinazione del peso fresco

1. Rimuovere tutte le foglie tra cui piccioli da rosette da sei piante per condizione con una lama di rasoio. Pesare immediatamente tutte le foglie e fatti salvi i dati di analisi statistiche come descritto sopra.

6. determinazione della superficie fogliare Rosetta

1. Usa le immagini da otto piante per condizione di analizzare graficamente la superficie fogliare. Combinare le immagini per una condizione in una singola immagine e salvare come JPEG o *. TIFF.
2. Scaricare il software appropriato (materiali tavolo).
   Nota: È, ovviamente, possibile applicare qualsiasi altro programma in grado di svolgere questo compito.
3. Aprire un file di immagine. Scegliere lo strumento "selezione a mano libera". Circondare tra cui piccioli di una rosetta di foglie. Fai clic su "Analyze - misure set" e controllare "Area", "Min & Max valore di grigio," "Densità integrata" e "Valore di grigio medio." Scegliere decimale appropriato luoghi, è meglio due o tre e fare clic su "ok".
4. Per ottenere mm² pixel invece di utilizzare il comando "set scala". Applicare lo strumento di selezione Straight-line per effettuare una selezione di riga che corrisponde a una distanza nota, ad esempio il diametro di congedo che è facile da calcolare dalla barra della scala delle immagini, quindi aprire la finestra di dialogo Imposta scala e immettere la distanza definita e unità di unità di misura. Poi tornare a "analizzare" e fare clic su "misura".
5. Appare una nuova finestra dal titolo "risultati" che contiene i dati rilevanti per la Rosetta corrente. Ripetere questa procedura con tutte le piante nell'immagine e inizializzare le misurazioni di zona per ogni nuovo impianto con Ctrl + M.
   Nota: Per le più piccole piante con foglie non sovrapposte la "bacchetta" può essere utilizzata per rendere il processo più facile e veloce. Appena foglie iniziano coprendo vicenda, questo strumento non dà risultati affidabili.
6. In alternativa, tagliare tutte le foglie e posizionarli in modo che un'immagine panoramica può essere preso e quindi utilizzare lo strumento bacchetta. Prendere in considerazione che, quando si utilizza questo metodo, sono necessari più piante.
7. Scegliere "File"-"Salva come" nella finestra dei risultati e generare un nome di file appropriato e una posizione nella directory computer. Il file verrà automaticamente salvato in formato Excel.

7. preparazione di RNA

1. Raccogliere tre campioni da dieci piante individuali per ogni condizione. Estrarre RNA totale usando un impianto kit di estrazione di RNA secondo le istruzioni del produttore. Determinare la concentrazione, purezza e integrità RNA utilizzando un bioanalyzer. RNA può essere utilizzato da per esempio RNASeq¹³per la a valle applicazioni quali l'analisi di espressione di gene o qRT-PCR.

Osservazione e analisi della crescita delle piante e soprattutto fenotipi da piante mutanti si basano sulle condizioni ambientali stabili e riproducibili. Questi possono essere forniti in camere climatiche. Quantità di luce e soprattutto la qualità dipende criticamente la sorgente luminosa autonomo, che in questo studio è stata fornita da luci a LED.

Figura 1 Mostra un esempio di una camera attrezzata con pannelli a LED. Figura 1A Mostra una schermata del pannello di controllo dove tutte le condizioni climatiche e di luce possono essere regolate. Entro 24 h può essere impostate venti lassi di tempo diversi. In questo esempio, condizioni di giorno lungo con luce/8 16h scuro sono state programmate. Questa camera dispone di quattro livelli che possono essere programmati separatamente in modo che la crescita delle piante a quattro diverse impostazioni di luce può essere studiato sotto esattamente le stesse condizioni ambientali. Superiore sinistro del livello è impostata su un output spettrale che imita la luce del sole per quanto tecnicamente possibile, il superiore rappresenta proprio livello elevato rosso (660 nm) e luce blu (440 nm) con ridotta luce bianca (3K). Livello inferiore sinistro era impostato di elevata luce blu e il livello inferiore principalmente luce rossa. Figura 1B illustra i LED presso le diverse impostazioni come una panoramica (pannello centrale) e i rispettivi zoom-in (piccoli pannelli esterni). La differenza nella qualità della luce può essere facilmente visto dall'occhio.

Uno spettrometro inbuilt costantemente misure, monitora e regola l'uscita spettrale. La figura 2 Mostra lo spettro dal livello superiore sinistro 1.1, che è stato impostato per simulare la luce del sole. Rispetto ad una normale lampadina fluorescente la porzione di UV e luce blu è molto maggiore di7.

