L'obiettivo del protocollo è quello di costruire un modello di infiammatorio gengiva umana in vitro. Questo modello di tessuto Co-coltiva tre tipi di cellule umane, keratinocytes di HaCaT, fibroblasti gengivali e macrofagi THP-1, in condizioni tridimensionali. Questo modello può essere applicato a indagare le malattie parodontali, quali gengivite e parodontite.
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Articolo metodologico
Equivalenti di tessuto umano infiammatorio tridimensionale del Gingiva
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le malattie parodontali (come gengivite e parodontite) sono le principali cause di perdita dei denti negli adulti. L'infiammazione nella gengiva è fondamentale fisiopatologia delle malattie parodontali. Attuali modelli sperimentali di malattie parodontali sono stati stabiliti in vari tipi di animali. Tuttavia, la fisiopatologia dei modelli animali è diversa da quella degli esseri umani, rendendo difficile per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari e valutare nuovi farmaci per malattie parodontali. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la ricostruzione di equivalenti di tessuto infiammatorio umano della gengiva (iGTE) in vitro. Costruiamo prima equivalenti di tessuto umano della gengiva (GTE) utilizzando due tipi di cellule umane, tra cui fibroblasti gengivali umani (HGF) e cheratinociti epidermici della pelle umana (HaCaT), in condizioni tridimensionali. Creiamo un modello di ferita utilizzando un perforatore di tessuto per fare un buco nel GTE. Prossimi, umani monociti THP-1 mescolati con gel di collagene sono iniettati nel foro il GTE. Da adimistration di 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) per 72 h, cellule THP-1 differenziano nei macrofagi di focolai infiammatori forma in GTE (iGTE) (IGTE inoltre può essere stumilated con 2 µ g/mL di lipopolisaccaridi (LPS) per 48 h avviare l'infiammazione ). IGTE è il primo modello in vitro di gengiva infiammatoria utilizzando cellule umane con un'architettura tridimensionale. IGTE riflette le modifiche patologiche principali (activition immunociti, interazioni intracellulari tra fibryoblasts, cellule epiteliali, monociti e macrofagi) a malattie parodontali. GTE, GTE feriti e iGTE utilizzabile come versatile di strumenti per studiare la guarigione della ferita, rigenerazione tissutale, infiammazione, interazione cellula-cellula e potenziali farmaci schermo per malattie parodontali.
Introduzione
Le malattie parodontali sono la principale causa di perdita dei denti negli adulti. Gengivite e parodontite sono le più comuni malattie parodontali. Entrambi presenti alterazioni infiammatorie acute o croniche biofilm-mediata nella gengiva. Gengivite è caratterizzata da infiammazione acuta, considerando che la parodontite si presenta solitamente come l'infiammazione cronica. A livello istologico, componenti batteriche innescano l'attivazione di cellule immunitarie, come i macrofagi, linfociti, plasmacellule e mastociti1,2. Queste cellule immuni, soprattutto macrofagi, interagiscono con le cellule locali (tra c....
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Protocollo
Questo protocollo è progettato per creare equivalenti di tessuto gengivale umano, ferita gengivale modelli e modelli di gengivite. Pelle umana cheratinociti (HaCaT) sono state gentilmente concesse da professore Norbert E. Fusenig di Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Germania)7. Fibroblasti gengivali umani (HGFs) sono stati isolati dai tessuti gengivali secondo i protocolli precedentemente pubblicati8. Il consenso informato è stato ottenuto in anticipo, e lo studio è stato approvato secondo le linee guida fissano dal comitato etico, la Nippon Dental University School of Life Dentistry presso Tokyo (numero di a....
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Risultati
Le cellule HaCaT visualizzato morfologia tipica del keratinocyte sotto osservazione al microscopio di contrasto di fase (Figura 2A). Immagini di scanner elettrone microscopiche (SEM) ha mostrato che le superfici delle cellule HaCaT erano coperti da molti microvilli. Intercellulare connessioni tra le cellule HaCaT sono state mediate da processi a membrana (Figura 2B). Le cellule HaCaT espresso epitelio gingival marcatore K8/18
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Discussione
Questo protocollo è basato su metodi di creazione di tessuto gengivale equivalenti ed equivalenti di tessuto adiposo sottocutanei descritti da precedenti rapporti8,21,22. Anche se si tratta di un metodo semplice e facile, alcuni passaggi richiedono particolare attenzione. Ad esempio, la miscela di collagene dovrebbe essere tenuta su ghiaccio fino all'utilizzo per evitare la formazione di un gel nella soluzione. Quando si aggiung.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte dalla Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) sovvenzione per la ricerca scientifica (26861689 e 17 K 11813). Gli autori vorrei ringraziare Mr. Nathaniel Green per la correzione di bozze.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Collagene tipo I-A | Nitta Gelatin Inc | Per la produzione di derma di GTE | |
| MEM-alfa | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Inserto per colture cellulari medie |
| (per piastra a 24 pozzetti), dimensione dei pori 3,0 &; m | Corning, Inc. | 353096 | Per la coltura dei tessuti |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Reagente per colture cellulari |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Terreno per colture cellulari |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Reagente per colture cellulari |
| Perforatore per tessuti | Shibata system service co., LTD | SP-703 | Per fori di punzonatura in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Terreno di coltura cellulare |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | Per l'immunocolorazione |
| Hoechst 33342 (colorazione NucBlue Live Cell) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | Per la marcatura di nuclei |
| Terreno di montaggio a fluorescenza | Dako | Per il montaggio di campioni dopo l'immunocolorazione | |
| Anticorpo anti-citocheratina 8+18 [5D3] | abcam | ab17139 | Per l'identificazione dell'epitelio |
| Microscopio elettronico a scansione | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | Per l'osservazione della superficie, della topografia e della composizione dei campioni |
| Microscopia confocale a scansione laser | LSM 700; Fornitore verificato - Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | Per l'osservazione della colorazione in immunofluorescenza dei campioni Anticorpo |
| anti-citocheratina 19 abcam | ab52625 | Per l'identificazione dell'epitelio | |
| Anticorpo anti-vimentina | abcam | ab92547 | Per l'identificazione di fibroblasti e macrofagi attivati |
| Anticorpo anti-TE-7 | Millipore | CBL271 | Per l'identificazione di fibroblasti nel derma |
| Anti-CD68 anticorpo | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | Per l'identificazione dei macrofagi |
| Anticorpo CD14 umano | R& D Systems | MAB3832-SP | Per l'identificazione dei macrofagi |
| Alexa Fluor 594-coniugato anticorpo secondario di capra anti-coniglio | Thermo Fisher Scientific | A11012 | Per la colorazione in immunofluorescenza |
| Alexa Fluor 488-coniugato anticorpo secondario di capra anti-topo | Thermo Fisher Scientific | A11001 | Per la colorazione in immunofluorescenza |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | Per osservare l'immunofluorescenza del campione, colorare le | |
| cellule THP-1 | di cellule Riken BRC | RCB1189 | Per produrre iGTE |
| PMA (Phorbol 12-miristate 13-acetato) | Sigma-Aldrich | P8139 | Per differenziare le cellule THP-1 |
Riferimenti
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases a....
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Ristampe e permessi
