La planaria planarie mediterranea è un eccellente modello per studiare le cellule staminali e rigenerazione dei tessuti. Questa pubblicazione descrive un metodo per rimuovere selettivamente un solo organo, la faringe, esponendo gli animali per la chimica sodio azide. Questo protocollo delinea anche metodi per il monitoraggio di rigenerazione della faringe.
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Articolo metodologico
Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea
In questo articolo
Sommario
Abstract
Planarie sono vermi piatti che sono estremamente efficienti in rigenerazione. Devono questa capacità di un gran numero di cellule staminali che possono rispondere rapidamente a qualsiasi tipo di ferita. Modelli di lesione comune in questi animali rimuovono grandi quantità di tessuto, che danneggia gli organi multipli. Per superare questo danno di tessuto ampio, descriviamo qui un metodo per rimuovere in modo selettivo un singolo organo, la faringe, in Planaria planarie mediterranea. Raggiungiamo questo dagli animali ammollo in una soluzione contenente l'azoturo di sodio inibitore dell'ossidasi del citocromo. Breve esposizione al sodio azide provoca estrusione della faringe dall'animale, che noi chiamiamo "amputazione chimica." Amputazione chimica rimuove l'intera faringe e genera una piccola ferita, dove la faringe si attacca all'intestino. Dopo il risciacquo vasto, tutti gli animali amputati rigenerano una faringe completamente funzionale in circa una settimana. Cellule staminali nel resto del corpo di auto rigenerazione della faringe nuova. Qui, forniamo un dettagliato protocollo per amputazione chimica e descrivere i metodi sia istologici e comportamentali per valutare il successo amputazione e rigenerazione.
Introduzione
La rigenerazione è un fenomeno che si verifica in tutto il Regno animale, con capacità rigenerative che vanno dalla rigenerazione di corpo pieno in alcuni invertebrati a più limitate capacità in vertebrati1. Sostituzione dei tessuti funzionali è un processo complesso e spesso comporta il ripristino simultaneo di più tipi di cellule. Ad esempio, per rigenerare l'arto di Salamandra, osteoblasti, condrociti, neuroni, muscoli e cellule epiteliali c'è bisogno di essere sostituito2. Questi tipi di cellule appena generato anche bisogno di essere organizzato correttamente per facilitare la nuova funzione dell'arto. Comprensione ....
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Protocollo
1. preparazione
-
Preparazione di acqua planaria 17
- Mantenere planarie in una soluzione di sale di X Montjuïc 1. Per preparare l'acqua Planaria, rendere singole soluzioni di riserva di 1m CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1m KCl e 5 M di NaCl in acqua ultrapura. Filtro-sterilizzare con una conservazione a lungo termine del filterfor parte superiore della bottiglia di 0,2 µm.
Nota: Utilizzare solo acqua deionizzata ultrapura (con una resistività di 18,2 MΩ a 25 ° C) per preparare Montjuïc sali. - Per preparare un brodo di 1 L di soluzione di sale X 5, combi....
- Mantenere planarie in una soluzione di sale di X Montjuïc 1. Per preparare l'acqua Planaria, rendere singole soluzioni di riserva di 1m CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1m KCl e 5 M di NaCl in acqua ultrapura. Filtro-sterilizzare con una conservazione a lungo termine del filterfor parte superiore della bottiglia di 0,2 µm.
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Risultati
L'esposizione al sodio azide sconvolge la normale motilità delle planarie, causando gli animali ad allungare e si contorcono. Questi movimenti forzare la faringe ad emergere dal lato ventrale dell'animale, e dopo circa 6 min in soluzione di sodio azide, la punta bianca della faringe può essere visto (Figura 1B-pannello di sinistra). Pochi minuti dopo, animali attivamente contraggono ed estendono completamente la faringe spingendolo con forza .......
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Discussione
Questo protocollo descrive un metodo di ablazione selettiva della faringe utilizzando sodio azide. Altri studi di ablazione mirati in planarie hanno utilizzato modificata chirurgia per rimuovere fotorecettori21 o trattamento farmacologico per l'ablazione di neuroni dopaminergici22. Un vantaggio significativo di amputazione chimico rispetto ai metodi esistenti è che non richiede intervento chirurgico. La struttura rigida della faringe rispetto al resto del corpo Planaria fac.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Alejandro Sánchez Alvarado, che hanno sostenuto l'ottimizzazione iniziale e lo sviluppo di questa tecnica. Lavoro in laboratorio di Carolyn Adler è sostenuta da fondi di Start-up di Cornell University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di calcio diidrato (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuï c soluzione salina |
| Solfato di magnesio anidro (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuï c soluzione salina |
| Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuï c soluzione salina |
| Cloruro di potassio (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuï c soluzione salina |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuï c soluzione salina |
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuï soluzione di sale c |
| Copolimero di polipropilene autoclavabile Nalgene lowboy con rubinetto | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Conservazione dell'acqua planaria |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands Amazon | Acqua di planaria | |
| Gentamicina Solfato | Gemini Bio-prodotti | 400-100P | Acqua di planaria |
| Lame di rasoio | Microscopia elettronica Scienze | 71970 | Tritare il fegato |
| Sacchetti da pasticceria monouso-16", confezione da 12 | aliquote di fegato | Wilton | Amazon |
| Siringhe da 5 mL BD | /VWR | 309647 | Aliquote di fegato |
| Piastre di Petri-35 mm/60 mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Contenitori di plastica (varie dimensioni) | Ziploc | Amazon | Alloggiamento planarie in coltura statica |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Pipetta di trasferimento | Globe Scientific | 138030 | |
| Pinze - Pinzetta Dumont, Stile 5 | Microscopia elettronica Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidina, Alexa Fluor 488 coniugato | ThermoFisher | S11223 | |
| Glicerolo | Fisher BioReagenti | BP229-1 |
Riferimenti
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M.
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Ristampe e permessi