Nella Figura 3 un esempio di a. thaliana piante da tutti i giorni quattro condizioni 10, 13 e 17, rispettivamente, dopo la semina è raffigurata. Tutti gli impianti sono stati fotografati dalla stessa distanza da montare la fotocamera su un treppiede. La barra della scala rappresenta 1 cm. Dopo 10 giorni, non molta differenza nella dimensione o il colore può essere discernuto, ma dopo 17 giorni è evidente una crescita più veloce sotto la luce rossa. Oltre a questa analisi visiva, sono state effettuate diverse analisi fisiologiche.

Figura 4 segue le varie fasi delle misurazioni di PAM, che permette di analizzare ad esempio la capacità fotosintetica. In Figura 4A uno screenshot del video dal vivo è indicato, che è l'impostazione per portare la pianta a fuoco per garantire una qualità ottimale delle misurazioni. Invece di concentrarsi su tutta la pianta, si può anche scegliere una singola foglia di analizzare. Figura 4B dimostra l'attuale rendimento fluorescente Ft di una pianta scuro-adattata prima la misura reale è stata avviata. In questo caso, sono stati scelti cinque aree circolari di interesse (AOI). I numeri nelle caselle di rosso accanto ogni AOI dà direttamente il risultato numerico, che possa anche essere salvato sotto forma di una tabella. Per avviare una misurazione dei parametri fotosintetici Fo, Fm è necessario impostare. Uno screenshot di Ft dopo aver fatto questo è raffigurato in Figura 4. Si noti che ora il pulsante "Fo, Fm" non è più attivo. Per avviare una nuova misurazione, "Nuovo Record" deve essere cliccato per cancellare la normalizzazione precedente. Infine, la Figura 4 Mostra l'effettivo rendimento quantico PSII y (II) dopo aver dato un impulso di luce saturante ("SAT-Pulse"). Quantificazione dei dati esemplari è illustrato nella Figura 5. Piante coltivate sotto la luce solare a 200 µM/cm2/s1 (Figura 5A) sono state analizzate 12, 21 e 28 giorni dopo la semina, rispettivamente. I nostri dati dimostrano che la resa PSII è significativamente in foglie da piante coltivate per tre settimane rispetto per 12 giorni. La differenza tra 28 e 12 giorni è ancora significativa, ma il p-valore è più alto. In Figura 4B, PSII rendimenti da piante coltivate per due settimane da diverse qualità di luce sono stati confrontati. Interessante, una crescita permanente sotto la luce contenente un'alta parte della luce blu conduce ad un rendimento significativamente maggiore del PSII. Un simile effetto è stato osservato per le piante coltivate sotto luce rossa arricchita, ma l'aumento è stato di poco inferiore.

Diverse qualità di luce sono stati indicati per effetto stomi sviluppo14. Di conseguenza, è stata studiata la densità stomatica. Figura 6 di seguito viene illustrato l'aspetto di una foglia dopo l'estrazione del pigmento. Cellule epidermiche singole possono essere ben distinte, e stoma può essere facilmente contato. Nella figura, gli stomi individuali sono indicati da un asterisco. Dati dettagliati circa la densità stomatica delle piante dalle diverse impostazioni di luce possono essere trovati altrove9.

Oltre a ispezione visiva (Figura 3) il peso fresco fornisce una buona misura del progresso di crescita. In questo esempio foglie da piante coltivate sotto la "luce solare" dopo 8, 10 e 12 giorni dopo la semina, rispettivamente, sono stati pesati. Valutazione statistica di questi dati può essere visto nella Figura 7. Come previsto, il peso fresco aumenta con il tempo.

Oltre di peso fresco, la zona di foglia è una buona misura per la crescita. Qui, lo sviluppo della pianta è stato seguito da 10, 13 e 17 giorni dopo la semina (Figura 8A). Almeno sei diverse piante sono stati valutati ordinariamente per ottenere dati statistici affidabili. Per dimostrare l'importanza di un campione di elevate dimensioni, è stato calcolato l'errore percentuale del valore medio, analizzando due e sei piante, rispettivamente, (Figura 8B). Ciò significa che è stata determinata la percentuale della deviazione standard per quanto riguarda il valore medio. È molto chiaro che, in caso di un campione di piccole dimensioni, l'errore è 5-10% superiore nel caso di una maggiore dimensione del campione. Aumentando il numero di piante che vengono valutate, l'errore può essere minimizzato, che rende l'interpretazione dei dati molto più chiari.

Figura 1: diverse qualità di luce sono forniti da LED. A) Screenshot dal pannello di controllo della camera del LED. Lunghezza del giorno è fissata a 16 h (in alto a destra) e l'intensità della luce è impostata su 200 µmol cm-2 s-1. La qualità della luce è diversa su tutti i quattro livelli: 1.1 rappresenta uno spettro simile alla luce del sole come tecnicamente possibili, 1.2 rappresenta un'alta percentuale di rosso e blu lunghezze d'onda (RB) luce, 2.1 è prevalentemente impostata a blu (B), 2,2 rappresenta principalmente rosso luce (R). B) il pannello centrale mostra una panoramica di tutti i livelli; i pannelli esterni mostrano i singoli livelli in un alto livello di zoom. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: spettro di lunghezza d'onda da impostazioni di luce solare simulata. Viene mostrato uno screenshot dello spettrometro insito nella camera di LED, che è stato posizionato a livello 1.1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: impianto di sviluppo più di una settimana. Rappresentante a. thaliana piante da tutte le quattro condizioni di luce da 10, 13 e 17 DAS. Piante sono stati fotografati con una macchina fotografica reflex digitale su un treppiede. Barra della scala rappresenta 1 cm per tutte le immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Screenshots da passaggi rappresentativi delle misurazioni di PAM di piante di a. thaliana . A) Screenshot dalla visualizzazione "Live video" dove può essere regolato il fuoco immagine. B) rendimento corrente fluorescenza Ft prima dell'applicazione di eventuali impulsi di luce. C) rendimento corrente fluorescenza Ft dopo l'impostazione di FM Fo /. D) rendimento quantico che effettuano PSII dopo aver impostato un impulso di luce saturante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: rappresentazione grafica del rendimento quantico che effettuano PSII (YII). A) dati da 12, 21 e 28 giorni dopo la semina di piante e coltivati sotto 200 µmol/cm2/s1 sotto luce solare simulata ("luce solare") sottoposti ad analisi di PAM sono stati valutati statisticamente. Vengono mostrati i valori medi di cinque piante e cinque AOIs al giorno. Un asterisco indica una differenza significativa con un valore p < 0,05 rispetto al giorno 12 e due asterischi indicano differenze molto significative con un p-value < 0.02 secondo t-test degli studenti. B) dati da piante coltivate a 200 µmol/cm 2/s1 sotto luce solare simulata (SL), arricchita blue (B) o rosso (R) luce, rispettivamente, sono stati valutati statisticamente. Vengono mostrati i valori medi di cinque piante e cinque AOIs al giorno. Differenze significative sono state calcolate rispetto a "luce del sole."

Figura 6: immagine rappresentativa di stomi a fianco di una foglia di a. thaliana abbagliai. Foglie preparato come descritto sopra e sono stati analizzati visivamente sotto un microscopio chiaro con impostazioni di DIC a 40 ingrandimenti. Gli stomi sono contati nell'area visibile di almeno 4 foglie per condizione. La foto è stata scattata con una videocamera digitale collegata al microscopio tubus. Il numero di stomi per mm ² è calcolato con l'aiuto della barra della scala. Stelle indicano una stomia singola. La barra della scala rappresenta 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: rappresentazione grafica di peso fresco da a. thaliana piante coltivate presso simulato del sole/200 µmol/cm2/s1. Rosetta di foglie sono stati tagliati da piante, otto, dieci e dodici giorni dopo la semina. Sono rappresentati i valori medi in mg da sei piante al giorno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Valutazione statistica della superficie fogliare di a. thaliana da piante coltivate in condizioni di luce diverse. A) area fogliare da a. thaliana coltivata per 10, 13 e 17 giorni è stata determinata graficamente con ImageJ e dati da n = 6 piante sono stati valutati statisticamente. L'area di foglia da tutte le sei rosette da ogni condizione è stata riassunta e divisa da sei per ottenere il valore medio. Con questo valore, è stata calcolata la deviazione standard, e questo è rappresentato da barre di errore. B) area fogliare graficamente è stata determinata con ImageJ e dati da entrambi n = 2 o n = 6 stabilimenti, rispettivamente, sono stati analizzati statisticamente come descritto per il pannello A. Quindi l'errore in percentuale del valore medio è stato calcolato e rappresentato graficamente. Barre verdi indicano la percentuale di errore dall'analisi di n = 6, blu bar da n = 2 piante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.